준비 및 Xenopus laevis Tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜

요약

이 종이 전체 셀 패치 클램프 기록 Xenopus laevis tadpoles의 retinotectal 회로 공부 하는 데 사용 하는 세 뇌 준비를 다루겠습니다. 그것의 자신의 특정 이점 각 준비 신경 회로 기능을 공부 하는 모델로 Xenopus 올챙이의 실험 추적성에 기여 한다.

초록

Xenopus 올챙이 retinotectal 회로, 어떤 형태로 광섬유 tectum에 신경에 직접 synapses 눈에서 망막 신경 절 세포 (RGCs)의 구성 어떻게 신경 회로 공부 하는 인기 모델은 자기 조립. 전체 수행 하는 기능 패치 클램프 기록 중 vivo에서 기록 RGC 갖는 응답을 tectal 뉴런에서 셀 또는 전체 두뇌 준비를 사용 하 여 일반 기본 메커니즘에 대 한 고해상도 데이터의 큰 몸 생성 했다 비정상적인, 회로 형성 및 기능. 여기 우리가 준비 vivo에서 , 원래 뇌 준비를 수행 하는 방법을 설명 하 고 더 최근 개발 tectal 뉴런에서 전체 셀 패치 클램프 녹음을 얻기 위해 수평 뇌 조각을 준비. 각 준비 독특한 실험 장점이 있습니다. Vivo에서 준비 tectal 신경의 눈에 투영 하는 시각적 자극에 직접 응답의 녹음 수 있습니다. 뇌 준비 매우 제어 방식에서 활성화 RGC 축 삭에 대 한 허용 하며 수평 두뇌 슬라이스 준비에서 녹음은 tectum의 모든 레이어에서

서문

Retinotectal 회로 양서류 비주얼 시스템의 주요 구성 요소. 그것은 광섬유 tectum postsynaptic tectal 신경 세포와 시 냅 스 연결을 형성 하는 어디에 그들의 축 삭을 프로젝트 눈에서 RGCs 구성 됩니다. Xenopus 올챙이 retinotectal 회로 신경 회로 형성 기능을 공부 하 고 인기 있는 개발 모델입니다. 그것은 강력한 실험 모델^,12,3렌더링이 올챙이 retinotectal 회로의 많은 특성이 있습니다. 한 주요 특성, 그리고이 문서의 초점 tectal 신경, vivo에서 또는 뇌의 준비를 사용 하 여 전체 셀 패치 클램프 기록 수행 하는 기능입니다. 전압 및 전류 클램프 녹음 모드를 지원 하는 앰프와 복 전기 생리학 장비, 전체 셀 패치 클램프 기록 수 높은 해상도에서 특징에 뉴런의 전기 생리학. 그 결과, 전체 셀 패치 클램프 기록 retinotectal 회로 형성의 주요 단계에 걸쳐 tectal 뉴런에서 개발의 상세 하 고 포괄적인 이해 하 고 내장^4,5 의 소성 제공 ^{, 6 , 7} 고 시 냅 스^8,9,,1011 속성. 전체 셀 패치 클램프 tectal 신경 녹음을 결합, 유전자 또는 morpholinos 이러한 뉴런¹², 그리고 설립된 시각적 회피 테스트¹³ 통해 시각적 가이드 동작을 평가 하는 방법에 관심을 표현 하는 능력을 촉진 합니다 분자, 회로 기능 및 행동 사이 연결의 id입니다.

데이터 전체 셀 패치 클램프 기록에서 취득 불가능 유전 칼슘 표시기 GCaMP6, 같은 새로운 이미징 접근을 사용 하 여 있기 때문에 높은 해상도의 종류 칼슘 표시기를 사용 하 여 비록 허가 이미징 주의 하는 것이 중요 하다 칼슘의 신경 세포의 큰 인구에 걸쳐 역학 동시에, 아니 직접 또는 확실 한 방법은 특정 전기 매개 변수 somata에서 델타 형광을 측정 하 여 얻을 수 있습니다 그리고 거기 방법은 전압 클램프 측정 하 신경 전류-전압 관계입니다. 명확 하 게이 두 가지 접근, electrophysiological 녹음 및 칼슘 이미징, 겹치지 않는 강점가지고 고 다른 유형의 데이터를 생성. 따라서, 가장 좋은 방법은 해결 되 고 특정 실험적인 질문에 따라 달라 집니다.

