신선한 냉동 인간 조직에서 장의 중추의 격리에 대 한 레이저 캡처 서의 최적화

요약

이 프로토콜의 목표에서 고정, 갓 절제 인간의 창 자 조직 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여 격리 장 중추에서 높은 무결성 RNA 샘플을 얻을 것입니다. 이 프로토콜 포함 플래시-냉동 인간 창 자 조직, cryosectioning, ethanolic 얼룩 및 탈수, LCM, 샘플 준비 및 RNA 추출.

초록

이 방법의 목적은 고정, 갓 절제 인간의 창 자 조직 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여에서 수집 하는 장 신경에서 높은 무결성 RNA 샘플을 얻을 것입니다. 5 단계 워크플로에서 RNA-이 대 한 충분히 높은 품질과 수량 장의 중추에서 RNA 분리를 얻기위한 중요 한를 확인 했습니다. 첫째, 준비할 때 장 조직, 각 샘플 아래쪽 큰 기본 금형의 가능한 serosa 병합 전에 blotting에 의해 제거 하는 모든 초과 액체를가지고 있어야 합니다. 다음 샘플 2 methylbutane 드라이 아이스의 슬러리 꼭대기 신속 하 게 고정 됩니다. 둘째, 조직 단면, 그것 장 섹션 슬라이드 당 장 신경의 가장 큰 표면 영역을 양보 함으로써 myenteric 총의 전체 평면 병렬 cryomolds 위치에 중요 하다. LCM, 폴 리 에틸렌 napthalate (펜) 중 세 번째-최고의 속도 장의 중추를 수집 하는 때 장 중추의 비균일 도형의 윤곽에 유연성을 제공 하는 막 슬라이드. 넷째, 섹션 내 장 신경의 고유한 시각화를 위한 Cresyl 바이올렛 같은 에탄올 호환 염료 수성 염료를 기준으로 RNA 무결성의 우수한 보존을 제공합니다. 마지막으로, 캡처된 중추에서 RNA 추출, 우리는 DNA 오염을 제거 하는 동안 우수한 RNA 수량 나왔고 상업적인 RNA 추출 키트와 품질, 차이점 관찰. 현재 프로토콜에서 이러한 요소의 최적화 크게 워크플로우를 가속화 하 고 뛰어난 RNA 품질 및 수량 장의 중추 샘플을 생성 합니다.

서문

이 메서드는 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여 인간의 창 자 조직에서 장의 중추의 높은-품질 RNA 샘플을 얻기 위해 설계 되었습니다. 여기에 설명 된 프로토콜 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)에 대 한 충분 한 RNA 품질 및 수율을 제공 하도록 최적화 된 하며 갓 절제, 고정, 플래시-냉동 인간 창 자 조직으로 사용 될 것입니다.

기능성 위장 하 고 본질적인 운동 성 장애는 미국에서 4 명 중 하나에 영향을 줍니다. 장 신 경계 (ENS), 두 번째 뇌¹라고도 종종 이러한 장애의 중심에 직감 항상성 및 운동에 중요 한 역할. 창 자 운동 성의 조작 일반적으로 aganglionic/noncontractile 조직, 만성 식이 수정 및/또는 약물의 외과 절제술으로 제한 되었습니다. 놀랍게도, 성인 팔의 전체 transcriptome 시퀀싱 할 약물 타겟 줄기 세포 치료에 활용 될 수 있는 ENS 내의 분자를 식별 하는 우리의 기능을 크게 제한 남아 있습니다.

인간의 장 중추에서 RNA를 분리 하는 데 상대적으로 몇 가지 방법이 있다. 첫 번째 접근 방법, 셀 분리², 필요 높은 부 화 온도 및 긴 보육 시간; 모두는 RNA 저하를 촉진 하 고 변경 transcriptome^2,3으로 알려져 있습니다. 다른 접근 방법, LCM, 더 안정적으로 transcriptome를 유지 하 고 RNA 무결성 보호. 이러한 방법 중 가난한 RNA 품질 및 수량에 의해 방해 했다, 아주 노동 집약, 여러 연구는 사용 하지만 LCM 신선한-냉동 인간 창 자 조직^4,,56에서 중추를 수집, 또는 얼룩 또는 RNA 추출 기술을 우리의 손에서 일의 필요한 수정. LCM 제품 설명서 제공 장의 중추^8, 의 분리에 적용 될 때 추가 개선^7,8, 하지만 적응 필요에서 발견 된 다른 LCM 프로토콜 RNA를 보존 하기 위한 ⁹. 이러한 이유로 우리는 최적화 된 프로토콜을 기반으로 이러한 리소스에는 인간의 장 중추에서 상당한 양의 높은 무결성 RNA 생성, 상대적으로 빠른 워크플로우, 그리고 대형에 걸쳐 일관 된 결과 생성을 개발 샘플의 수입니다.

