드롭릿 기반 미세 접근 및 단일 가닥 DNA Amplicons 위한 스피어 PCR 증폭

요약

이 작품에는 미세 물방울 기반 플랫폼의 제조와 스피어 PCR 확대를 위한 polyacrylamide 스피어의 응용 프로그램에 대 한 방법을 제공 한다. 스피어 PCR 방법 단일 가닥 DNA amplicons 이중 가닥 DNA를 분리 하지 않고 얻을 수 있습니다.

초록

드롭릿 기반 마이크로 제어 크기와 취득된 스피어의 형태를 제공 하는 미세 채널에서 균질 스피어의 안정적인 생산 가능 스피어 acrydite DNA 프로브 copolymerized 성공적으로 조작 했다. 비대칭 PCR, exonuclease 소화와 streptavidin 입히는 자성 구슬에 격리 같은 다른 방법은 단일 가닥 DNA (ssDNA) 합성에 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법을 효율적으로 많은 양의 매우 순화 된 ssDNA 사용할 수 없습니다. 여기, 우리가 어떻게 ssDNA 수 수 효율적으로 증폭 및 구분 dsDNA에서 단순히 PCR 반응 관에서 pipetting 스피어-PCR 프로토콜을 설명 합니다. SsDNA의 증폭 DNA microarray 및 DNA SELEX (지 수 풍부에 의하여 ligands의 체계적인 발전) 프로세스에 대 한 잠재적인 약으로 적용할 수 있습니다.

서문

단일 가닥 DNA (ssDNA) DNA-DNA 교 잡^1,2에 대 한 본질적인 속성 때문 분자 인식 요소 (MRE)으로 광범위 하 게 고려 하고있다. SsDNA 합성 시스템의 개발 생물학 응용 DNA microarrays³, oligotherapeutics, 진단 및 보완 상호 작용^4,5에 따라 통합 분자 감지 등 발생할 수 있습니다.

날짜 하려면, 마이크로미터 스케일 폴리머 입자는 성공적으로 시연 미세 장치를 사용 하 여. 여러 미세 기술 아닌 환경^6,7연속 흐름에 매우 동질적인 스피어를 생산에 대 한 강력한 것으로 입증 되었습니다.

이 외 의 연구에서 ⁸, copolymerizable 올리고 스피어와 ssDNA 증폭의 미세 합성에 대 한 미세 물방울 기반 플랫폼으로 알려졌다. 2 개의 PDMS (입니다) 층의 미세 플랫폼 구성: 스피어 및 아래쪽 평면 부분을 생성 하기 위한 미세 채널 네트워크와 위쪽 부분. 이 세 종류의 PDMS 유체 채널 구성: 1) 물방울 생성에 대 한 채널, 2)는 뱀 두 가지 솔루션, 혼합 채널과 채널 3)는 연속 중 합 스피어 응고에 대 한 초점을 맞추고 흐름. 일단 2 개의 혼합할 수 없는 흐름 PDMS 유체 채널에 소개는, 좁은 구멍 구조를 통해 흐름을 강제로 있습니다. 채널 형상, 유량, 점도 등 흐름 동작 크기와는 스피어의 형태에 영향을 줍니다. 따라서, 주요 액체 스트림 미 monospheres^9,10으로 나눌 수 있습니다.

여기, 자세한 스피어-PCR 프로토콜 ssDNA의 증폭에 대 한 제공 됩니다. 첫째, 미세 물방울 기반 장치 설계 과정을 설명 합니다. 그런 다음, 어떤 polyacrylamide에 스피어 수 수 functionalized 무작위 DNA 템플렛으로 보완 하는 방식에서 하는 방법 설명 했다. 마지막으로, 스피어-PCR 프로토콜 ssDNA를 증폭에 대 한 표시 됩니다.