여기, 우리가 올챙이 눈 tectum는 vivo에서 준비, 뇌 준비를 사용 하 여의 뉴런에서 전체 셀 패치 클램프 기록 인수에 대 한 우리의 방법을 설명 하 고 새로운 수정^{14 연구소에서 개발 된 뇌 준비} . 대표적인 결과 섹션에서 각 준비와 얻을 수 있는 데이터의 종류의 실험적인 장점을 보여 줍니다. 문제 해결을 위한 팁 뿐만 아니라 다른 준비의 강점과 한계 토론 섹션에 포함 됩니다.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 와이오밍 대학에 의해 승인 되었습니다. Electrophysiological 녹음을 포함 한 모든 절차는 실 온, 약 23 ° c.에서 실시 여기에 설명 된 모든 방법은 tadpoles 발달 단계 42 및 49 (Neiuwkoop와 페이 버¹⁵에 따라 개최) 사이에서 tectal 신경 기록 최적화 되어 있다.

1. Vivo에서 준비

1. 올챙이 anesthetize
   1. 0.01% 스 테 인 버그의 솔루션을 포함 하는 작은 페 트리 접시에는 올챙이 놓고 약 5 분 동안 MS-222.
      참고: MS-222 일명 "Tricaine"는 일반적인 물고기와 양서류 마 취. Tadpoles는 m m에서 스 테 인 버그의 솔루션에서 발생 하는: 0.067 4.9 HEPES 5.8 NaCl, KCl, 0.034 Ca (₃)₂•4H₂O, 0.083 MgSO₄•7H₂O.
   2. 올챙이 깊이 anaesthetized (무응답과 이상 수영) 2 단계를 진행 하기 전에 확인 합니다.
2. 해 부/녹음 접시의 바닥에 잠긴된 실리콘 블록을 마 취 올챙이 보안 합니다.
   1. 처분할 수 있는 이동 피 펫을 사용 하 여 외부 기록 솔루션을 포함 해 부/녹음 접시 anaesthetized 올챙이 이동 (115 m m의 NaCl, KCl, 2mm CaCl₂3 m m, MgCl₂3 m m, 5mm HEPES, 1mm 포도 당; 조정 7.25 사용 하 여 pH 10 N NaOH, osmolarity 255 mOsm의).
      1. 자발적인 근육을 최소화 하기 위해 기, 아 세 틸 콜린 수용 체 차단제, tubocurarine (100 µ M) 외부 솔루션에 추가 합니다. (일반적으로,이 이루어집니다 외부 솔루션의 10 mL를 100 µ L 10 mM tubocurarine 주식의 추가 200 µ L 피 펫을 사용 하 여).
   2. 곤충 핀을 사용 하 여 보안 올챙이, 등 쪽, 실리콘 탄성 중합체의 침수 블록 (예: Sylgard 184 참조 자료 테이블 세부 정보에 대 한), 어떤 해 접시 바닥에 붙어 있다.
      참고: 핀의 위치는 중요 한: 눈에서 그 프로젝트 뇌, 성의 RGC 축 삭을 impaling 피하기 위해 충분히 꼬리의 양쪽에 그들을 배치 하 고 그냥 눈 tectum (그림 1A) 앞쪽 뇌를 입력.
3. 중간 선 따라 뇌를 모 깎기.
   1. 두뇌의 명확한 보기에 대 한 살 균 25 G 바늘을 사용 하 여 중간에 따라 표면 절 개 하 여 뇌를 overlying 피부를 제거 합니다.
   2. 신경 관에 바늘을 삽입 하 고 당겨 부드럽게 위쪽으로 (dorsally) 등 튜브의 등 쪽 부분 깔끔하게 절단 (절단) 바닥 플레이트 그대로 (그림 1B)를 떠나 있는 동안 그 같은 중간 축 따라 뇌를 모 깎기.
      참고: 때문에 구심 성 감각 입력 입력은 tectum는 바닥에 접시를 통해 신경 튜브의 바닥 접시 그대로 남아 있을 중요 하다.
4. Tectal 신경 세포를 포함 하는 투명 한 심 실 막을 제거 합니다.
   1. 전기 생리학 장비에 기록 접시를 이동 하 고 깨진된 유리 피 펫 팁을 사용 하 여 심 실 막 overlying tectal 신경 셀 시체를 제거. 가볍게 섬세 한 작업와이 퍼에 걸쳐 그것을 드래그 하 여 팁을 휴식.
   2. 피 펫 홀더에 피펫으로 나사와 micromanipulator 통해 광섬유 tectum 내려 낮은.
   3. 깨진된 피 펫을 사용 하 여 껍질은 tectum에서 심 실 막.
      참고: 그것은 전체 tectum;에서 멤브레인을 제거 하는 데 필요한 작은 창이 충분 하 고 충분 한 뉴런에 대 한 액세스를 제공.
5. 패치 클램프 기록을 전체 셀을 가져옵니다.
   참고:이 시점에서 접근이 비슷합니다 Segev, 외. 에 설명 된 대로 마우스 뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음을 실시 ¹⁶ (그림 1C).
6. 망막에 투영 하는 빛의 전체 필드 플래시 tectal 신경 응답을 기록 합니다.
   1. 망막에 빛의 전체 필드 플래시 프로젝트, 광학 섬유를 올챙이 눈에 인접 한 장소. 광학 섬유의 다른 끝에 LED 빛 광도 제어할 수 있도록 가변 저항 라인 이다. 앰프의 디지털 출력으로 LED를 트리거하십시오. 이 방법에서는, 섬광 빛의 다양 한 농도의 수는 전체 필드(그림 4)를기록 했다.

