인간의 면역 세포의 3 차원 시각화를 위한 빛 시트 현미경

요약

여기, 선물이 빛 시트 현미경을 사용 하 여 3 차원 (3D) 콜라겐 매트릭스에 포함 된 면역 세포를 시각화 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 또한 3d에서 셀 이동 추적 하는 방법 elaborates. 다른 유형의 3D 매트릭스에 현 탁 액 셀이이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

초록

Vivo에서, 활성화, 확산, 그리고 모든 면역 세포의 기능 림프절 이나 조직에 예를 들어 3 차원 (3D) 환경에서 발생합니다. 최신, 대부분 체 외에 시스템 셀 문화 또는 coverslips와 같은 2 차원 (2D) 표면에 의존합니다. 최적의 모방 생리 조건에 생체 외에서우리는 간단한 3D 콜라겐 매트릭스를 활용합니다. 콜라겐은 세포 외 기질 (ECM)의 주요 구성 요소 중 하나입니다 그리고 3D 매트릭스 구성에 널리 사용 되 고 있다. 3D 영상에 대 한 최근에 개발한 빛 시트 현미경 기술 (단일 평면 조명 현미경이 라고도 함)는 높은 수집 속도, 큰 침투 깊이, 낮은 표백 및 photocytotoxicity 기능입니다. 또한, 빛 시트 현미경 장기 측정을 위해 특히 유리 하다. 여기 우리는 최적화 된 프로토콜 설정 하 고 인간의 면역 세포, 예를 들어 기본 인간의 세포 독성 T 세포 (CTL)을 처리 하는 방법을 설명 하 고 라이브 셀 이미징에 대 한 빛-시트 현미경과 사용에 대 한 3D 콜라겐 매트릭스에 자연 킬러 (NK) 세포와 고정된 샘플입니다. 이미지 수집 및 세포 이동의 분석을 위한 절차 되 게 됩니다. 특히 초점 중요 한 단계 및 샘플 준비 및 데이터 분석에 대 한 요소를 강조 하기 위해 제공 됩니다. 이 프로토콜은 3D 콜라겐 매트릭스에 현 탁 액 셀의 다른 종류에 대 한 고용 수 있습니다 하 고 면역 세포에 국한 되지 않습니다.

서문

마이그레이션에 대 한 대부분 지식 세포에서 온다 2D는 일반적으로 유리 또는 플라스틱 표면 문화/이미징의 실시는^1,2,3, 실험 접시. 그러나, 생리 적인 시나리오 필요, 대부분의 경우, 3D microenvironment, 기질 (ECM) 결정적인 역할을 담당 합니다. ECM 뿐만 아니라 적절 한 세포 형태를 유지 하기 위해 3 차원 구조 에센셜을 제공 하지만 또한 생존 신호 또는 많은 셀^4,5 의 최적의 기능에 대 한 방향 신호를 제공 합니다. 따라서, 3D 환경이입니다 더 나은 휴대 전화 기능 및 생리 적 컨텍스트를 반영 하는 더 나은 환경에서 동작을 식별 하는 데 필요한.

인간의 신체에서 대부분 세포 면역 세포 특히 3D 시나리오에서 그들의 기능을 발휘 한다. 예를 들어 활성화 된 T 세포 순찰 조직 대상 셀에 대 한 검색, naïve T 세포 마이그레이션 기간 동안 마이그레이션 모드와 기계는 해당 하는 extracellular 적응 그들의 동족 항 원 제시 세포에 대 한 검색에서 림프절을 통해 환경^3,,67. 3D 콜라겐 젤 잘 설립 하 고 잘 특징이 3D 셀 문화 시스템^8,,910로 널리 사용 되었습니다. 우리의 이전 작품에서는 기본 인간의 세포 높은 모바일 0.25% 콜라겐 기반 매트릭스¹¹약 4.8 µ m/min의 평균 속도에 마이그레이션할. 골격의 재배치는 셀 마이그레이션¹²에서 핵심 역할을 한다. 세포 이동의 단일 모드에만 적용 되지 않습니다 아직 위치, microenvironment, cytokines, 혈 그라디언트, 특정 마이그레이션 동작 간에 전환할 수 및 extracellular 신호는 조정 보여주는 증거를 축적 된 여러 가지 방법 ³에 철새 행동입니다.