프로토콜

1입니다. PDMS 미세 플랫폼의 제조

1. 베이스 폴리머와 볼륨의 비율은 10: 1에 촉매를 혼합 하 여 액체 PDMS prepolymer의 20 mL를 준비 합니다. 미세 네트워크의 위쪽 부분에 대 한 실리콘 웨이퍼에 준비 수 8 금형에 액체를 PDMS의 10 mL를 붓으십시오. 아래 평평한 부분에 대 한 같은 양의 액체 PDMS 몰드 구조 없이 실리콘 웨이퍼에 붓는 다.
   참고: 미세 네트워크 설계 CAD 프로그램에 및 다음 일반적인 포토 리소 그래피 과정 (참조 추가 숫자)를 사용 하 여 마스터를 조작 하기 위해는 포토 마스크를 변환. 이 마스터는 실리콘 웨이퍼¹¹에 부정적인 감광 수-8 형의 구성입니다.
2. 핫 플레이트에 치료 30 분 동안 75 ° C에 액체 PDMS prepolymer와 코팅 2 실리콘 웨이퍼를 배치 합니다.
   1. 수동으로 수-8 형에서 치료 PDMS 레이어를 벗기다. 1.5 m m 직경 구멍 구멍을 뚫는 도구 매크로 액체 샘플 미크론 규모 흐름 채널 인터페이스 복제 미세 네트워크에 오일 포트를 라운드를 맞춥니다. 펀치 구멍을 통해 밖으로 수동으로.
   2. 펀칭 두 솔루션 및 출구 포트의 형성에 대 한 세 번 과정 반복.
3. 상단 및 하단 PDMS 레이어 샘플 당 몇 초 동안 휴대용 코로나 처리기¹² 를 사용 하 여 친수성 표면 처리를 수행 합니다.
   1. PDMS PDMS 접합 과정에 대 한 뜨거운 접시를 사용 하 여 30 분 동안 두 개의 플라즈마 치료 PDMS 레이어 및 90 ° C에서 열을 스택. 구조 결합 및 누설 테스트 조작된 장치에 대 한 3 개의 입구 포트에 주사기 펌프를 사용 하 여 압력된 물 공급.

2입니다. Polyacrylamide 올리고 스피어의 생산

1. 준비 구슬-혼합 표 1에 자세히 설명 합니다.
2. 소용돌이 짧게 분리기 표준 ssDNA acrydite 프로브 (Ap, 100 μ M) 및 acrylamide:bis (19:1) 재고 솔루션을 표시.
3. 솔루션을 준비 나 혼합 하 여 40% 아크릴의 25 μ 두번째 솔루션, ssDNA (acrydite 프로브)의 10 μ, 10 μ (1.1 M Tris 900 m m borate; 25 mM EDTA), 5 x TBE 버퍼의 물 5 μ. 20% 염화 persulfate의 50 μ와 솔루션 II를 준비 합니다.
4. 2 준비 주사기 개별적으로 어 솔루션 II, 솔루션으로 가득 하 고 미세 플랫폼에 솔루션 흐름을 소개 하는 펌프에 탑재. 미네랄 오일 0.4% 혼합 준비 TEMED는 스피어의 표면 응고에 대 한.
   참고: TEMED 자유 래 디 칼 안정제로 유명 하다. 자유 래 디 칼 아크릴 중 합을 진작 하기 위해 암모늄 persulfate (AP)와 폴리머 형성의 속도 가속화할 수 있습니다.
5. 지속적인 흐름을 생성 하기 위해 미네랄 오일의 4 mL 유리병을 채우십시오.
6. 미세 저수지 유리 병의 모자에 있는 2 개의 포트를 2 개의 튜브를 삽입: 공기 압축기 및 마이크로 채널 네트워크에 압력된 유를 공급 액체 포트에서 유리 병에 압축 공기를 적용 하기 위한 공기 포트 유리 병. 관 유리 제 병 및 미세 장치에 오일 포트 사이 연결 합니다.
   1. 주사기 펌프에서 두 솔루션을 공급 하기 위하여 미세 장치에서 두 개의 솔루션 포트에 튜브를 연결 합니다. 삽입 튜브 출구 포트를 비 커에 생성 된 스피어를 전송.
7. 0.4-0.7 mL/h. 조정 압축 공기 압력 레 귤 레이 터 (82-116 kPa)를 사용 하 여 압축기의 주사기 펌프의 유량을 설정 합니다. 뜨거운 접시에 유리 비 커에 자력 막대의 회전 속도 (500 rpm)를 설정 합니다. 주사기 펌프 하며 전자기 밸브¹³의 ON/OFF 제어를 사용 하 여 유리 병에 외부 압축기에 의해 생성 된 압축 공기를 공급 한다.
8. 디지털 현미경으로 흐름 초점 기하학에서 스피어의 형성 및 유리 비 커에 생성 된 스피어의 응고를 준수 합니다.
   참고: 크기와 생산 속도 스피어의 솔루션 및 미네랄 오일 흐름에 대 한 적용 압력 flowrate에 따라 (표 2).