이 연구에서 우리는 절제 인간의 창 자 조직에서 공급 하는 장 신경에서 높은 무결성 RNA의 분리를 용이 하 게 하는 최적화 된 절차의 개요를 제시. 우리의 방법 5 가지 중요 한 측면을 통합합니다. 첫째, 갓 절제, 고정 되지 않은 인간의 장 샘플 크기, 모든 과잉 습기 실험실 티슈로 제거 하 고 2-methylbutane (2 MB)과 드라이 아이스의 슬러리 꼭대기 플래시-냉동 하기 전에 큰 기본 몰드에 평평 하 게 손질 한다. 내장의 두 번째, 더 섹션 장의 중추의 큰 페이로드를 제공 하는 슬라이드에 myenteric 총의 전체 평면을 얻기 위해 준비 되어야 한다. 성공이 단계는 조직 준비 과정에 크게 의존 합니다. 셋째, 중추는 존재에의 비균일 구조 폴 리 에틸렌 napthalate (펜) 막 슬라이드⁶, LCM 과정에서 최고의 속도 정밀도 제공 하는 사용을 해야 합니다. Cresyl 바이올렛 등 4, 에탄올 호환 염료 장의 중추 얼룩 동안 RNA 무결성을 유지 하기 위해 사용 되어야 한다. 마지막으로, RNA 추출 과정은 RNA-시퀀스와 성공적인 결과 위해 중요 한 우리는 높은 RNA 무결성, 장 신경의 작은 컬렉션을 시작할 때 RNA 수율을 극대화, DNA 오염 제거 하 고 가능한 많은 RNA 종 유지 RNA 추출 방법을 모색.

함께 찍은, 현재 연구에서 이러한 요소의 최적화 크게 가속 워크플로 및 장의 중추 뛰어난 RNA 수량 및 품질의 샘플을 생성. 결과이 접근의 일관성을 나타내는 샘플의 상당한 그룹 간에 크게 일관 되었습니다. 또한, 이러한 접근 수십 장의 중추에서 RNA 샘플을 성공적으로 시퀀싱을 사용 했습니다. 여기에서 강조 하는 전략 수행 원하는 중추의 LCM 또는 주변 장치 및 중앙 신 경계와 높은-품질 RNA의 절연이 필요한 다른 경우의 핵에 대 한 광범위 하 게 적응 수 있습니다 또한.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 프로토콜에 의해는 밴 더 빌 트 대학 기관 평가 위원회 (IRB) 승인 있다.

1입니다. 조직 도착 전 준비

1. 적절 한 IRB 승인을 하 고 연구에 필요한 모든 연구 조건을 만족 하는 기증자 로부터 갓 절제, 떼어낸 장 조직을 얻기 위해 인간 장기 기증 기관 조정.
   참고:이 프로토콜 쥐 및 다른 설치류 모델 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다.
   1. 즉시 각 장 세그먼트의 절제, 따라 철저 하 게 냉장된 PBS 또는 조직 저장 매체 잔여 luminal 자료 또는 배설물 제거 루멘 플러시.
   2. 홍 조 및 적절 한 생물 소켓에 폐기물 폐기, 후 충분 한 양의 조직을 저장 매체 (예: 3-5 회 장 조직의 볼륨)에서 조직 잠수함 하 고 개별적으로 표시, 방수 플라스틱에 저장 컨테이너, 얼음에 빠져들 또는 사용까지 냉장).
   3. 상당한 RNA 저하를 방지 하기 위해 컬렉션의 시간 18-26 시간 이내 조직 프로세스.
      참고: 장 세그먼트 및 스토리지의 청결에 따라 수 있습니다 우리의 제안된 시간 제한 확장.
2. 이 프로토콜에 표시 된 대로 사전에 인간의 조직 컬렉션에 필요한 모든 자료를 준비 (더 자세한 제품 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조). 개인 보호 장비는 착용 모든 필요한 모든 있는지 확인 합니다.
3. 그림 1에서 보듯이 드라이 아이스 드라이 아이스 슬러리 함께 양동이 준비 합니다.
   1. 4 표준 원형 얼음 양동이 한 직사각형 얼음 양동이를 채우기 충분 한 드라이 아이스 크 러시. 표준 양동이 작은 (11 x 21 cm) 실험실 있어야 조직 드라이 아이스의 표면에 배치. 가능 하면 실험실 조직의 새로운, 미 개봉 된 상자를 사용 하 여.
   2. 깨끗 한 직사각형 얼음 양동이에 드라이 아이스의 2 L powderizing에 의해 드라이 아이스 슬러리를 확인 합니다.
   3. 드라이 아이스의 표면까지 미리 냉장된 2 MB 추가 합니다. 약간 혼합 하 고 사각형 양동이의 측면을 따라 드라이 아이스의 더 큰 조각에 의해 포위 하는 채널에 슬러리의 모양 표면에 피 펫 팁 박스 커버를 사용 하 여 슬러리를 평평 하 게.
   4. 더 빠른 냉동을 장려 하기 위해 얼음 양동이의 가장자리를 따라 드라이 아이스의 얇은 몇 블록을 배치 합니다. 주어진된 시간에 드라이 아이스 슬러리 양동이에 느슨하게 맞게 ≥4 기본 금형 위한 공간 이어야 한다.
      1. 선택적으로, 스택 다른 사각형 얼음 통에서 얼음 양동이 드라이 아이스와 함께 ¼ 가득. 이 위치 더 드라이 아이스 슬러리를 보 온 하는 데 도움이 절차 중 드라이 아이스와 2 MB의 빈번한 조정에 대 한 필요성을 방지 한다.
   5. 다음과 같은 순서로 조립 라인에 드라이 아이스 버킷 위치: 1) 드라이 아이스 슬러리 물통, 실험실 2) 조직-드라이 아이스 물통, 3 & 4) 일반 건조 얼음 양동이, 5) 직사각형 드라이 아이스 물통 (그림 1A).