2. 뇌 준비

1. 1.1 1.3 단계를 수행 합니다.
   참고: tubocurarine이이 준비를 위한 외부 솔루션에 대 한 필요가 있다.
2. 뇌를 격리 합니다.
   1. 25 G 바늘을 사용 하 여 서버 hindbrain (그림 2A).
   2. 올챙이에서 뇌를 분리 하려면 부드럽게 모든 측면 및 복 부 결합 조직 및 신경 섬유를 절단 하는 꼬리-rostral 방향에서 뇌 밑 바늘을 실행 합니다.
3. 실리콘 엘라 스토 머의 블록에 두뇌를 보호 합니다.
   1. 일단 완전히 해제 후 각 전구 중 하나를 통해 하나의 핀 hindbrain (그림 2B)를 통해 또 다른 핀을 배치 하 여 실리콘 탄성 중합체의 블록에 뇌를 보안 합니다. Tectal 신경에서 기록에 대 한 최적의 구성입니다.
4. 전기 생리학 장비에 해 범위에서 고정 된 뇌 준비를 포함 하는 접시를 이동 합니다. 1.4 단계에서 설명한 대로 깨진된 유리 피 펫을 사용 하 여 심 실 멤브레인을 제거 합니다.
5. 바이 폴라 자극 전극에 배치 시 chiasm (어디 각 눈에서 축 삭 책자는 midbrain에 크로스) RGC 축 삭을 직접 활성화 하.
   1. 바이 폴라 자극 전극 rostral, 그리고 거의 옆에, 큰 중간 심 장소. 광학 chiasm는 즉시 rostral 큰 가운데 심 (그림 2B)에 있습니다.
      1. 부드럽게 낮은 자극 전극 다운 시 chiasm에 되도록 작은 덴트 직물에서 형성 된다. 양극 전극은 정밀 하 게 제어 하는 자극의 강도 수 있는 펄스 자극에 의해 구동 됩니다.
6. Segev, 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 수행 하는 전체 셀 패치 클램프 기록 (그림 2C) ¹⁶

3. 수평 뇌 슬라이스 준비

1. 2.1 2.3 단계를 수행 합니다.
2. 면도날을 사용 하 여 하나의 광섬유 tectum의 한쪽의 가장 측면 4 (는 비보에 해당 하는 가장 등 4) 소비 세. 이 컷 평면에 평행 rostral 꼬리 그림 3A와 같이 이루어집니다.
3. 두뇌는 슬라이스 된 실리콘 엘라 스토 머의 측면에 다시 핀 사이드 (somata 및 neuropil는 기록에 대 한 직접 액세스할 수 있습니다)을 향하도록 하 고 실리콘 고무 블록 (그림 3 멀리 직면 하는 뇌의 심 실 표면 B) (있도록 양극 전극 광학 chiasm에 놓일 수 있다).
4. 전체 셀 패치 클램프 또는 로컬 출원된 잠재적인 기록 (그림 3C) Segev, 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 수행 ¹⁶