3. 수행 Polyacrylamide 올리고 스피어 계산

1. Hemocytometer 정량화에 대 한 유리 hemocytometer에 polyacrylamide 올리고-스피어와 장소의 수성 해결책의 작은 금액 (약 100 μ) 고 부드럽게 세 챔버의 잘 스피어 정지를 채우기.
   주: 자세한 내용은 http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer를 참조 하십시오.
2. 현미경과 손을 집계 카운터를 사용 하 여 16 사각형의 한 세트에 스피어를. 그리고 챔버의 다음 세트는 hemocytometer 이동 16 코너의 모든 4 개의 집합 계산 됩니다 때까지 계산을 수행 합니다.
3. 평균 스피어 개수를 확인 하 고 원래는 구슬에에서 스피어의 수를 계산.
4. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 스피어의 100 μ를 전송. (400 x g) centrifuging 부드럽고 pipetting 통해 상쾌한을 제거 합니다.

4. Polyacrylamide Oligomicrosphere의 표면에 DNA 교 잡 수행

참고: 한 동일한 DNA 조사는 5'-NH₂-5'-acrytide 수정 대신 그룹 추가 솔루션으로 나 동시에 Ap를 포함 하는 스피어에 대 한 테스트. DNA 교 잡 결과 그림 2에 표시 됩니다. 어두운 방에 Cy3 표시 보완 oligonucleotide 프로브 (모자) 솔루션을 두어야 한다.

1. Cy3 모자 1xTE 버퍼의 100 μ를 사용 하 여 resuspend (TE 버퍼: 10 mM Tris 및 1μM EDTA, pH 8.0) 100 μ M의 최종 농도 달성 하기 위하여. 예를 들어 테 버퍼와 알루미늄 호 일로 덮여 microcentrifuge 튜브에 100 mL에 1 pmol 캡의 resuspend.
   주: 스트랜드 시퀀스 표 3를 참조 하십시오.
2. Ap copolymerized 스피어를 포함 하는 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 100 μ M의 Cy3 모자를 추가 합니다.
3. 몇 번 튜브를 가볍게 혼합 하 고 1 시간에 대 한 어둠 속에서 실 온에서 품 어.
4. 삭제는 상쾌한 고 pipetting 통해 잔여 버퍼를 제거 합니다.
5. TE 버퍼의 500 μ로 세 번 씻어.
6. Microcentrifuge 튜브를 부드럽게 눌러 스피어를 resuspend. 그런 다음 단계 4.4 반복 합니다.
7. 유리 슬라이드 (75 m m x 50 m m)와 이미징 이전 알루미늄 호 일 덮개에 스피어를 놓습니다.

5. 비대칭 PCR ssDNA를 증폭에 대 한

1. 분석할 ssDNA를 증폭에 대 한 비대칭 PCR 시 약 믹스를 준비 합니다. 얼음에 표 4 에서 시 약 녹여 얼음, Taq 중 합 효소 효소 (50 U / µ L)를 유지 하지 않습니다 하지만 오히려 필요할 때까지-20 ° C에서 그것을 저장.
2. 부드럽게 소용돌이 모든 시 약 후 간단히 원심 10000 x g 10에서 튜브와 s.
3. 에 설명 된 대로 모든 시 약을 결합 표 4.
4. 샘플을 thermocycler에 놓고 다음과 같은 조건에서 비대칭 PCR을 시작: 25 주기 (95 ° C 30에 대 한 s, 52 ° C 30에 대 한 s, 그리고 30 대 72 ° C s), 5 분, 85 ° C 4 ° c.에서 개최

6입니다. 스피어-PCR ssDNA를 증폭에 대 한

참고:이 섹션에서는 PCR 반응 관에 ssDNA를 증폭에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 스피어 PCR 반응 반응 볼륨의 50 μ에서 수행 했다. SsDNA를 증폭 하는 데 사용 하는 자세한 시퀀스는 표 5에 나열 됩니다. 이 경우에, 스피어의 표면에 Ap 상호 보완적인 방식으로 무작위 DNA 템플릿에 anneal 수 있습니다. 이 보완 DNA 가닥 (센스 DNA 가닥, 그림 3) 생산을 위한 매우 중요 한 단계입니다. 확장 하는 DNA는 스피어 PCR 증폭에 대 한 템플릿으로 사용 됩니다.

