유사 분열 동안 염색체 분리의 라이브 셀 이미징

요약

이 프로토콜 레이블 및 라이브 염색체 mitotic 세포 Histone2B GFP BacMam 2.0 레이블 및 회전 디스크 confocal 현미경 시스템을 사용 하 여 시각화 하는 간단 하 고 편리한 방법을 설명 합니다.

초록

염색체 해야 안정적이 고 균일 하 게 분리 되어 딸 세포에 mitotic 세포 분열 동안. 염색체 분리의 충실도 스핀 들 어셈블리 검사점 (SAC)을 포함 하는 여러 메커니즘을 통해 제어 됩니다. SAC 모든 염색체 kinetochores microtubules 스핀 들에 첨부 하지 않으면 세포 유사 분열 진행의 예방에 대 한 책임은 복잡 한 피드백 시스템의 일부입니다. 염색체 지체 및 비정상적인 염색체 분리 역 기능 세포 주기 통제 검문소의 표시기 이며 셀 분할의 게놈 안정성을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다. SAC의 규제 완화는 염색체 분리 중 오류의 축적을 통해 악성 세포로 정상 세포의 변화에 발생할 수 있습니다. SAC의 구현 및 복잡 한 kinetochore의 형성 단단히 kinases와 단백질 인산 가수분해 효소 2A 등 인산 가수분해 효소 사이 상호 작용에 의해 규제 됩니다 (PP2A). 이 프로토콜 마우스 미 발달 섬유 아 세포 했다 PP2A B56γ 규제 소 단위의 녹아웃 쥐에서 고립에서 염색체를 후행의 라이브 셀 이미징을 설명 합니다. 이 방법은 다른 세포 주기 제어 이미징 기술 cytometry 또는 immunocytochemistry 같은 염색체의 동적 spatiotemporal 시각화 대신 셀 cytokinesis 상태 스냅숏을 제공의 단점을 극복 동안 유사 분열.

서문

다음 프로토콜에서 우리 염색체 분리 및 마우스 미 발달 섬유 아 세포 히스톤 2B-GFP, BacMam 2.0 라벨 및 라이브 셀 이미징 사용 하 여에서 세포 주기 동안 mitotic 진행을 시각화 하는 편리한 방법을 설명 합니다.

세포 주기 통제 검문소 염색체 분리를 모니터링 하 고 셀 ^1,2,3의 유전 무결성의 유지 관리에 중요 한 역할. 미 분리 된 염색체의 이수성, 가장 단단한 종양 ⁴의 특징은 발생할 수 있습니다. 따라서, 후행 염색체의 염색체 불안정성을 공부 하는 방법으로 사용할 수 있습니다.

붙일 표시 또는 라이브 염색체 분리를 시각화 하는 데 사용 하 고 mCherry 태그의 생성 하지만 후행 염색체 단백질 수 태그 H2B GFP 단백질 유전자 전달 및 분자 생물학 ⁵의 상당한 지식이 필요 합니다. 여기는 CL-HB는 리 젠 트, 편의 위해이 전화 CellLight Histone2B GFP BacMam 2.0 시 약의 사용에 설명 합니다. 이 시는 즉시 사용할 수 있습니다 하 고 따라서 벡터 품질 및 무결성에 대 한 우려를 제거 합니다. 또한,이 시는 잠재적으로 유해한 치료 또는 지질 및 염료 선적 화학 물질의 사용을 필요 하지 않습니다. 기존의 형광 라벨, 달리 CL-HB 리 젠 트 기능에 독립적으로 얼룩 (즉., 막 잠재력). CL HB 리 젠 트를 단순히 셀에 추가 하 고 단백질 식 밤새 껏 알을 품 수 수 있습니다. CL HB 섭정 포유류 세포에서 복제 하지 않습니다 그리고 biosafety 수준 (BSL) 1 실험실 설정에서 사용할 수 있습니다. 또한, 가장 역동적인 세포 분석을 수행 하 후 최대 5 일까지 충분 한 시간 동안 야간 보육이 과도 transfection은 감지할 수 있습니다.

또는, 염색체 이상이 cytometry, immunohistochemistry 또는 형광 제자리 교 잡 (물고기) ⁶등 다양 한 기법에 의해 공부 될 수 있었다. Cytometry는 이수성, 측정 될 수 있는 DNA 콘텐츠 및 세포 주기 세포의 단계에 따라 공부를 사용할 수 있습니다. Cytometry 이수성을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다, 하지만 그것은 염색체 미 분리에 정보를 제공 하지 않습니다. 물고기와 immunohistochemistry 기술 DNA 또는 염색체에 바인딩할 형광 프로브를 사용 합니다. 이러한 기술은 세포의 인구 상태 스냅숏을 제공, 그들은 라이브 셀 이미징 함으로써 특정 셀 시간의 기간 동안 다음에 cytokinesis spatiotemporal 시각화를 통해 얻은 정보를 누락을 허용 하지 않습니다.