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결과

빛 갖는 응답를 빛의 전체 필드 플래시 결과 응답 개별 tectal 뉴런(그림 4)에서 기록 하는 동안 망막에 예상 된다. 이 특정 프로토콜은 모두 빛 ("에" 응답) 켜기 한 다음 15 신경의 응답을 측정 하도록 설계 되어 나중 "에서 응답." 측정 하는 s Tectal 신경은 일반적으로 응답에 이따금 강력한 전시 (표시 여기에 기록 된 전압 클램프 모드, 신경?...

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토론

이 작품에서 설명 하는 모든 방법 tadpoles 발달 단계 42 및 49 (Neiuwkoop와 페이 버¹⁵에 따라 개최) 사이에서 tectal 신경 기록 최적화 되어 있다. 무대 42는 tadpoles는 충분히 크고 충분히 개발 곤충 핀 vivo에서 녹음 한 뇌 해 부를 수행 하기 위한 뇌의 양쪽에 배치 될 수 있도록. 이전 단계에서는 tadpoles는 근본적으로 2 차원 (즉, 평면), 여기서 설명 하는 접근은 최적이 아닙니다...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stemi Stereo 508	Zeiss	495009-0006-000	Dissecting microscope
MS-222 "Tricane"	Finquel	ARF5G	Amphibian general anesthetic
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Used to prepare Stienberg's solution and external solution
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Used to prepare Stienberg's solution and external solution
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-1KG	Used to prepare Stienberg's solution and external solution
Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O)	Sigma-Aldrich	237124-500G	Used to prepare Stienberg's solution
Magnesium Sulfate (MgSO4)	Mallinckrodt Chemicals	6066-04	Used to prepare Steinberg's solution
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5080-500G	Used to prepare external recording solution
Magnesium Chloride (MgCl2)	J.T. Baker	2444-01	Used to prepare external recording solution
D-glucose Anhydrous	Mallinckrodt Chemicals	6066-04	Used to prepare external recording solution
Tubocurarine hydrochloride pentahydrate	Sigma	T2379	Nicotinic acetylcholine receptor antagonist
Insect Pins	Fine Science Tools	26002-10	0.1mm diameter stainless steel pins
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	761028	Preweighed monomer and curing agent kit
Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm	Fisher Scientific	AS4052	Small petri dishes
PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm)	BD	305122	Syringe needles
1mL Slip Tip Tuberculin Syringe	BD	309659	Disposable, sterile syringes
Borosilicate pipette glass	Sutter Instrument	BF150-86-10HP	Pulled to desired specifications using pipette pulling machine
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97	Fabricates micropipettes for electrophysiology recording
Kimwipes Kimtech wipes	Kimberly-Clark	34120	Delicate task lint-free wipers
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B	Molecular Devices	1-CV-7B	Current clamp and voltage clamp headstage
MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller	Sutter Instrument	MP-285/T	Control for headstage on electrophysiology rig
Fiber-Coupled LED (Green)	Thorlabs	M530F2	Fiber optic cable paired with green LED
Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter)	FHC	30207	Bipolar stimulating electrode
ISO-Flex Stimulator	A.M.P.I. (Israel)	Contact manufacturer	Flexible stimulus isolator
Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier	Molecular Devices	2500-0157	Amplifier for voltage- and current-clamp recording
Digidata 1322A digitizer	Molecular Devices	2500-135	Data acquisition system for electrophysiology recording
Axio Examiner.A1	Zeiss	491404-0001-000	Microscope for electrophysiology
Micro-g Lab Table	TMC	63-533	Air table for electrophysiology microscope
Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit	Dell	D06D001	Computer running electrophysiology software
c2400 CCD camera	Hamamatsu	70826-5	Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging
7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades	Gillette	CMM01049	Platinum-coated stainless razor blades
Transfer Pipets	Fisher Scientific	13-711-7M	Disposable Polyethylene transfer pipets