1. 스피어 PCR 시 약 믹스를 준비 합니다. 얼음; 표 6 에서 시 약을 녹여 그러나, Taq 중 합 효소 효소 얼음에 보관 하지 마십시오. -20 ° C까지 필요에 그것을 저장 합니다.
2. 부드럽게 소용돌이 모든 시 약 후 간단히 원심 10000 x g 10에서 튜브와 s.
3. 미세한 계산을 통해 약 25 스피어를 얻을.
   참고: 한 반응 관에서 스피어의 수 40 X 확대와 함께 가벼운 현미경을 사용 하 여 계산 됩니다. 약 25 스피어는 스피어 PCR 증폭에 사용 됩니다. 더 자세한 정보는 3 단계.
4. 에 설명 된 대로 모든 시 약을 결합 표 6.
5. 샘플을 thermocycler에 놓고 다음과 같은 조건에서 비대칭 PCR을 시작: 25 주기 (95 ° C 30에 대 한 s, 52 ° C 30에 대 한 s, 그리고 30 대 72 ° C s), 5 분, 85 ° C 4 ° c.에서 개최
6. 다음 증폭, 버퍼 로드 x 6의 8 μ를 추가 하 고 각 샘플의 15 μ 2 %agarose 젤으로 로드. 다음, 1에서 35 분 100 V에서 전기 영동을 수행 x TAE (트리 스-아세테이트-EDTA, 40mm 트리 아세테이트, 1 m m EDTA, pH 8.2) 버퍼.

7. confocal 현미경 검사 법 수집

참고: 스피어 DNA 프로브 교 잡의 결과 confocal 현미경 아래 몇 군데. 이미지 분석 ImageJ를 사용 하 여 수행 됩니다.

1. 현미경의 단계로 교배 스피어를 수정 했다.
2. (헬륨/네온 레이저, 543 nm 선) 레이저를 선택 하 고 레이저 제어에서 그것을 켜십시오.
3. 현미경 제어에서 대물 렌즈를 선택 합니다.
4. Cy3 및 채널 구성 제어에서 원하는 필터를 선택 합니다.
5. 실험을 시작 하 고 샘플을 관찰. Confocal 현미경에 대 한 설정은 표 7에 요약 되어 있습니다.

결과

2 개의 PDMS 층 (그림 1a) 조립된 고분자 드롭릿 기반 미세 플랫폼에 의하여 이루어져 있다. 미세 채널 네트워크의 3 종류 스피어를 생성 하는 데 사용 된다: 1) 흐름 초점 기하학과 같이 그림 1b, 2)는 사 문석 어 솔루션 II, 솔루션을 혼합에 대 한 채널과 채널 3) 합 스피어에 대 한 응고입니다. 모든 채널의 높이 60 μ m 이었다. 혼합 및 ...

토론

DsDNA의 오염 물질 ssDNA 증폭에 큰 문제입니다. 기존의 비대칭 PCR 증폭¹⁵dsDNA 증폭을 최소화 하기 어려운 남아 있다. 또한, ssDNA를 생성 하기 위한 기술적인 개선 샘플 처리량의 효율성을 증가 있게가지고, 비록 ssDNA 절연의 높은 비용 및 불완전 한 정화 수확량 때문에 여전히 문제입니다.

비대칭 PCR ssDNA를 작업할 때 사용 하는 가장 어려운 방법 중 하나입니다. 이 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
liquid polydimethylsiloxane, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Components of chip
40% Acrylamide:bis solution (19:1)	Bio-rad	1610140	Components of Copolymerizable oligo-microsphere
Ammonium persulfate, APS	Sigma Aldrich	A3678	Hardener of acrylamide:bis solution
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED	Sigma Aldrich	T9281	Catalyst of ammonium persulfate
Mineral oil	Sigma Aldrich	M5904	Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents
Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes	Bioneer	synthesized	Table 3. Sequence information
ssDNA acrydite labeled probe	Bioneer	synthesized	Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents
Tris	Biosesang	T1016	Components of TE buffer, pH buffer solution
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)
Ex taq	Takara	RR001A	ssDNA amplification
Confocal microscope	Carl Zeiss	LSM 510	Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface
Light Microscope	Nikon Instruments Inc.	eclipse 80i	Caculating number of microspheres
T100 Thermal Cycler	Bio-rad	1861096	ssDNA amplification
Hand-held Corona Treater	Electro-Technic	BD-20AC Laboratory Corona Treater	Hydrophilic surface treatment
Hot plate	As one	HI-1000	heating plate for curing of liquid PDMS
Syringe pump	kd Scientific	78-1100	Uniform flow of Solution I and Solution II
Compressor	Kohands	KC-250A	Flow control of Solution III
Bright-Line Hemacytometer	Sigma Aldrich	Z359629	Caculating number of microspheres