이 프로토콜은 지체 염색체 또는 염색체 미 분리 취급 하는 nocodazole 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)에 PP2A-B56γ-마우스에서 분리 연구 하 사용 되었다. 응용 프로그램 위에 이외에,이 프로토콜 레이블 및 세포 주기 규칙을 공부 하는 데 사용할 수 있는 다양 한 셀 형식에 염색체 분리 또는 종양 세포의 염색체 불안정을 시각화 하는 간단한 도구를 제공 합니다. 또한, 그것은 또한 사용할 수 있습니다 다양 한 약물 치료에 의해 발생 하는 염색체 불안정을 공부 하거나 유전자 염색체 미 분리의 결과로 밖으로 노크의 효과 연구.

프로토콜

이러한 연구에서 실시 한 모든 실험 프로토콜 식품 및 의약품 안전 청 (FDA) 연구 시설에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인에 따라 수행 했다.

1. 격리와 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)의 문화

1. 표준 프로토콜 ^7,,89마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs) PP2A-B56γ-마우스 긴장과 야생 타입 littermates에서를 격리 합니다.
2. ExpandMEFs 3 구절에 대 한 동결 하 고 실험 ⁸필요할 때까지 저장 합니다.

2. 2-잘 연 발된 커버 유리에 대 한 자란 Mefs 라이브 영상

1. MEF 성장 미디어 Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM/F12)를 포함 하는 10%의 500 mL를 준비 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1 X 페니실린/스 항생제, L-글루타민 (200 m m) 및 비 본질적인 아미노산 (NEAA) 500 mL 미디어 병에서 X 1.
2. 37 ° c.에 미리 데워 진된 물 욕조에 통로 3에서 야생 타입에서 냉동된 MEFs와 PP2A-B56γ-생쥐의 병 동
3. 전송 15 mL 튜브에 MEFs를 해 동 하 고 천천히 10 mL 피 펫을 사용 하 여 15 mL 튜브에 DMEM/F12 미디어의 dropwise 20 mL를 추가 합니다.
4. T75 플라스 크에서 DMEM/F12 성장 매체의 20 mL와 함께 MEFs를 전송 하 고 셀 70% 합칠 때까지 그들을 확장 합니다. Confluency 4 x 또는 10 x 배율에서 역 현미경을 사용 하 여 추정 된다.
5. Aspirate 유리 방목 지를 사용 하 여 성장 매체 후드에 진공 시스템에 부착 된 플라스틱, 0.25 %trypsin / EDTA의 3 mL를 추가 하 고 반응을 중지 DMEM/F12 성장 매체의 5 분 추가 3 ml 37 ° C에서 품 어.
6. 낮은 속도 (300 x g) 실 온에서 5 분 동안에 세포 원심 조심 스럽게는 상쾌한을 제거 하 고 다시 물 욕조에 37 ° C에 미리 데워 DMEM/F12 성장 매체의 1 mL에 셀 펠 릿을 중단.
7. Trypan 블루 제외 방법 또는 다른 적절 한 셀 계산 방법 ⁸을 사용 하 여 셀을 열거 합니다.
8. 2-잘 연 발된 커버 유리에 MEFs/잘 씨 약 20000. 200 µ L/잘 DMEM/F12 성장 매체를 추가 하 고 37 ° C, 5% CO₂에서 그들을 하룻밤 배양 하 여 연결할 셀을 허용.

3입니다. 동기화

1. DMEM/F12 성장 미디어 0.1%를 포함 하는 세포를 배양 하 여 G0/G1 단계에서 MEFs를 동기화 G0/G1 단계에서 최대 셀 수를 24 h, FBS.
   참고: 지금까지 혈 청 기아는 기본 설정의 방법으로 사용 되었다, 비록에 다양 한 다른 방법 mitotic 무대 체포 ¹⁰을 셀 필요에 따라 사용할 수 있습니다.

