라이브 창 꼬마 선 충 에 Lysosomal Alkalinization 평가

요약

C. 선 충 pH에 민감한 중요 한 염료 5 (6)-카-를 사용 하 여 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)의 소장에 lysosomal 산의 손실을 조사 하는 단계별 가이드

초록

선 충 류 꼬마 선 충 (C. 선 충) 널리 장 수 및 발달 경로 연구 하는 데 사용 되는 모델 시스템입니다. 이러한 연구는 동물, 앞으로 고 역 유전자 분석, 붙일 레이블된 생성 단백질의 상대적 용이성 및 초기에 microinjected도 수 형광 염료의 사용 능력의 투명도 의해 촉진 된다 배아 세포 세포 (예 9-diethylamino-5 H-benzo (a) phenoxazine-5-1 및 (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-를 그것의 음식 (E. 콜라이 긴장 OP50)에 법인 또는 [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron)입니다. 여기, 선물이 장 리소좀 얼룩 형광 pH에 민감한 염료를 사용 하 여 라이브 벌레에 lysosomal 산에서 동적, 생리 적 변화를 영상 판독을 제공. 이 프로토콜 lysosomal pH를 측정 하지 않습니다 하지만 오히려 lysosomal 산 성도에 관련 된 생리 적 변화를 평가 하는 신뢰할 수 있는 방법을 설정 하는 것을 목표로. cDCFDA는 형광 fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) 가수분해 시 세포내 esterases 변환 되는 셀 permeant 화합물 이다. 리소좀 안에 Protonation cDCF 어디 축적이 세포에서 트랩 합니다. 4.8의 그것의 낮은 pKa 때문이 염료는 효 모에는 pH 센서로 사용 되었습니다. 여기에 장 리소좀의 산도 평가 하기 위해 음식 보충으로 cDCFDA 사용 하 여 설명 C. 선 충. 이 기술은 살아있는 동물, alkalinizing 리소좀의 검출에 대 한 허용 하 고 노화와 autophagy, lysosomal 속에 대 한 연구를 포함 하는 실험적인 응용 프로그램의 광범위 한 범위를 하고있다.

서문

단백질의 외관은 진 핵 세포^1,2,3, 그리고 대형의 생각 된다 세포 노화⁴ 의 원리 드라이버 중에 노화의 각 인 될 널리 허용 ^{, 5 , 6 , 7}. 나이, 세포로 단백질 놓을 장애인, 단백질 집계에 증가로 이어지는 성장 증거가 있다. 세포 노화에 베이스의 붕괴 autophagy⁸ 프로테아좀 중재 단백질 저하⁹의 장애를 포함 한다. 마지막으로, 돌이킬 수 없는 단백질 산화 단백질 놓을¹⁰더 혼란, 오래 된 세포에서 증가 된다.

Autophagy 처음 손상 된 단백질의 대량 저하에 대 한 비 선택 과정이 될 생각 하지만 최근 연구 결과 그 autophagy는 단백질 집계 되지 않은 역 기능 세포의 놓을에 매우 선택적 표명 의무가 다른 단백질 정리 메커니즘¹¹통해 저하. Autophagy 과정에서 손상 되 고 집계 된 단백질은 autophagosome 라는 이중 막 소포에 격리 됩니다. 이 autophagosome 다음 리소좀, 라는 산 성 세포와 autophagosome 화물¹²의 저하에 이르게 퓨즈. Lysosomes autophagic 통로의 끝점을 나타내는 고 막 수리, transcriptional 제어 및 영양소 감지; 같은 다른 세포질 과정에 참여 세포질 항상성 (참고 13에서 검토 한 결과)에 그들의 중앙된 역할을 강조 합니다. 여러 연구 lysosomal 함수에는 연령에 따라 감소와 다양 한 신경 장애¹³사이 연결 표시. 일관 되 게, 이전 셀에 lysosomal 기능을 복원 노화 관련 고기^14,15의 발병을 지연 수 있습니다. Intralumen 환경 구성의 연구 이전 셀에 lysosomal 기능의 붕괴 lysosomal 프로 테아 제¹⁶의 생산에 있는 감소 때문에 하지는 것이 좋습니다. 또는, intralysosomal 산, 그것의 효소 활동의 중요 한 요구의 손실 리소좀 중재 베이스¹⁷드롭 기초 수 있습니다 제안 되었습니다. 이 가설을 찾아보기 수 있도록, 시 약 및 복제 하 고 일관 된 방식으로 라이브 셀에 lysosomal pH에서 동적인 변화를 조사 하는 프로토콜 개발에 필수적 이다.

