단일 셀 정량 mRNA와 유인원 면역 결핍 바이러스에 감염 된 CD4에 표면 단백질 표정+ T 세포 격리에서 붉은 털 원숭이

요약

설명한 quantitate 96 유전자의 표현 하는 방법론 이며 단일 셀 전 비보, 차동의 식별을 위해 허용 하 여 18 표면 단백질 유전자와 감염 되지 않은 세포에 상대적으로 바이러스에 감염 된 세포에 있는 단백질을 표현. 우리는 접근 연구 SIV에 감염 된 CD4⁺ T 적용 붉은 털 원숭이에서 분리 하는 세포.

초록

단일 세포 분석은 세포의 이종 인구를 해 부하는 중요 한 도구 이다. 식별 및 희귀 세포의 격리 어려울 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 방법론 결합 인덱스 cytometry 고 높은 처리량 다중화 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 개발 되었다. 목표를 식별 하 여 유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV)의 특성은-붉은 털 원숭이 내의 세포를 감염. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)에 의해 표면 단백질의 정량에 의해 mRNA 정량를 통해 바이러스에 감염 된 세포는 다차원 프로필을 만들 호스트 유전자와 단백질 측정 함께 바이러스 성 유전자 발현에 의해 식별 됩니다. . 우리 용어 접근, 타겟된 단일 셀 Proteo transcriptional 평가, 또는 tSCEPTRE. 메서드를 수행 하기 위해 실행 가능한 세포 표면 마커 FACS 절연 셀 집합 또는 다운스트림 phenotypic 분석의 사용에 대 한 특정 형광 항 체와 스테인드는. 단일 셀 뒤에 즉시 세포, 다중 반전 녹음 방송 (실시간), PCR 사전 확대, 및 최대 96 성적 높은 처리량 정량 정렬 됩니다. FACS 측정 정렬의 시간에서 기록 하 고 이후 transcriptional 프로필 및 결합된 단백질을 만드는 좋은 위치에 의해 유전자 표현 데이터에 연결 됩니다. SIV에 감염 연구를 직접 ex vivo세포, 세포는 여러 바이러스 RNA의 정량 검출에 의해 확인 되었다. 바이러스 성 성적표의 조합과 각 양의 바이러스 성 수명 주기 (예를 들어, 비 생산적 대 생산)의 단계로으로 세포를 분류 하기 위한 프레임 워크를 제공 합니다. 또한, SIV⁺ 세포의 tSCEPTRE 감염에 비해 셀 차동 표현된 호스트 유전자와 단백질을 평가 하기 위해 동일한 견본에서 고립 되었다. 분석 감염 된 세포 뿐만 아니라 vivo에서 단일 셀 해상도 post-transcriptional 유전자 SIV 중재 규정 중 이전 진가 바이러스 성 RNA 식이 밝혔다. TSCEPTRE 메서드는 의무가 표면 단백질 marker(s), 호스트 또는 병원 체 gene(s), 또는 그것으로 조합 식으로 식별 된 셀 인구의 분석입니다.

서문

종종 호스트 세포 생물학 변경 또는 전파의 그들의 기회를 극대화 하기 위해 호스트 세포의 매우 구체적인 부분 모집단을 대상으로 많은 세포내 병원 체 복제 호스트 셀 기계에 의존 합니다. 그 결과, 세포 생물학 프로세스는 일반적으로 중단, 호스트의 전반적인 건강에 해로운 결과. 바이러스 및 그들은 복제 하는 있는 호스트 세포 사이 상호 작용 이해 감염을 방지 하기 위해 향상 된 치료 및 전략의 개발에 도움이 있습니다 질병 메커니즘 명료 하 게 됩니다. 호스트 병원 체 상호 작용의 연구를 직접 분석 도구는이 필수적입니다. 단일 세포 분석은 명확 하 게 특정 유전자 형 또는 감염 상태¹세포 표현 형을 특성에 유일한 수단을 제공 합니다. 예를 들어 병원 성 감염 자주 호스트 세포에서 둘 다 직접 및 간접 변화 유도. 따라서, 구별 그들의 감염에서 감염 된 세포는 직접 감염 또는 보조 효과 특성 호스트 셀 변경 하는 데 필요한 같은 일반화 된 염증. 또한, 많은 병원 체, SIV와 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 같은 일찍, 늦게, 호스트 세포 감염 같은 여러 단계를 통해 진행 또는 숨겨진, 각각의 특징 수 있습니다 고유한 유전자와 단백질 표정 단면도^{2 , 3 , 4 , 5}. 세포 혼합물의 대량 분석이이⁶을 잡으려고 실패 합니다. 대조적으로, 매우 둘 다 바이러스의 식 계량 수 단일 세포 분석 다중화 하 고 감염 관련 세포 섭, 감염 단계에 걸쳐 변화를 포함 하 여 해결 하는 수단을 제공 하는 호스트 유전자. 또한, 순수에 호스트 병원 체 상호 작용 분석 관련 설정을 감염 된 유기 체에서 발생 하는 이벤트의 식별을 위해 중요 합니다. 따라서, vivo ex vivo에서 최고의 가능성이 캡처는 직접 적용할 수 있는 방법을 처리 합니다.

