마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

요약

다양 한 질병의 표시 더 순수 관련 모델 개발 및 구현에 약물 발견 프로그램 되. 여기에 설명 된 새로운 모델 시스템 spheroids를 경작 하 고 종양학 신약에 대 한 검색 하는 높은 처리량 1536-잘 접시 기반 시스템에서 상영 될 수 방법을 3 차원 종양을 보여 줍니다.

초록

암 세포는 정기적으로 플라스틱 표면에 2 차원 (2D)에서 경작 되었습니다. 그러나이 기술은,, 부족 진정한 환경 종양 질량에 비보에 노출 됩니다. 단단한 종양 시트 플라스틱, 첨부로 성장 하지만 3 차원 (3d) 클론 셀의 컬렉션으로 대신 그들의 이웃, 그리고 정상적인 세포 극성의 파괴와 같은 독특한 공간 속성의 상호 작용 공간. 이러한 상호 작용 종양 vivo에서 더 관련 된 형태학 및 세포 특성을 얻으려고 3 차원 배양 세포를 발생할. 또한, 종양 질량은 다른 세포 유형 stromal 및 면역 세포 뿐만 아니라 다른 모든 세포 유형에 서 세포 외 매트릭스와 직접 접촉에. 입금 매트릭스 고분자 콜라겐과 fibronectin 같은 구성 되어 있습니다.

머리 맡에 벤치에서 종양학에서 연구 결과의 번역을 증가 하는 시도에 많은 그룹 그들의 약 개발 전략에서 3D 모델 시스템의 사용을 조사 하기 시작 했습니다. 이러한 시스템은 종양의 복잡 하 고 이기종 환경 정리 하려고 하기 때문에 더 많은 생리 적으로 관련 된 것으로 생각 된다. 그러나 이러한 시스템은,, 매우 복잡할 수, 그리고, 비록 의무가 96 잘 형식과 384에도 지금 일부에서 성장, 그들은 대규모 성장 및 심사에 대 한 몇 가지 옵션 제공. 이 관찰 간격 여기 문화 종양 spheroids 1536-잘 접시의 높은 처리량 용량에 세부 사항에서 설명 하는 방법의 개발을 주도하 고 있다. 이 메서드는 매우 복잡 한 매트릭스 기반 시스템, 화면, 그리고 기존의 2D 분석 하기 어려운 타협을 나타냅니다. 은닉 다른 유전자 돌연변이 암 세포 라인의 다양 한은 성공적으로 상영 Mitogen-Activated 단백질 키 니 아 제 또는 MAPK 통로 대상으로 하는 화합물의 큐레이터 라이브러리를 사용 하 여 복합 효능을 검사. 회전 타원 체 문화 응답 그런 다음 2d, 성장 하는 세포의 응답에 비교 하 고 차동 활동 보고 됩니다. 이 메서드는 복합 활동 높은 처리량 3D 설정에서 테스트를 위한 고유 프로토콜을 제공 합니다.

서문

지난 10 년간에서 점점 더 많은 연구는 성장 하는 세포 차원에서 플라스틱에 의해 완전히 지 하지 개념 이해 3D 셀 문화 모델의 사용을 구현 했습니다. 이러한 개념의 예 생존 및 세포 운명 조절에 세포 외 매트릭스의 역할 뿐 아니라 정상 상피 세포 극성¹ 셀의 꼭대기와 기저 계층의 공간적 방향이 손실에 교대를 포함 합니다. 종양학 연구, 특히, 암 세포와 2D 및 3D 셀 문화 시스템^3,4간의 차이의 기본적인 생물학을 이해 하 3D 모델을 사용 했다. 더 정교한 셀 문화 기술과 멀티 잘 포맷을 더 그들의 적응의 개발은 3D 설정에서 새로운 약물에 대 한 검색을 활성화 하 고 있다. 셀과 달리 성장 조건 하에서 2D, 3D 모델 종양 범위 복잡 한 계층화 된 셀룰러 시스템⁵ 에서 다양 한 크기의 단일 셀 유형 분야에서에서의 복잡 한 cell 타입 분야^{6,7, 8}. 소설 화합물 또는 potently 이러한 3D 모델 시스템에 세포 죽음을 유도 하는 생물 의약품의 발견은, 따라서, 약물 개발 캠페인에 높은 관심의. 이 분석 실험의 끝점 종종 세포 증식에 변화를 평가 하기 위해 2D 문화에서 그와 동일 하지만 더 순수 관련 설정에서 실시 하는 때 그들은 대상 유전자 나 통로가 되는 종속성의 진정한 수준을 드러낼 수 있습니다. 심문.