2. 플래시-냉동 인간 창 자 조직 준비

참고:이 전체 과정은 장 조직 품질에 따라 장 세그먼트 당 45-80 분 사이 걸릴 수 있습니다. RNA 품질 및 조직학 LCM와 함께 진행 하기 전에 평가를 품질 관리 샘플 수집 것이 좋습니다.

1. 젖은 얼음 대형 트레이 드라이 아이스 위에 외과 절단 보드를 놓습니다.
2. 이 설치 프로그램에서 콜드 스토리지 솔루션에서 조직 및 트림된 세그먼트를 저장 하기 위한 500 mL 및 100 mL 비 커를 진정. 티슈를 받을 준비가 되도록 미리 진정 기지도 마에 주조한 다.
3. 신선한 장 조직 받으면 부 조직 이송은 미디어 어 고 미리 냉장된 비 커에 그것을 유지. 장 조직 및 후속 단계에 대비해 트림된 세그먼트의 임시 저장소에 대 한 비이 커에 어떤 공간을 두십시오.
4. 충분 한 조직 (40-60 cm²) 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 RNA를 생성 하 고 품질 관리 샘플 제공 하 약 20 cm의 길이를 장 세그먼트를 잘라. 조직의 무결성에 따라 훨씬 더 작은 길이 (즉, 내장의 5 cm) 다운스트림 처리에 대 한 RNA 격리를 달성 하기 위해 가능한 수 있습니다.
5. 수술가 위를 사용 하 여 창 자에서 결합 조직과 멀리 지방 트림. 잔여 장 serosa 따라 많은 타협 완전히 평평 하 게 이후의 단계에서 조직 하는 능력. 신중 하 게 구조적으로 myenteric 총을 손상 하거나 단면에 고르게 평평 조직의 외관을 만들 수 있는 지방과 결합 조직의 제거 동안에 serosa nicking 피하기 조직, 정돈 한다.
6. 첨부 파일 mesenteric의 사이트에서 선호 장 샘플의 전체 길이 따라 세로 절 개를 확인 합니다.
7. 멀리 해 부 그리고 긴장에서 출시 되 고 시 더 쉽게 평면화 있도록 콜론에서 tenia 대장균을 삭제.
8. 냉장된 절단 보드에 내장 점 막 쪽 아래로 퍼짐 그리고 조직의 전체 길이에서 1.25 cm 넓은 스트립.
   참고: 장 조직 자주 확장, 트리밍 후 그래서이 크기를 적절 하 게 조정 해야 합니다.
9. 일시적으로 냉장된 조직-스토리지 솔루션에서 지구를 저장 합니다.
   참고: 우리가 사용 하 여 Belzer UW 콜드 스토리지 솔루션 긴 선반의 생명이 있다, 상대적으로 비용 효율적 이며 필요할 때까지 실내 온도에 저장 될 수 있기 때문에.
10. 콜드 스토리지 솔루션에서 조직 스트립을 제거 하 고 길이 세그먼트 ~1.5-2 c m으로 잘라.
11. 신속 하 게 실험실 물티슈, 과잉 액체를 제거 하 고 플래시 동결 중 장 serosa 따라 얼음 결정의 형성을 방지 하의 스택에 장 세그먼트 되 리. 조직 충분히 건조 하지 그것은 myenteric 총에서 높은-품질 섹션을 얻기 어려울 것 이다.