C. 선 충 의 창 자 벌레에서 주요 대사 조직 이며 조직의 항상성 및 수명의 중요 한 레 귤 레이 터 이다. 우리는 변화를 평가 하기 위해 분석 실험 개발 어떻게 리소좀 중재 하는 베이스를 결정 하는 벌레의 장 리소좀의 루멘의 산 성도에 노화에 기여. PH에 민감한 fluorophores에서에서 사용 된 이전 C. 선 충 장 리소좀을 표시, 하지만 아직 lysosomal pH vivo에서¹⁸. 에 있는 작은 증가 감지할 수 있는 성공적인 프로토콜을 설정 하는 노력 되지 않았습니다. 여기, 우리 OP50 음식으로 pH에 민감한 fluorophore (cDCFDA)를 통합 하는 간단 하 고 편리한 먹이 프로토콜을 사용 하 여 C. 선 충 의 장 셀에 lysosomal 산 성도의 손실을 감지 하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 제공 합니다.

프로토콜

1. 얼룩 및 장 리소좀 이미지

1. 씨 선 충 성장 매체 (NGM) OP50와 플레이트
   1. 권장된 프로토콜¹⁹ 당 NGM 접시를 준비 하 고 실 온에서 2 일 동안 건조 닫힌된 접시 허용.
   2. OP50 박테리아 살 균 Luria 국물 (파운드) 국물에 접종 하 고 36 h 또는 마약은 0.2 ~ 0.4까지 37 ° C에서 떨고 인큐베이터 또는 물 목욕에서 성장. OD와 세균성 문화를 사용 하지 마십시오 > 1 또는 OD < 0.2.
   3. NGM 접시 건조 되 면, 드롭 (~ 30 µ L)는 격판덮개의 센터에 OP50 inoculum의 장소와 다음 패치에 대략 2 cm x 2 cm 크기에서에 드롭 확산.
      참고: 모든 나머지 OP50 inoculum 최대 한 달에 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
   4. OP50 플레이트는 inoculum (약 10 또는 15 분), 건조가 되 면 반전 하 고 36 h에 대 한 37 ° C에서 번호판을 품 어.
   5. 36 h 후 나중에 사용할 때까지 판 인큐베이터와 4 ° C에서 저장소에서 제거 합니다.
      참고: 격판덮개는 4 ° c.에 최대 1 달 좋은 되어야 합니다.
2. OP50에 cDCFDA를 보충
   1. 보완 하기 위해 cDCFDA OP50 격판덮개에, 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 10 m m cDCFDA의 작업 재고를 준비 합니다. 빛과 나중에 사용-20 ° C에서 저장소에서 보호 cDCFDA 솔루션을 유지.
   2. 전체 패치 cDCFDA 덮여 균일 하 게 되도록 부드럽게 2 cm x 2 cm OP50 패치, 표면에 10 mM cDCFDA 솔루션의 100 µ L를 놓습니다.
      참고: 그것은 매우 중요 한 OP50의 전체 패치 cDCFDA 덮여 있다입니다. 필요한 경우, cDCFDA의 최대 150 µ L를 사용 하 여 각 접시. 그것은 또한 절대적으로 모든 cDCFDA OP50 패치에서 흐르는 음식에 통합 되지 것입니다 얼룩 강도 감소 귀 착될 것 이다 이후 cDCFDA 솔루션 OP50 패치의 국경을 넘어 확장 되지 않습니다.
   3. OP50 번호판을 벤치 위에 어두운 상자 에서도 cDCFDA 솔루션의 모든 세균 패치에 흡수 될 때까지 (일반적으로 약 25 ~ 30 분).
3. CDCFDA를 사용 하 여 웜 얼룩
   1. 일단은 cDCFDA는 완전히 OP50 패치를 침투 해, 접시 당 20 개 이상 벌레 놓고 14 h의 최소 20 ° C에서 거꾸로 접시를 품 어.
      참고: 그것은 빛에 노출을 최소화 하기 위해 불투명 한 상자에서 cDCFDA 접시를 권장.
   2. 섭취 량 차이 실험 제어 하 고 cDCFDA 신호를 정상화 (권장) 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) (공동 얼룩 difluoro) 붕 소 (갓 만든된 1mm 솔루션의 2.5 µ L), 산 성 pH 스펙트럼을 통해 그 형광은 크게 비 변형 acidotropic 약한 아민 염료 (시 약의 일반적인 이름에 대 한 재료의 표 참조).
      이후이 부적당 한 cDCFDA 착 강도 제공할 수 있습니다 lysosomal pH의 잘못 된 해석에 게 참고: 14 h에 대 한 웜 착 색 하지 않습니다.
4. 현미경 검사 법에 대 한 슬라이드를 준비
   1. 테이프 약 3 인치 미러 (그림 1)과 같은 부드럽고 평평한 표면에 떨어져 라벨의 두 개의 병렬 스트립을 놓습니다.
   2. 코트 발 수 스프레이, 거울의 표면 그리고 과잉 액체를 닦아.