안정적으로 면역 세포 기능 및 동작을 예를 들어 마이그레이션, 돌출 형성 또는 기공을 교통 분석을 그것 큰 장점은 신속 하 고 안정적인 방식으로 상대적으로 대용량 3D 이미지를 취득할 수 있을 것입니다. 3D 영상에 대 한 최근에 개발한 빛 시트 현미경 기술 (단일 평면 조명 현미경이 라고도 함)는 만족 스러운 솔루션^13,14을 제공 합니다. 이미지 수집, 동안 얇은 정적 빛 시트 샘플을 밝히는 생성 됩니다. 초점 비행기에 이렇게에서 넓은 지역 비행기에서 세포를 영향을 주지 않고 동시에 조명 될 수 있습니다. 이 기능에는 크게 감소 표백 및 photocytotoxicity 높은 수집 속도를 수 있습니다. 이 문서에서 우리 주 인간의 면역 세포 빛 시트 현미경을 사용 하 여 시각화 하는 방법 및 마이그레이션 3D 시나리오에서를 분석 하는 방법을 설명 합니다.

프로토콜

인간의 재료 (인간의 혈액 기증자 로부터 백혈구 감소 시스템 실)와 함께이 연구를 위해 실시 하는 연구 승인 지역 윤리 위원회 (16.4.2015 (84/15;에서 선언 교수 박사 Rettig Stürmer))와 해당 지침을 따릅니다.

1. 중화 콜라겐 솔루션의 준비 (500 µ L)

1. 셀 문화 후드 무 균 1.5 mL 튜브에 냉장된 콜라겐 재고 솔루션 (10.4 mg/mL)의 400 µ L를 전송. 천천히의 50 µ L 냉장 10 x PBS (pH 7.0-7.3) 냉장된 콜라겐 재고 솔루션의 400 µ L 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 타일링 하 여 솔루션을 믹스.
   참고: 1 부의 모든 단계는 셀 문화 후드 행해져야 한다.
2. 1.1에서 콜라겐 솔루션의 500 µ L로 0.1 M NaOH의 8 µ L를 추가 합니다. pH 7.2-7.6를 조정 하려면 PH 시험 지구를 사용 하 여 (pH 범위: 6-10) 혼합물의 pH 값을 확인 하.
   참고: 볼륨 콜라겐의 다른 일괄 처리에 대 한 달라질 수 있습니다. NaOH 솔루션을 공기 방울을 피하기 위해 천천히 혼합 될 수 있다. 혼합물을 콜라겐 겔 화를 피하기 위해 얼음에 보관 한다.
3. 추가 2 µ L 살 균 ddH₂O 500 µ L. 최종 볼륨을 잘 섞어 또는 및 저장이 콜라겐 솔루션 (8.32 mg/mL) 얼음에 4 ° C에서 사용까지.
   참고:이 조건 하에서 중화 콜라겐 사용할 수 있습니다 24 h. 위해 Aliquots 공기 방울을 피하기 위해 권장 하지 않습니다.