12. 미리 냉장, 대형, 일회용 플라스틱 기본 몰드 (24 m m x 5 m m x 37)에 얼룩이 장 조각 점 막 측 하다.
13. 신중 하 게 가볍게 기본 몰드의 표면 조직을 스트레칭 하 고 부드럽게 눌러는 serosa 아래 갇혀 있을 수 있습니다 모든 공기 방울을 추방 하 곡선된 겸 자 사용 하 여 각 세그먼트를 평평 하 게. 참고 병합 하는 동안 조직 확장입니다. 필요한 경우, 세그먼트를 트림 하 고 나머지 샘플 작은 크기로 잘라.
    참고: 조직 이상 뻗어 이면이 myenteric 총을 왜곡 됩니다. 모든 기포를 제거한 후 동결 이전 샘플의 두께 평가 합니다. 필요한 경우 장 샘플 접근 그것의 원래 두께 때까지 견본 안쪽의 가장자리를 밀어.
14. 드라이 아이스, 2 MB 슬러리의 표면에 로드 기본 몰드를 놓습니다. 조직 크기와 장 세그먼트의 두께 따라 30-60 s 내에서 완전히 고정 해야.
15. 드라이 드라이 아이스의 두 번째 양동이에 미리 냉장 실험실 조직에 신속 하 게 기본 몰드를 문 지르고 하 여 잔여 2 MB를 제거 하려면 기본 몰드의 하단.
16. 드라이 아이스의 세번째 욕조에 말린된 샘플을 전송 하 고 포장 준비가 될 때까지 드라이 아이스의 표면 아래에 묻어.
17. 신속 하 게 포장, 샘플 준비의 품질 검사를 하기 전에 기본 몰드의 하단을 관찰 합니다. 적어 평면 표시 하지 않거나 큰 기포가 샘플으로 이들은 cryosectioning와 LCM에 대 한 피해 야 한다.
18. 완전히 냉동 보관 하는 동안 발생 하는 조직의 배치 되도록 양동이에 드라이 아이스 위에 누워 미리 레이블이 알루미늄 호 일에 샘플 랩.
19. -80 ° c.에 저장 하는 동안 조직의 탈수를 최소화 하기 위해 플라스틱 랩의 레이어와 샘플 랩
20. 그들은 냉동 고로 이동할 준비가 될 때까지 직사각형 통에 샘플을 저장 합니다.
21. 레이블을 미리 고 사전 컬렉션 후 샘플의 즉시 저장-80 ° C에서 냉동 상자를 진정.
22. LCM 실시 이전 RNA 무결성의 평가 대 한 각 장 세그먼트에서 조직의 작은 부분을 가져가 라.
    1. 사전 라벨 2 mL RNase 무료 튜브 각 세그먼트에 대 한 세포의 용 해 버퍼의 ≥500 µ L로 가득. RNA 추출 키트 재료의 테이블에에서 나열 된 "D"를 사용 하는 것이 좋습니다.
    2. 표준 조직 마이크로-균질 화기 (20-40 s, 아무 조직 덩어리 남아 때까지)에 장의 작은 (2mm x 2mm) 조각 균질 다음, 즉시 동결 RNA lysate 저장소-80 ° C에서 드라이 아이스에 RNA 추출 진행까지.
    3. 필요한 경우, 섹션의 일부에 포함 조직 동결 매체 (TFM) 백업으로. 이 섹션에 설명 된 정확한 같은 방법으로 조직 섹션을 준비 하지만 플래시 동결 이전 기본 금형 내의 TFM에 견본 잠수함.