   3. 2 %agarose (증류수 H₂O에서에서 해산) 완전히 액 화 될 때까지 전자 레인지에 녹여 다음 테이프의 2 개의 지구 사이 agarose의 50 µ L 드롭 놓고 슬라이드의 스트립에 수직이 되도록 신속 하 게 드롭 현미경 슬라이드 커버 테이프입니다. agarose는 경화 후 슬라이드를 뒤집어 슬라이드, 아래 원형 패드 형성 고 5mm 나트륨 아 지 드 (NaN₃) agarose 패드에의 10 ~ 15 µ L를 추가 합니다.
      참고: 앤₃ 시 토 크롬 C 억제제는 그 때 낮은 농도에서 사용, 그들은 이미징 동안 이동 하지 것입니다 벌레를 anesthetizes 역.
   4. CDCFDA, 보충 OP50 접시에서 벌레를 선택 하 고 어떤 OP50 없이 깨끗 한 NGM 접시에 그들을 전송. 벌레는 벌레의 표면에서 제거 하는 OP50의 대부분을 허용 하는 몇 초 동안에 대 한 이동 하 고 agarose 패드 5 m m 나트륨 아 지 드를 포함 하는 벌레를 전송.
   5. 즉시 커버 슬립을 agarose 패드 커버. 때문에이 벌레 파열 귀 착될 수 있다 너무 많은 압력을 적용 하지 않고 부드럽게 커버 슬립을 배치 해야 합니다.
      참고: OP50 박테리아 cDCFDA 보충 형광 현미경 검사 법에 의해 시각화 하는 때, 따라서 그건 나트륨 아 지 드를 포함 하는 agarose 패드에 그들을 배치 하기 전에 가능한 만큼 최고로 벌레를 청소 하는 것이 중요. C. 선 충 (를 포함 하 여 N2, 야생 유형 제어)의 이상의 6 종자를 준비 하는 경우 그것은 agarose 패드에 벌레를 건조 하지 않습니다 있도록 6의 일괄 처리에서 샘플을 준비 하는 것이 좋습니다. 일부 변종에 외 음부는 적절 하 게 계획 하는 것이 중요 하다 그래서 압력 커버 슬립으로 인해 시간의 연장된 기간 후 파열 시작 합니다.
5. Confocal 현미경 검사 법
   참고: 일부 현미경 형광의 가변 레벨을 보상 형광 강도 자동으로 증가 하는 내장 기능이 있습니다. 이러한 현미경 이미징 벌레 때문에 그들은 본질적으로 샘플의 형광 강도 증가 것입니다 cDCFDA, 물에 잘 작동 하지 않을 수 있습니다.
   1. 여기/방출 파장 488/530 설정을 사용 하 여 표준 confocal 현미경 이미징 수행 cDCFDA에 대 한 nm. 단일 평면 이미지 (Z 스택을 하지) 장 리소좀의 고 강도 정량화에 대 한 초점 (최대 신호 강도)은 리소좀만 사용.
      참고: 아마도 염료 여부의 차이 때문에 인 두를 직접 후부 창 자 세포의 lysosomes 유지 cDCFDA 유전자 형 이나 나이 관계 없이 강도 얼룩, 따라서 주의 해야 이미징 리소좀이이 세포에서 피하려고.
   2. N2 첫째로 벌레 2 일 오래 된 야생 타입 포함 된 슬라이드 이미지. 이렇게 하는 동안 레이저 전력 등, 작은 구멍, 조리개 cDCFDA 강도 얼룩 하지 oversaturated 되도록 confocal 영상 매개 변수를 조정 합니다.
      참고: 일단이 설정을 변경 하지 마십시오 그들 그날 영상의 전체 기간에 대 한.
   3. 소장 (벌레 당 3 ~ 4 이미지)의 단일 평면 1024 x 1024 픽셀의 이미지 캡처는 60 배 확대 렌즈를 사용 하 여.
      참고: 벌레에 cDCFDA 방출 스펙트럼 520 nm의 보고 된 형광 스펙트럼²⁰은 장 autofluorescence (그림 3)에서 특정 신호 판독을 제공와 동시에 하나의 눈에 띄는 피크를 얻을 것입니다.
   4. 각 채널에 대 한.tiff 파일로 원시 confocal 이미지 (.lsm 파일)를 내보냅니다.
   5. 다음, ImageJ를 열고 파일을 클릭 | 오픈 측정할 수에 이미지 파일을 엽니다. 이미지 로드, 일단 관심 (ROI)의 영역을 선택 ImageJ에 타원형 모양을 선택 도구를 사용 합니다.
   6. 그 후, 분석 클릭 | 측정 형광 강도 그 투자 수익에 대 한 척도를. 이미지 당 4-5 다른 포커스 리소좀을 선택 하 고 각 지역 관심 (ROI)의 평균 상대 형광 강도 계산.
   7. 각 이미지에 대 한 리소좀 사이 내장의 영역에 배경 형광 강도 측정 합니다. 배경 형광 강도 값을 lysosomal 형광 강도 값에서 뺍니다.
   8. 총, 약 30 ~ 50 테스트할 각 변형에 대 한 cDCFDA 강도 (6 ~ 10 동물)에 대 한 개별 정규화 된 값을 수집 합니다. 이 값을 사용 하 여 적절 한 통계 소프트웨어를 사용 하 여 상자와 수염 음모를.
      참고: 얼룩 달라질 수 있습니다 상당히 온도, 보육 시간 및 동물의 전반적인 건강/나이 같은 요인에 따라 형광 강도 비교 같은 얼룩 실험 샘플 프로세스 내에서 관련만 되도록. 그것은 따라서 모든 얼룩 실험에서 컨트롤을 처리 하는 것이 중요입니다. 통계적 차이 계산 (t-테스트) 어떤 적절 한 통계 소프트웨어를 사용 하 여.
   9. 모든 이미지는 이미지 매개 변수를 변경 하지 않도록 주의 복용 순서로 (같은 날에 스테인드) 같은 실험에서 변종.