2. 샘플 준비 빛 시트 형광 현미경 검사 법 모 세관을 사용 하 여

1. 앞에서 설명한 대로 붙일 원하는 기본 형광 염료¹⁵ 또는 형광 단백질¹¹ 관심의 라이브 셀 라벨.
2. 1 × 10⁶ 셀의 셀 문화 후드 무 균 1.5 mL 튜브에 전송 합니다. 원심 8 분 삭제에 대 한 200 x g에 튜브는 상쾌한 고 문화 매체의 200 µ L에 펠 릿을 resuspend.
   참고: 5 × 10⁶ 셀/mL의 셀 밀도 인간의 면역 세포 이동, 세포 독성 T 세포 (CTL)과 자연 킬러 (NK) 세포의 시각화에 대 한 것이 좋습니다.
3. 1.3에서 중화 콜라겐 솔루션의 85.9 µ L를 추가 합니다. 에 세포 현 탁 액 2.2에서. 그리고 제대로 2.5 mg/mL의 콜라겐 농도 도달 하는 혼합. 후드에 얼음에 셀/콜라겐 혼합을 둡니다.
   참고: 콜라겐의 원하는 농도 N mg/mL 이면 가정의 볼륨 무력화 (200 µ L 세포 현 탁 액)에 대 한 콜라겐 솔루션 = 200 × N /(8.32-N)
4. 다음, 모 세관에 넣고 일치 플런저 (내부 직경 ~ 1 mm) 플런저는 모 세관에서 1 m m까지. 문화 매체 (그림 1A)로 담거 서 플런저를 젖은.
   참고:이 단계는 모 세관 셀/콜라겐 혼합으로 감소 때 기포를 방지 하기 위해 도울 수 있었다. 모 세관 및 플런저 살 균 될 필요가 없습니다.
5. 2.3에서 셀/콜라겐 혼합으로 모 세관을 찍어. 천천히 다시 10-20 m m (그림 1B)에 대 한 플런저를 당겨. 70% 에탄올 스프레이 나머지 콜라겐 솔루션 제거를 적신 종이 타월로 모 세관의 외부 벽을 닦으십시오.
6. 5 mL 튜브의 내부 벽에 클레이 모델링 모 세관을 탑재 하 고 모 세관 (그림 1C)의 가장자리에 셀/콜라겐 혼합을 밀어.
7. 5% CO₂ 콜라겐 합 1 h 37 ° C에서 모 세관을 유지.
8. 5 mL 튜브를 배양 (약 1-2 mL)를 추가 합니다. 신중 하 게 약 3/4 매체 (그림 1D)에 걸려 콜라겐의 중간에 밖으로 생산 콜라겐 로드를 누릅니다.
9. 모 세관,이, 같은 매체를 가진 교원 질 막대 equilibrate 또 다른 30 분 5% CO₂ 와 37 ° C에서 유지.
   참고: 나중에, 콜라겐 막대 수 수 철수 모 세관 그리고 경작에 더 사용 하기 전에 추가.

3. 이미지 수집 빛 시트 현미경을 사용 하 여

1. 제조업체의 지침에 따라 샘플 챔버 어셈블리입니다.
2. 보육 및 현미경 시료 챔버 (라이브 셀 이미징만)에 대 한 37 ° C에가 열을 켭니다.
3. 시료 챔버에서 모 세관을 놓고 이미지 수집에 대 한 관심의 영역을 찾아 샘플을 찾습니다.
4. 해당 laser(s)를 활성화 합니다. 다음 설정을 설정: 레이저 전원, 노출 시간, 단계-z-스택, 시작 위치와 끝 위치 z-스택, 그리고 라이브 셀 이미징에 대 한 시간 간격의 크기.
   참고: 예를 들어 그림 2 의 샘플은 몇 군데 모든 40 단계-1 µ m의 크기와 37 ℃에서 6 h s (총 두께: 538 µ m). 레이저 파워 노출 시간 30 양 x-y 방향에서 픽셀 크기의 1%는 0.23 µ m 이었다.
5. 이미지 수집을 시작 합니다.