3입니다. Cryosectioning

1. Cryosectioning, 전에 얼룩과 탈수에 대 한 모든 필요한 자료를 준비 하 고 드라이 아이스의 양동이로-80 ° C 냉동 고에서 원하는 조직 샘플을 전송 합니다.
2. 최적의 절삭 온도 (-18-22 ° c)을 100% 에탄올으로 표면 아래 닦아 하 고 블레이드를 치료에 의해 사용 하기 위해 cryostat 준비와 트레이 RNase 오염 솔루션.
3. 가장 물림 쇠를 샘플 준수, 다음 방법을 사용 하십시오.
   1. 적어도 30 대 한 드라이 아이스에 집게를 장소 장 샘플을 unwrapping 및 드라이 아이스 serosa-사이드-최대의 표면에 그것을 배치 하기 전에 s.
   2. 큰 cryostat 견본 홀더에 조직 동결 매체 (TFM)의 3-5 m m 마운드를 부 어 하 고 즉시는 TFM에 장 샘플 serosa-사이드-최대 전송.
   3. 신속 하 게 전송 견본 홀더 드라이 아이스와 powderized 드라이 아이스와 함께 커버 실 온에서 2-5 s에 대 한 샘플에 TFM을 허용한 후에. TFM은 myenteric 총의 비행기 아래 유지할 것을 인식 하시길 바랍니다.
      참고: 이상적으로, 창 자 점 막의 외부 표면 것입니다 완벽 하 게 준수는 TFM은 TFM 샘플의 해빙 없이 동결을 시작 하기 전에.
4. Cryostat의 견본 머리에 견본 홀더 탑재와 myenteric 총의 평면 절단 블레이드에 평행 하 게 될 것입니다 되도록 cryostat 블레이드, 표본을 맞춥니다.
5. 8 µ m cryostat에 단면 두께 설정 합니다. 완벽 하 게는 견본을 정렬의 목적 각 슬라이드에 myenteric 총의 가장 큰 가능한 노출 영역을 얻을 것입니다. 이 두께 일반적으로 설치류와 인간의 조직에 적합 하지만 필요에 따라 조정 될 수 있다.
6. Serosa 경도 근육 myenteric 총을 도달할 때까지 통해 섹션.
   1. Myenteric 총을 찾으려면 슬라이드에 샘플 섹션을 탑재 하 고 1 %Cresyl 보라색 또는 톨루이 블루, 등수성 염료와 섹션을 얼룩.
   2. 경도 원형 근육 층 사이의 교차점을 식별 하기 위해 X 40-2000 확대 가벼운 현미경 아래 절을 참조. 현미경 매개 변수 테이블의 자료에 제공 됩니다. 단면화의 시작에는 serosa 결합 조직의 존재에 의해 표시 됩니다. 일부 남아 있는 mesenteric 지방에서 serosa 따라 존재 수도 있습니다. 외부 경도 근육 층의 시트는 다음 시작합니다. 경도 원형 근육 층 사이 경계에 도달 하면 장 신경의 일부를 관찰 됩니다.
      참고: 다음의 몇 가지 섹션, myenteric 총 될 것입니다 매우 분명, 단일 섹션 (그림 2C) 내에서 존재 하는 신경의 큰 swaths. 조직에 없는 경우 완전히 평평한 단면 시작는 중추의 일부만 주어진된 시간에 각 섹션에 표시 됩니다. 때때로, 장 샘플 완벽 하 게 평평 하 게 나타나는 조직에도 불구 하 고 본질적으로 고르지 myenteric 총을 할 수 있습니다. 이것은 특히 십이지 샘플에 대 한 사실입니다. 우리의 경험에서 이러한 샘플 LCM, 처리 하는 데 시간이 더 오래 걸릴 수 있습니다 하지만 충분 한 RNA는 단 하루 세션 내에서 수집할 수 있습니다. Myenteric 총의 정확한 위치는 조직과 동결 이전 준비에 따라 샘플 사이 상당히 달라질 수 있습니다.
7. 신경 및 슬라이드 당 명과 가장 많은 수를 제공 하는 최적의 컬렉션 lcm, 직렬 섹션을 수집 시작 합니다. 샘플의 표면적에 따라 여러 섹션 단일 펜 막 슬라이드에 결합할 수 있습니다.
8. 짧게 5-10 s cryostat 냉장 펜 막 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다. 장착, 조직 해야 녹여 약간, 극대로 RNA 무결성을 유지 합니다.

4. 얼룩

참고: 얼룩 프로세스의 개요, 표 1을 참조. 모든 솔루션에 사용 되는 표준 50 mL 원뿔 튜브에는 준비가 되어 있습니다. RNase 오염 솔루션 튜브의 외부를 치료 결과 (데이터 표시 되지 않음)을 개선 하기 위해 표시 되지 않습니다.