결과

cDCFDA 얼룩 리소좀 pH 의존 방식에서 그리고 그것의 낮은 pKa와 리소좀에 준비 통풍 관은 이상적인 pH 센서²¹. cDCFDA 강도 얼룩은 lysosomal pH (즉 착 강도 증가 pH 감소도)^18,22에 반비례 한다. cDCFDA 신호는 일관 되 게 약 20mm 클로로퀸, lysosomal 산성화의 억제제로 치료 하는 동물의 리소좀과 웜 v ATPase, 양성자 가져?...

토론

노화, 세포 및 분자 이벤트의 다양 한 기여 생활사 특성 및 유전적 요인에 의해 영향을 받습니다. 우리의 최근 연구²² 생식 주기 lysosomal pH 역학의 규제를 통해 소마의 피트 니스 조절에 중요 한 역할을 건의 한다. 우리는 동물에 산 성 리소좀 보장 v ATPase 전사의 upregulation에 의해 적극적으로 재현 하는 동안 그 중재 lysosomal 베이스 승진은 보여주었다. 복제, v ATPase 식 상품의 끝 리소...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
OP50 (E. coli)	Caenorhabditis Genetics Center		Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50
5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate	ThermoFisher	C369	Commonly known as cDCFDA
9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron	ThermoFisher	L7528	Commonly known as Lysotracker Red
Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510)
ImageJ			Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LB Broth powder	ThermoFisher	22700041
Bacto Agar	Sigma	A5306-1KG
NaCl	Sigma	S9888
Bacto Peptone	Fisher Scientific	S71604
Cholesterol powder	Sigma	C3045
CaCl2	Sigma	449709
MgSO4	Sigma	M7506
K3PO4	Sigma	P5629
Sodium Azide	Sigma	S2002
DMSO	Sigma	D8418
Microscope Slides	VWR	48311-703
Cover Slips	ThermoFisher	3406
Agarose	Sigma	A6013
Incubator
Mirror or other smooth flat surface