4. 자동 분석 추적

1. 파일 변환기를 열고, 파일 추가 (*.ims) 소프트웨어 파일 형식으로 변환할 이미지 파일 선택을 클릭 합니다. 찾아보기 를 클릭 하 고 변환 된 파일을 저장할 폴더를 선택 합니다. 모든 시작을 클릭 합니다.
2. 분석 소프트웨어를 엽니다. 클릭 능가합니다. 파일 에 가십시오 오픈, 클릭 다음 이미징 파일 분석을 선택 합니다.
   참고: 파일 크기가 큰 경우이 단계 시간을 걸릴 수 있습니다. 1 테라바이트 (TB) 보다 큰 파일 권장 하지 않습니다 하나의 실험에 대 한 프로세스와 같은 큰 파일은 매우 계산 용량 요구.
3. 새로운 관광 명소를 추가클릭 합니다. 프로세스 전체 이미지 마지막으로상자를 확인 하십시오. 다음을 클릭 합니다.
4. 입력 x 좌표와 y (픽셀)에 관심 영역을 정의 하. (시간 및 z 위치) 분석 프레임 수를 입력 합니다. 다음을 클릭 합니다.
5. 소스 채널의 드롭다운 목록에서 추적할 개체를 포함 하는 대상 채널을 선택 합니다. 입력 예상 xy 직경 (µ m). 다음을 클릭 합니다.
   참고: 예상된 xy 직경 추적할 개체의 x-y 차원에서 평균 지름이입니다.
6. 품질을 클릭 합니다. 있는 셀 (개체)의 대부분은 포함 되어야 하는 임계값을 설정 합니다. 다음을 클릭 합니다.
7. 원하는 알고리즘 (회귀 모션 권장)을 선택 합니다. 입력 하는 최대 거리 (20 µ m 권장)와 최대 간격 크기 (3 또는 2 권장). 프로세스 전체 이미지를 마지막으로클릭 합니다.
   참고: 최대 거리 와 최대 간격 크기 트랙 휴식 두 임계값은. 좀 더 구체적으로, 두 개의 연속 프레임에서 동일한 개체 사이의 거리 최대 거리를 초과 하는 때 나중 프레임에이 개체 간주 됩니다 새 개체로. 가끔 중, 같은 개체 수 있습니다 몇 프레임 사라지고 다시 나타난다. 이 경우에, 최대 간격 크기 내에서이 개체가 다시 나타납니다 경우에 그것은 동일한 개체도 간주 될 것 이다.
8. 필터 형식 을 클릭 하 고 원치 않는 트랙을 제외 하는 옵션을 선택 합니다.
   참고:이 단계는 선택 사항입니다.
9. 다음 을 클릭 한 다음 마침을 클릭 합니다.
   참고:이 단계는 일 컴퓨팅 성능에 따라 시간을 걸릴 수 있습니다.
10. 트랙 편집 을 클릭 하 고 올바른 드리프트를 선택 합니다. (변환 드리프트 권장) 적절 한 알고리즘을 선택 합니다. 원하는 결과 데이터 집합 크기 를 선택 합니다 (새 크기와 같은 현재 크기 권장). 확인을 클릭 합니다.
    참고:이 단계는만 콜라겐 이미지 중 떠내려 때 필요한.
11. 통계 를 클릭 하 고 구성의 표시 통계 값 목록을선택 합니다. 관심의 옵션을 수출 (예: 좌표, 속도 및 등) 확인 하십시오. 확인을 클릭 합니다.
12. 파일 내보내기 모든 통계 를 클릭 하 고 파일 이름을 입력 합니다.