1. 최소 1 일 사전에 95% 에탄올에 4 %Cresyl 바이올렛의 포화 솔루션을 준비 하 고 완전히 다시 Cresyl 바이올렛 주사기를 로드 하기 전에 일시 중단.
   참고: 에탄올의 농도 해야 효과적인 얼룩에 대 한 하향 조정 될 토론 섹션에 설명 된 대로 합니다. RNA 무결성 감소 크게 얼룩 동안 50% 또는 75% 에탄올을 사용 하 여 있는지 여부를 테스트 하지 했습니다. Cresyl 바이올렛 빛에 민감한 이며 따라서 빛 으로부터 보호 되어야 한다.
2. 슬라이드에 myenteric 총의 섹션을 장착 후 즉시 30 (사전-20 ° C에서 냉장) 95% 에탄올의 원뿔 유리병에 슬라이드를 잠수함 s.
   1. 섹션은 이전 단계에서 슬라이드에 완전히 고착 하지 않았다, 경우 약간 gloved 손 (실험실 지우기 한다 배치 사이 슬라이드와 장갑), 95% 에탄올에 잠수 하기 전에 전체 준수에 대 한 슬라이드의 하단을 따뜻한. 이 솔루션은 RNA 무결성을 감소 하지 않고 적어도 3-6 슬라이드 다시 사용 될 수 있습니다.
3. 사전 처리, RNase 무료 컨테이너⁸위에 배치 실험실 지우기에 슬라이드 얼굴 위로 하다.
4. 미리 4 %Cresyl 바이올렛과 3 mL 주사기를 0.2 µ m 주사기 필터 첨부.
   참고: 셀 루 로스 아세테이트 필터를 좋습니다.
5. 6-10 방울 직접 조직 섹션⁸ 에 얼룩을 적용 하 고 10-30 s, 또는 충분 한 염료까지 품 어 때 유지는 드 물. 얼룩, 하는 동안 부드럽게 손으로 조직 단면도 얼룩으로 입힌 균등 하 게 되도록 슬라이드 컨테이너 회전.
6. 얼룩과 즉시 부 어 드 75% 에탄올의 유리병에 슬라이드 얼룩. 초과 염료는 주로 샘플의 새 어 때까지 반복적으로 슬라이드 잠수함. 이것은 10-20 s 사이 걸릴 수 있습니다.
7. 취소 반복적으로 담거 서 95% 에탄올의 유리병에 샘플 10 s. Submerge 샘플에 대 한 반복 모든 초과 얼룩 제거 되었습니다 때까지 얼룩 마무리.
   1. 중추의 얼룩을 최적화 하기 위해 필요에 따라 destaining 기간을 수정 합니다. 너무 많은 얼룩을 제거 하는 경우 샘플 되 너무 투명 하 고 시각화 하는 것이 어려울 수 있습니다.
      참고:이 얼룩 프로토콜 최적화 되었습니다 여러 간행물^5,8,10,11 만족 스러운 결과 가져온 전에 수정 요구에 따라. 따라서, 염료 그리고 destaining 프로세스 동안 사용 되는 에탄올의 농도 때 최적의 결과 얻기 위해 필요한에, 수정할 수 합니다.

5입니다. 탈수

1. 바로 찍어 100% 에탄올에 슬라이드 2-3 번, 10-20 s의 총.
2. 적어도 30 무수 100% 에탄올에 슬라이드 잠수함 s. 무수 에탄올은 매우 검 습기, 흡수 물을 제거 하 고 따라서 샘플⁵을 더 완전 하 게 탈수 하는 절차의 시작 전에 100% 에탄올의 유리병에 분자 체 (8-12 메시)를 추가 합니다.
3. 반복 해 서 15-20 s 크 실 렌에 슬라이드 찍어. 이 단계는 완벽 하 게 슬라이드에 에탄올의 레이어를 제거합니다. 크 실 렌, 완전히 adsorb 초과 에탄올과 물 분자⁵의 튜브를 미리 분자 체를 추가 합니다.
   주의: Xylenes 눈과 상부 호흡기 자극으로 분류 하 고 화학 증기 두건에서 사용 해야 합니다.
4. 적어도 10 분 동안 (분자 체, 8-12 메쉬)와 크 실 렌에 슬라이드 잠수함
   참고: 필요한 경우이 단계 후 짧은 휴식을 취할 수 있습니다. 샘플 크 실 렌에 해로운 효과 없이 4-5 시간에 대 한 얼룩, LCM 또는 RNA 수율/무결성을 남아 있을 수 있습니다.
5. 선택적으로, 개별적으로 시점에서 몇 가지 추가 슬라이드를 준비 합니다. 모든 준비 슬라이드에 LCM을 완료 한 후 슬라이드의 두 번째 라운드를 준비 하는 경우는 cryostat에서 조직 수 표면이, 조직 표면의 탈수 때문에 해야 합니다. 1 ~ 4 섹션 사용할 섹션 수집 될 수 있습니다 전에 삭제 될 필요가 있습니다.