4. 라벨

1. 1.5 m g/mL DMSO에 nocodazole의 재고 솔루션을 준비 합니다. Nocodazole는 microtubule 형성 ¹⁰을 억제 하 여 G2/M 단계에서 셀을 체포.
2. 3 일 게시물 동기화, 추가 200 µ L (10 %FCS)와 성장 매체의, 200 ng/mL nocodazole와 CL-HB 리 젠 트 (히스톤 2B GFP BacMam 2.0).
3. CL HB 리 젠 트 입자 당 셀 (PPC) 셀에 다음과 같이 추가를 계산 합니다.
   
   셀 수 라벨의 시간에서 셀의 예상된 총 수는, PPC는, 세포 당 입자의 수 그리고 1 × 10⁸ 시의 mL 당 입자의 수입니다. 예를 들어 30의 PPC와 레이블 20000 셀에
   
   참고: CL-HB 섭정은 대부분 세포 유형 10, 50 PPC 사이 잘 작동합니다. 그러나, 30 PPC이이 연구를 위해 잘 일했다.
4. 37 ° C, 5% CO₂18 h에 대 한 MEFs를 품 어.
   참고: 현재 실험에 대 한 스핀 들 어셈블리 검사점 탈출 mitotic 세포에서 염색체의 시각화 발생 18 h nocodazole와 세포 주기 검거 후.

5입니다. 염색체 후행의 시각화

1. 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)는 환경 챔버와 기름 침수, 63 x 렌즈 회전 디스크 confocal 현미경 시스템을 사용 하 여 시각화.
   1. 488 nm 및 방출 파장 450 nm의 여기 파장을 사용 하 여 GFP 채널 이미지 수집에 대 한.
   2. 회전 디스크 confocal 현미경 시스템을 사용 하 여 자동화 된 스캐닝 단계 기능, Z 피 삽입, 무대 상단 부 화 및 사진이이 기술에 대 한 표백 후 직접 형광 복구.
2. 이미징, 전에 1 일 환경 챔버 전원 켜기 하 고 37 ° C에서 전체 챔버를 밤새 따뜻하게.
3. 현미경 스탠드, 카메라, 회전 디스크 장치, 조명 기, 아르곤 레이저, 컴퓨터와 자동화 된 단계에 대 한 전원 ON을 설정 합니다.
4. 시스템을 워밍업 3 분; 점화 키를 켜면 아르곤 레이저를 시작 합니다. "레이저 실행" "대기 모드"에서 아르곤 레이저에 대 한 토글 스위치를 전환 합니다.
5. 데이터 수집 및 처리 소프트웨어를 시작 합니다.
6. 무대 최고의 보육에 대 한 CO₂ 컨트롤러를 시작 하 고 5% CO₂ 의 농도 설정. 이 영상의 시작 하기 전에 수행 되어야 합니다.
7. 시각화를 위한 무대에 인큐베이터와 장소에서 연 발된 커버 유리를 제거 합니다. 시각화는 기름 침수 63 x 렌즈 (NA1.4)를 통해 셀.
8. 눈 렌즈를 통해 서 봅니다, 그리고 이미지 초점 고 핵 붕괴 (NEBD) 단계에서 셀을 식별 합니다.
9. 적절 한 레이저 (Histone2B-GFP를 시각화 하기 위해 488 nm 아르곤 레이저)를 시작 합니다.
10. 수집 제어 창을 열고 GFP 채널에 대 한 노출 시간을 설정 합니다. NEBD에 있는 셀을 식별 합니다.
    1. 수동으로 대상 셀의 위쪽 및 아래쪽 초점면, 결정 하 고 설정 단면 광학 xyz를 입력 합니다.
    2. 20 분;에 대 한 관찰 세포는 세포 분열을 통해 진행 되지 않습니다, 만약 20 분 후 이미지 수집을 중지 하 고 NEBD에 있는 다음 셀으로 이동.
11. 셀 당 약 1 h는 SAC에서 탈출 하는 PP2A-B56γ-셀에 유사 분열 동안 이미지 지체 염색체에 필요 합니다. 영화에 대 한 데이터를 얻기 위해 모든 3 분 사진을 찍을.
    참고: 야생 타입 셀 체포 하 고 NEBD nocodazole로 치료 하면 과거 진행 하지 않습니다.
12. 추가 분석을 위해 zvi 파일 형태로 이미지를 저장 합니다.

6. 이미지 처리 및 분석

참고: 3 차원 영상 처리 및 Axiovision 버전 4.8.2 또는 Imaris 버전 8.2와 같은 사용 가능한 소프트웨어를 사용 하 여 분석을 수행 합니다. 이 연구는 ImageJ 소프트웨어 사용 되었습니다.