5. 고정 및 면역 형광 콜라겐 매트릭스 셀의 얼룩

1. 화학 후드 5 mL 튜브에 4 %paraformaldehyde (PFA, PBS)의 1000 µ L를 전송 합니다.
   참고: PFA 실내 온도 균형 해야 합니다.
2. 2.9에서 생산 콜라겐과 모 세관을 찍어. PFA 솔루션으로 (대 한 ~ 5 m m) ( 그림 1C에서 같이) 클레이 모델링 5 mL 튜브의 내부 벽에는 모 세관을 탑재.
3. PFA 솔루션 (그림 1D)에 매달려 콜라겐 로드의 절반 때까지 플런저를 살짝 누릅니다. 20 분 동안 실내 온도에 튜브를 유지.
4. 다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. 모 세관을 꺼내와 PFA 삭제.
5. 신선한 관으로 모 세관을 탑재 하 고 PBS의 1 mL를 추가 합니다. 모 세관은 PBS에 몰입은 다는 것을 확인 하십시오.
6. 교원 질 막대의 절반은 솔루션에 매달려 때까지 플런저를 살짝 누릅니다. 클레이 모델링 내부 벽에는 모 세관을 탑재 합니다.
7. 5 분 동안 실내 온도에 튜브를 유지.
8. 5.4를 반복 합니다. -또 다른 2 시간 동안 5.7입니다.
9. 다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. PBS를 삭제 합니다. 차단/permeabilization 버퍼 (PBS + 1 %BSA + 0.1% 비 이온 계면 활성 제)의 1-2 mL 튜브에 전송 하 고 5.6를 반복 합니다.
   참고: BSA (1%) 5% 보조 Ab에서 발생 하는 동물의 혈 청으로 교체할 수 있습니다.
10. 30-60 분 동안 실내 온도에 튜브를 유지.
11. 다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. Permeabilization 버퍼를 삭제 합니다. 차단/permeabilization 버퍼에 1 차적인 항 체의 200-500 µ L를 전송 하 고 솔루션으로 막대를 퇴 학 시켜도.
12. 1 시간에 대 한 실 온에서 튜브를 유지.
13. 5.4에 설명 된 대로 3 번 PBST (PBS + 0.1-% 비 이온 계면 활성 제)와 함께 교원 질 막대를 씻어. -5.8입니다.
14. 실 온에서 1 h에 대 한 차단/permeabilization 버퍼에 이차 항 체에 막대를 품 어. 빛에서 그것을 유지.
15. 5.4에 설명 된 대로 콜라겐 로드 3 회 PBS로 세척. -5.8입니다.
16. 다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. PBS 영상까지 샘플을 하십시오.
17. 3에 설명 된 대로 샘플을 검사 합니다.

결과

T 세포 마이그레이션 중 돌출 형성 걸 의존 하는 매우 역동적인 프로세스입니다. 기본 인간 CTL의 돌출 형성을 시각화 하려면 우리는 뚜렷이¹¹전에 설명한 대로 CTL에 말라 골격을 mEGFP 융합 단백질 페. Transfection, 후에 1 일 셀 콜라겐 매트릭스에 포함 했다. 이미지 스택 인수 했다 모든 40 단계-빛-시트 현미경을 사용 하 여 37 ° C에서 1 µ m의 크기와 함께 s. 같?...

토론

대부분 체 외에서 분석 vivo에서 세포, 면역 세포 특히 주로 3D microenvironment을 경험 하는 반면 2D 표면, 세포 배양 배지, 페 트리 접시 또는 coverslips, 예를에 밖으로 수행 됩니다. 증거를 신흥 면역 세포의 이동 패턴 2D 및 3D 시나리오¹⁷사이 다 보여줍니다. 또한, 종양 세포의 식을 프로필은 2D 및 3D 교양 조직^18,,19

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibricol, bovine collagen solution	Advanced Biomatrix	#5133-20ML	Collagen matrix
0.5 M NaOH Solution	Merck	1091381000	for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agarose	Affymetrix	32821-10GM	Sample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit	Thermo Fisher	11348D	Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation	Thermo Fisher	11132D	Activation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2	Thermo Fisher	PHC0023	Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kit	Lonza	V4XP-30XX	Transfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgG	Abcam	ab124904	IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Thermo Fisher	A22284	IF
CellMask Orange Plasma membrane Stain	Thermo Fisher	C10045	Fluorescent cell label
Tween 20	Sigma	P1379-250mL	IF
Triton X-100	Eurobio	018774	IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline	Thermo Fisher	14190250	IF
Bovine serum albumin	Sigma	A9418-100G	IF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit	Thermo Fisher	A-11011	IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy)	Zeiss	N.A.
Cell culture hood	Thermo Fisher	HeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i	Thermo Fisher	N.A.
Centrifuge 5418 and 5452	Eppendorf	N.A.
Pippettes	Eppendorf	3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tips	VWR	89079-444, 89079-436, 89079-452
15 mL tubes	Sarstedt	62.554.002
Capillaries 50 µL	VWR (Brand)	613-3373	Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillaries	VWR (Brand)	BRND701934	"Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stips	Merck	1095430001	to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringes	BD	Z230723 ALDRICH	Alternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7)	Play-Doh	N.A.
Imaris file converter	Bitplane	available at http://www.bitplane.com	Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)	Bitplane	available at http://www.bitplane.com	Analysis of 3D and 4D imaging data