6. 레이저 캡처 기정 (LCM)

1. 크 실 렌에서 슬라이드를 제거 하 고 LCM 현미경 단계에 LCM 캡의 적어도 1 분 삽입 카트리지를 위한 화학 증기 두건에서 건조. 무대에 슬라이드를 로드 하 고 슬라이드의 개요 이미지 확보.
2. LCM에 대 한 원하는 위치를 확인 하 고 슬라이드에 모자를 로드 합니다.
3. 적외선 (IR) 레이저를 정렬 하 고 그것의 전원 및 기간 20-30 µ m 직경 캡처 자리 수 있도록 조정 합니다.
4. 자외선 (UV) 레이저를 찾아서 적절 한 절삭 속도 강도 설정 합니다.
5. LCM 소프트웨어, 모자 (녹색 원으로 소프트웨어 프로그램의 슬라이드 개요에 묘사 된)에 수집 영역의 경계 내에 있는지를 사용 하 여 수집을 원하는 중추를 설명 합니다.
6. 자취의 각각에 적어도 한 IR 자리 마다 100-500 µ m IR 명소를 조정 합니다.
7. 모든 표시 된 중추의 컬렉션 진행 하 IR/UV 컷된 단추를 누릅니다.
8. 컬렉션 완료 되 면 뚜껑을 새 위치로 이동 하 고 수집 프로세스를 반복 하거나 중추 (또는 60-80 분의 권장된 시간 제한에 도달할 때까지) 뚜껑 가득 충분히 일단 QC 역에 LCM 모자를 검사 합니다.
9. 파편 모자에 있다면, 멀리 뾰족한 붓 미리 RNase 오염 제거 솔루션으로 치료, nuclease 무료 물으로 씻어 서 되었으며 완전히 건조를 사용 하 여 닦습니다.
10. 조심 스럽게 눈으로 모자를 검사 또는 모든 파편 되도록 밝은 분야 현미경 확대와 함께 제거 되었습니다. 파편은 미리 치료 페인트 브러시를 사용 하 여 제거할 수 없습니다, 경우 파편 떨어져 긁어 미세 피 펫 팁 (RNase 무료)를 사용 합니다.
11. 0.5 mL microfuge 관 RNA 세포의 용 해 버퍼 (RNA 추출 키트 "B", β-mercaptoethanol 10 µ L/mL의 농도에서 추가 버퍼 RLT)의 230 µ L로 가득에 모자를 보호 합니다.
12. 모자, 짧게 소용돌이, 반전 하 고 30 분 동안 실 온에서 품 어.
13. 5 분, 다음 전송은 microfuge 관 건조 얼음에 대 한 5000 x g ≥에 원심.
    참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. RNA lysates 적어도 1 주 동안 RNA 저하에 상당한 영향 없이-80 ° C에 저장 될 수 있습니다. RNA 격리 같은 날 수행 하는 경우 다음 그들은 추출에 대 한 준비가 될 때까지 얼음에 샘플 진정.
14. 크 실 렌에서 슬라이드를 제거한 후 80-90 분의 권장된 최대 제한 시간 내에 모든 추가 컬렉션을 수행 합니다. 탈수 섹션 주위 습도에 노출은, RNases 수 점차적으로 되 고 다시 활성화. 컬렉션 기간 제한 같은 효과 최소화 하 고 최대한 RNA 무결성을 유지 수 있습니다.