대부분 중 96 또는 384-잘 결정 접시를 사용 하 고 높은 처리량 검열 (HTS) 형식에서 자주 사용 한다에 쉽게 적응 하지 않습니다 하지만 모델 시스템의 다양 한 3D 문화 시스템에 약물 응답 공부 하 개발 되어 위의 도입, 약물 발견 심사 캠페인입니다. 이러한 시스템 물방울 기술, 회전 타원 체 문화, 공중 부양, 그리고 자연 또는 합성 젤 콜라겐, Matrigel, 또는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)^{2 등을 통합 하는 문화를 유도 하기 위해 마그네틱 입자와 셀 pulsating 매달려의 사용을 포함} . 여기, 우리는 1536-잘 접시 형태로 설립된 암 세포 선에서 3D 회전 타원 체 문화 생산 이전 개발 기술의 상세한 방법 제시. 이 프로토콜 높은 정의 매체 사용 일반적으로 부착 셀 라인⁹의 부착을 방지 합니다. 이 시스템에 제한 사항 (즉, 그것은 완전히 암의 복잡 한 모델 시스템 정리 수 없습니다), 하지만 그럼에도 불구 하 고,이 분석 실험 작은 분자의 대규모 컬렉션 및 약 응답의 십자로 비교의 높은 처리량 검열 다양 한 세포 및 화합물에 대 한 2D 및 3D 문화 사이

셀 라인 MAPK 신호 통로, 통로 높은 암, dysregulated에 관련 된 유전자의 모든 항구 돌연변이 들이 문서의 방법 보여 선택 하 고 있는 많은 치료제에 대 한 사용할 수 있습니다. 라인의 많은 키 얼 스 틴 쥐 육 종 바이러스 라고도 KRA, 신경 RAS 또는 NRAS, 하 비 쥐 육 종 바이러스 oncogene 또는 HRA, 및 관련된 kinases 빠르게 가속 Fibrosarcomas, 일컬어 종양 돌연변이 활성화 Raf는. 최근 문학이이 통로의 다른 노드의 억제제 셀 라인 3D 조건^9,10에서 성장 될 때의 하위 집합에 고유 하 게 더 효능을 제안 합니다. 때 활성 RAS와 암 세포 차원에서 교양 있었다, 그들은 증가 감도 MAPK 억제제를 시연 하 고 또한,이 접근 경로 확인할 수 및 전통적인 2D에서 놓친 억제제를 대상으로 한 연구 발견 설정합니다. 이 연구의 목표는 이러한 셀 라인 문화 하는 데 사용 하는 방법을 제시 하 고 또한, 차등을 보여 주기 위해 3D를 사용 하는 경우에 관찰 될 수 있는 이러한 억제제에 대 한 응답 문화 시스템 세포.