1. 이미지 시퀀스를 엽니다. 이미지는 이미 스택 형식에서, 경우 다음 단계를 진행 합니다. 그렇지 않으면, 모든 관련 이미지를 결합 하 여 사용 하 여 스택 ' 이미지 > 스택 > 스택 이미지 ' 메뉴 막대에서.
2. 밝기/명암 대비와 레벨에 필요한 어떤 조정 든 지를 수행 합니다.
3. 영화 타임 스탬프를 추가:
   1. 로 이동 ' 이미지 > 스택 > 레이블...' 메뉴 막대에서.
   2. 적절 한 형식, 시작 시간 값 및 각 이미지 사이의 시간 간격을 선택 합니다.
   3. '미리 보기' 확인란을 선택 하 고 위치 및 형식 설정을 조정 합니다. 타임 스탬프를 적용 하려면 ' 확인'을 누릅니다.
4. 영화에 눈금 막대를 추가할:
   1. 이미지에서 스케일링을 설정 ' 분석 > 비율 설정 ' 메뉴 막대에서.
   2. '픽셀에서 거리' 분야에서 거리는 알려져 픽셀 수를 입력 하 고 '알려진 거리' 분야에서 거리를 입력 합니다. µ M. 스택에 눈금을 적용 하려면 ' 확인'을 누르십시오 예를 들어, 거리에 대 한 길이 올바른 단위를 설정 합니다.
   3. 로 이동 ' 분석 > 도구 > 배율... ' 눈금 막대를 추가 하려면. µ M에 '폭'로 바의 크기를 설정 하 고 나머지 적절 한 옵션을 서식 조정 합니다. 눈금 막대에 전체 스택을 추가 하려면 '모든 조각을 라벨' 상자를 확인 하십시오.
5. 이미지 창의 가장자리를 왼쪽 하단에 삼각형 플레이 버튼을 클릭 하 여 동영상을 미리 보기. 사용 하 여 프레임 속도 조정 ' 이미지 > 스택 > 애니메이션 > 애니메이션 옵션 ' 메뉴 막대에서.
6. 선택 하 여 동영상 파일을 내보내기 ' 파일 > 다른 이름으로 저장 > AVI...' 하 고 프레임 속도 및 압축을 선택 합니다.
7. '확인' 선택 저장을 누릅니다 위치와 파일 이름. 동영상 파일을 저장 하려면 ' 저장' 키를 누릅니다.

결과

야생 유형 및 PP2A-B56γ-마우스에서 MEFs 2-잘 챔버 커버 유리에 시드 되었고 첨부할 수 있습니다. 하루에 2, MEFs는 0.1%를 사용 하 여 동기화 했다 FBS 24 h에 대 한. 하루 3, MEFs 미디어에서 200 ng/mL에 nocodazole 및 30 PPC CL-HB regentwere 37에서 18 h incubated^{° C, 5 %CO}₂. 하루에 4, 셀은 회전 디스크 confocal 현미경 시스템 (그림 1)를 사용 하 여 몇 군데 있었?...

토론

정확한 염색체 분리를 보장 하는 세포 주기 통제 검문소 방지 이수성 및 셀 변환 ^1,2,3. 현재 연구에서 우리는 PP2A B56γ의 그 비활성화 발견 약화 스핀 들 어셈블리 검사점 귀착되 었 다. 라이브 셀 이미징을 사용 하 여 nocodazole ⁹PP2A B56γ MEFs 유사 분열 동안 염색체 미 분리 처리를 관찰할 수 있었습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Gibco	11320082
L-Glutamine	Gibco	25030081
MEM Non-Essential amino acids solution (100X)	Gibco	11140050
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Dulbecco’s Phosphate Buffered saline	Gibco	14190144
Trypsin-EDTA	Gibco	25300054
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
DMSO	EMD Millipore	MX 1458-6
Cryogenic vial storage boxes	Fisherbrand	10-500-28
Cryogenic vials	Corning/costar	431416
T75 flasks	Cellstar	658175
2 well chambered cover glass	Nunc	155380PK
Cellometer Vision Cell Profiler	Nexcelom Bioscience LLC	Cellometer Vision Trio
Nocodazole	Sigma	M1404
CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher Scientific Inc.	C10594
Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system	Carl Zeiss Microscopy	Zeiss Cell Observer SD
Water Bath	Thermoscientific	280 series
Incubator	Sanyo commercial solutions	MCO-18AIC (UV)
Class II Biological safety cabinet	The Baker Company	SterilGard
Axiovision software	Zeiss	Ver.4.8.2
ImageJ software	National Institute of Health	Ver. 1.51r