7. RNA 격리

1. RNA 추출 RNase 무료 워크스테이션 준비.
2. 모든 튜브와 시 약 설명서에 따라 RNA 추출 키트에 대 한 준비.
   참고: 많은 키트 RNA 격리 LCM을 다음에 사용할 수 있는 동안 우리는 최고의 성공이 있었다 RNA 추출 키트 "B", 재료 목록에 나열 된를 사용 하 여. RNA 추출 시 약의 측면-의해-측면 비교 그림 5 를 참조 하십시오.
3. -80 ° C 냉동 고에서 샘플을 제거 하 고 37 ° C 물 욕조에 급속 해 동.
4. 균일 하 게 배포 guanidinium 안산 염 2-3 s에 대 한 즉시와 동 해 동 샘플.
5. 각 샘플 70% 에탄올의 동등한 양으로 결합. 필요한 경우, 충분 한 RNA 농도 도달, 2 이상의 lysates 풀.
6. Microdissected 샘플에 대 한 최적화 된 프로토콜을 사용 하 여 RNA 추출 과정에 대 한 설명서에는 제조업체의 지침에 따라 진행 합니다.
7. 최소 권장된 물의 볼륨 nuclease 무료 (14 µ L)으로 마지막 단계에서 RNA을 elute.
8. RNA 격리, 다음 aliquot에 새로운 각 샘플에서 RNA의 1-2 µ L 미리 표시 품질 평가/품질 관리에 대 한 RNase 무료 튜브 마이크로 장치는 Bioanalyzer 같은 RNA의 소량을 시각화 수 있는. 고감도 RNA 정량화 키트 정량화에 대 한 별도 튜브에 추가 1 µ L 약 수.
   1. 다음이 단계를 필요에 따라 조정, 다운스트림 분석에 대 한 충분 한 양의 RNA (즉., 이전 RNA 추출 LCM 모자 수 수영장).
9. 다운스트림 분석에 대 한 충분 한 샘플을 수집까지-80 ° C에는 저장소 RNA

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결과

기존 프로토콜 RNA-이 대 한 기준을 충족 하는 LCM을 사용 하 여 인간의 장 샘플에서 장의 중추의 상대적으로 빠른 컬렉션을 사용할 수 있는 여러 가지 개선을 하였습니다. 첫째, 우리는 2-mb (그림 1B) 드라이 아이스의 슬러리의 표면에 배치 하는 큰 기본 금형에서 장 조직 세그먼트의 급속 동결 최적화. Cryosectioning 및 후속 LCM 동안 최고의 성?...

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토론

이 절차 RNA-이 대 한 RNA를 파생 하는 원본으로 수많은 장 중추의 효율적인 수집 가능 여기, 우리가 극대로 RNA 무결성을 유지 하면서 기존 프로토콜에서 설명 하는 프로세스를 가속 있다. 이 절차의 모든 단계는 상호 의존, 그것은 중요 한 연구의 개시에서 모든 문제를 제거 하 고는 모든 샘플 준비가 되어로 유사 하 게 다른 가능한 신뢰할 수 있는 RNA-이를

절차의 개시에서 RNA 무...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral-buffered formalin	Sigma	HT501128-4L
2-Methylbutane	Fisher	O3551-4
3-mL syringe	BD	309628
50-mL conical tubes, polypropylene	Corning	05-526B
Base molds 37x24x5mm, disposable	Electron Microscopy Sciences	5025511
Belzer UW  Cold Storage Solution	Bridge to Life	N.A.
CapSure Macro LCM caps	Arcturus, ThermoFisher	LCM0211
Cling Wrap, Press’n Seal	Glad	N.A.
Cresyl Violet Acetate	Acros Organics	AC405760025
Cutting Board	Electron Microscopy Sciences	63308
Ethanol, 190-proof	Pharmco-AAPER	111000190
Ethanol, 200-proof	Pharmco-AAPER	111000200
Glass Microscope slides	Fisher	12-550-343
Gloves, extended cuff	Microflex	19010144
Gowns, surgical-disposable	Kimberly-Clark	19-088-2116
Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan)	Nalgene	1335920B
Kimwipes (large)	Kimberly-Clark	34120
Kimwipes (small)	Kimberly-Clark	34133
Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT)	ThermoFisher	N.A.
Leica Cryostat Chuck, large,  40 mm	Southeast Pathology Instrument Service	N.A.
Light Microscope	Olympus	CX43
Microscope objective (20X)	Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17	N.A.
Microscope objective (10X)	Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-	N.A.
Molecular Sieves	Acros Organics	AC197255000
Nuclease-free water	Ambion	AM9937
PicoPure RNA extraction kit	Applied Biosystems	12204-01
Pellet Pestle	Kimble Kontes	4621973
PEN membrane LCM slides	Arcturus, ThermoFisher	LCM022
RNase-free tubes, 1.5 mL	Ambion	AM12400
RNaseZAP	Sigma	Sigma-R2020
RNA Extraction Kit "A" (PicoPure)	Applied Biosystems	12204-01
RNA Extraction Kit "B" (RNeasy  Micro kit)	Qiagen	74004
RNA Extraction Method "C" (TRIzol)	Invitrogen	15596-026
RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit)	Qiagen	74134
Splash Shield, disposable faceshield	Fisher	17-310
Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp"	Fine Science Tools	14002-14
Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm)	Nalgene	190-2520
Tissue Freezing Medium	General Data Healthcare	TFM-5
Xylenes	Fisher	X3P1GAL