프로토콜

1. 1536-좋은 3D 종양 Spheroids의 배양

1. Dulbecco의 수정 이글스 매체 (DMEM/F12)의 500 mL를 다음과 같은 시 약을 추가 하 여 신선한 3D 종양 회전 타원 체 중간 줄기 (셀 매체 녹아웃 혈 청 교체 + 인슐린-처리가-셀레늄) 준비: 1 x 페니실린/스, 인간의 10 ng/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 요소 (bFGF), 인간 표 피 성장 인자 (EGF), 0.4% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) (분수 V), 인슐린-처리가-셀레늄, 및 1% 녹아웃 (KO) 혈 청 교체 (할 하지 동결-해 동) x 1의 20 ng/mL.
2. 필터-소독 0.4 µ m 병 상단 필터 시스템을 통해 보충 교재를 가진 전체 매체.
3. 그들을 세척 하 여 전통적인 세포 배양 플라스 크에서 권장된 일상적인 문화 조건에 따라 성장 암 세포 라인 분리 3 x 1 x 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 0.25 %trypsin (1 mL의 적절 한 금액을 추가 5 cm²) 당 5 분 셀 위에 얇은 레이어를 만듭니다. 혈 청을 포함 하는 매체의 금액 x 5 트립 신을 중화 하 고는 셀 이동 합니다. 예를 들어 5 ml의 트립 신 매체의 25 mL를 사용 합니다.
4. 씨앗 잘 회전 타원 체 매체의 8 µ L 당 500 세포의 총 1536-잘 조직 문화 취급 판으로 위해 10⁴ 셀/mL x 62.5에 셀 용액의 농도 조정 합니다.
5. 생물 안전 캐비닛, 연동 펌프-기반 시스템으로 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트를 사용 하 여 셀을 시드하십시오. 다른 셀 라인 사이 PBS와 70% x 1 카세트의 튜브를 플러시 에탄올 10 s.
6. 또는, 종자 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트와 연동 펌프 또는 셀 줄 필요 번호판의 번호에 따라 연결 된 주사기 펌프를 사용 하 여 HEPA 필터 룸 내에 있는 액체 처리기를 사용 하 여 셀.
7. 수동으로 사용 하 여 통기성 접착 판 도장 중 또는 접시 마감재를 사용 하 여 접시를 봉인.
8. 10 rpm와 5% 이산화탄소 (CO₂)와 95% 상대 습도 37 ° C에서 설정 회전 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 3 d 형태를 spheroids 수 있습니다.

2. 1536-잘 2D 암 라인의 경작

참고: 1536-잘 2D 암 라인 3D 판 화합물의 추가 하기 전에 24 시간 배양 한다.

1. 선택한 라인에 대 한 적절 한 성장 매체의 500 mL를 다음과 같은 시 약을 추가 하 여 2D 암 세포 매체를 준비: 페니실린/스와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) x 1.
2. 필터-소독 0.4 µ m 병 상단 필터 시스템을 통해 보충 교재를 가진 전체 매체.
3. 분리 그들을 세척 하 여 전통적인 세포 배양 플라스 크에서 권장된 일상적인 문화 조건에 따라 성장 암 세포 선, PBS와 0.25 %trypsin (5 c m²당 1 mL)의 적절 한 금액을 추가 하는 5 분 x 1 3 x 셀 위에 얇은 레이어를 만듭니다. 혈 청을 포함 하는 매체의 금액 x 5 트립 신을 중화 하 고는 셀 이동 합니다. 예를 들어 5 ml의 트립 신 매체의 25 mL를 사용 합니다.
4. 씨앗 잘 완전 한 매체의 8 µ L에서 당 500 세포의 총 1536-잘 조직 문화 취급 판으로 위해 10⁴ 셀/mL x 62.5에 셀 용액의 농도 조정 합니다.
5. 생물 안전 캐비닛, 연동 펌프-기반 시스템으로 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트를 사용 하 여 셀을 시드하십시오. 다른 셀 라인 사이 살 균 PBS와 70% x 1 카세트의 튜브를 플러시 에탄올 10 s.
6. 또는, 종자 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트와 연동 펌프 또는 셀 당 격판덮개의 볼륨에 따라 연결 된 주사기 펌프를 사용 하 여 HEPA 필터 로봇 룸 내에 있는 액체 처리기를 사용 하 여 셀 선 필요입니다.
7. 수동으로 사용 하 여 통기성 접착 판 도장 중 또는 접시 마감재를 사용 하 여 접시를 봉인.
8. 10 rpm 및 복합 추가, 5% CO₂ 와 95% 상대 습도와 이전 24 시간 동안 37 ° C 설정 회전 인큐베이터에 접시를 놓습니다.

3. 복합 추가

1. 10 m m 최고 농도와 액체 처리 로봇에 100% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 MAPK 억제제의 8 포인트, 3-fold 직렬 희석을 준비 합니다. 프로테아좀 억제제 Bortezomib 분석 결과의 동적 범위를 결정 하기 위해 죽이 완전 한 셀에 대 한 긍정적인 컨트롤로 사용 됩니다.
2. 빠른 스핀 모든 시험 접시와 든 수집을 100 x g에서 복합 플레이트. 각 접시에서 접착 씰을 제거 하 고 8 총을 추가 하는 음향 분배기 설정에 접시를 놓고 각 화합물/희석 대표 하는 잘 당 0.1 %DMSO 최종 농도 10 µ M의 최고 복합 복용량의 nL.
3. 화합물의 추가 완료 되 면, 주문 품, 스테인레스 스틸 셀 문화 뚜껑 접시에 증발을 방지 하 고 5d, 5% CO₂ 와 95% 상대 습도 대 한 37 ° C에서 회전 인큐베이터에 접시를 장소를 장소.

4. 검출 시 약 추가 및 원시 데이터의 취득

1. 전 따뜻한 실내 온도에서 세포 증식 또는 37 ° C 물 욕조에 아데닌 3 인산 염 (ATP)에서 변화 하 고, 따라서, 변화를 감지 하는 소를 포함 하는 셀 세포 시 약의 적절 한 볼륨. 검출 시 약의 3 µ L의 총 각 잘 연동 펌프를 사용 하 여를 추가 하 고 적어도 15 분 동안 실내 온도에 격판덮개를 품 어.
2. 플레이트 루미 노에 발광을 캡처하십시오.

5입니다. 데이터 처리

1. 악기에서 원시 데이터를 추출 하 고 중립 제어로 혼자 DMSO를 포함 하는 모든 우물의 평균 시험 화합물을 포함 하는 모든 필드를 정상화. 이 값에서 각 화합물의 백분율 성장 저해를 계산 합니다. 이 Microsoft Excel에서 수식 함수를 사용 하 여 완료 되 면 어디 f (x) = {(샘플 값은 상대적인 빛 단위 (RLUs) / (평균 DMSO 값 RLUs) * 100)}.
2. 그래프 프로그램을 사용 하 여 복합 농도 대 한 단계로 5.1에서 정규화 된 데이터의 값을 그래프에 의해 복용량 응답 곡선 및 금지 IC50s를 생성 합니다.
   참고: 우리는 헬 리오스, 내부 NIBR 소프트웨어 도구를 사용 하 여 데이터를 분석. 이 기능을 완료 하려면 우리는 비패라메트릭 곡선 분석 도구를 선택.

결과

여기에 설명 된 방법을 사용 하 여 2D 문화 조건 하에서 잘 성장 하는 것으로 알려져 라인 테스트 설립된 암 세포의 다양 한. 대표 이미지 MAPK 돌연변이 암의 다양 한 세포 라인 (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-멜-30:NRAS, 및 학회-62:HRAS) 그림 1에서 볼 수 있습니다. 이러한 이미지는 셀 라인을가지고 있지만 다양 한 형태학, 각각 형성 3D 구조 분석 결과 1536-잘 접?...

토론

여기에 제시 된 방법을 대규모 복합 검 진을 위해 1536-잘 접시에 종양 spheroids를 생산 하는 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 보여 줍니다. 이러한 방법은 종양 spheroids 유전 종속성 및 복합 감도^13, 에 대 한 질문 6-잘, 96 잘 접시에 낮은 처리량 분석 실험에서 성장 했다 국립 암 연구소에 직장에서 처음 적응 했다 ^{14 , 15}.이 프로토콜...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12	ATCC	30-2006	Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors.
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12	Lonza	12-604F	Purchased as a prepared solution.
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)	Lonza	12-115Q	Purchased as a prepared solution.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Seradigm	1500-500	Purchased as a prepared solution.
1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Hyclone	SH30042.01	Purchased as a prepared solution.
1x Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140	Purchased as a prepared solution.
10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF)	Sigma	F0291	Resuspend in sterile water.
20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma	E9644	Resuspend in sterile water.
0.4% Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9418	Resuspend in sterile PBS and filter.
1x Insulin Transferrin Selenium (ITS)	Gibco	51500056
1% KnockOut (KO) Serum Replacement	Gibco	10828-028	Add fresh right before use.
100% Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	276855-100ML
CellTiter-Glo	Promega	G7573	Purchased as a prepared solution.
Consumables
Small Combi Cassette	ThermoFisher	24073295
Small Multiflow Cassette	BioTek	294085
1536-well sterile TC plates (white)	Corning	3727
1536-well sterile TC plates (black)	Corning	3893
Scivax Plates	MBL International	NCP-LH384-10
Equipment
Adhesives seals	ThermoFisher	AB0718
Spinning Incubator	LiCONiC
Stainless Steel Lids	The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)
ATS Acoustic Dispensor	EDS Biosystems
Echo Acoustic Dispensor	Labcyte
Luminometer	Envision-Perkin Elmer
Peristaltic Pump- Multidrop Combi	ThermoFisher
Liquid Handler-Multiflow FX	BioTek