SIV와 HIV CD4 대상⁺ T는 그들이 중화 호스트 항 바이러스 "제한" 요소와 downregulate 항 원 제시 하는 생산적인 감염 고 방지 면역 감시^{7,8, 분자 세포 9,,1011}. 치료를 하지 않으면 감염 c d 4의 대규모 손실에 결과⁺ T 세포, 궁극적으로에 culminating 획득 면역 결핍 증후군 (에이즈)¹². 투여 요법의 설정에서 latently 감염된 세포 저수지 치료 전략에 강한 장벽 포즈, 수십 년 동안 지속. Vivo에서 HIV/SIV에 감염 된 세포의 속성을 이해 pathogenesis 및 지 속성에 호스트 세포 기능을 가능성이 있다. 그러나, 이것은 매우 도전, 감염 된 세포의 low frequency 그리고 그들을 쉽게 식별할 수 시 약의 부족 때문에 주로. 바이러스 성 RNA 녹음 셀 0.01-1에 있기 위하여 견적 된다 CD4의 %⁺ T 세포가 혈액과 림프 조직^13,,1415에. 진압 치료에서 latently 감염 된 세포는 10^-3– 10^{-7- 16,,1718}도 덜 자주. 체 외에 감염, 같은 세포내 개 그 공부 잘 작동 배경 0.01-0.1의 얼룩 때문에 차선은 분석 실험 바이러스 성 단백질 얼룩 %, 감염 된 세포^{13의 주파수 보다 작거나 비슷합니다 14}. 잘 특징이 SIV/에이즈 환경을 특정 단일 클론 항 체를 사용 하 여 환경 단백질에 대 한 표면 얼룩 또한 입증 되었다 어려울, 아마 유사한 이유를 위해. 최근, 새로운 도구 중 개 그를 표현 하는 세포의 탐지를 향상을 목표로 통합 개 그 RNA 또는 대체 이미징 기술^14,,1519를 사용 하 여 특정 분석 실험. 그러나, 이러한 접근 제한 남아 양적 측정 수에서 각 셀에서 수행.

여기, 우리 (1) 직접 비보 전 과민 하 고 특정 바이러스 성 유전자 정량 정량 및 (2) 각 감염에 대 한 최대 18 표면 단백질 및 96 유전자의 식을 단정 단일 바이러스에 감염 된 세포를 식별 하는 방법 설명 (그리고 감염 되지 않은) 셀입니다. 이 방법론은 FACS 즉시 세포 세포의 용 해에 의해 다음에 의해 단일 세포 표면 단백질 측정 그리고 Biomark 시스템에 대상으로 정량 멀티플렉스 유전자 표정 분석 사용 하 여. 통합된 유체 회로 (IFC) 기술 수 있습니다 96 샘플에서 96 유전자의 멀티플렉스 정량을 동시에 개별 정량 Pcr 반응을 수행 됩니다 9,216 챔버의 매트릭스에 의해 수행. 즉시 수행 분석에 대 한 전체 transcriptome 보존 하는 동안이 콘텐츠 단백질 풍부한 측정 기록 라이브 셀 FACS 정렬 다운스트림. 바이러스에 감염 된 세포를 식별, 양자 택일로 접합 하 고 unspliced 바이러스 성 RNAs (vRNA)에 대 한 분석 실험 관련 최대 96 유전자, 현재에 수용 하는 분석 실험의 최대 수를 총 사용자 정의 분석 실험의 패널 함께 정량 분석에 포함 IFC입니다. 유전자 발현 및 단백질 정보 각 셀에 대 한 좋은 위치에 의해 연결 됩니다. 우리는 이전²⁰이 분석을 다른 곳에서 결과 보고 했다. 여기, 우리는 자세한 SIV에 감염 된 CD4의 추가 설명 형질으로 서 방법론 지침 제공⁺ T 세포.

우리 tSCEPTRE 기간,이 접근의 어떤 가능한 셀 붙일 레이블된 항 체를 표현 transcriptome 호환 가능한 정량 분석 실험 반응 정지에 적용할 수 있습니다. 예를 들어 그것은 차동 유전자와 단백질 표정 희귀 세포 또는 세포 표면 단백질 마커에 의해 쉽게 구별 특성화에 대 한 사용할 수 있습니다. 샘플 준비는 상업적으로 사용할 수 있는 항 체를 사용 하는 프로토콜을 얼룩이 지는 표준에 의존 합니다. 단일 셀 정렬 기능 Cytometers 또한 상업적으로 사용할 수 있습니다, 하지만 추가 biosafety 예방 감염 라이브 셀을 처리 하는 데 필요한. 여기 라고 잘 위치 하 여 각 셀에 대 한 단일-셀 단백질 식 프로필 기록 분류, 색인으로 정렬 소프트웨어 상용 FACS의 일반적인 기능입니다. 관심의 셀 인구 가운데 차동 표현된 호스트 유전자의 전산 분석, 설명 되지 않은 하지만 참조는 이전에 게시 방법에 제공 됩니다.

프로토콜

참고: 프로토콜 워크플로의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 그것은 세 가지 주요 단계로 구성 됩니다: FACS, RT 및 cDNA 사전 증폭, 및 최대 96 유전자에 대 한 정량 동시에. 프로토콜, 희석을 제한 하 고 단일 셀 정렬 셀 정렬의 두 가지 버전 5 단계 및 6 단계에서 자세히 각각 설명 되어 있습니다. 이러한 전략 다른 연구 질문 하지만 유사한 절차.

1. 필수 또는 이전 분석

1. 앞에서 설명한⁶으로 사용할 모든 유전자 표현 분석을 확인 합니다.
   참고:이 단계는 실험 날짜 임박 이루어집니다. 모든 분석을 확인, 상업 및 사용자 정의 단일 셀 수준까지 관련 RNA의 효율적이 고 선형 증폭을 보장 하는 데 필요한입니다. 많은 상업적으로 사용 가능 하 고 사용자 정의 분석 이러한 사양을 충족 하지. 추가 코딩 파일 1-5, 처리 및 최대 96 유전자의 분석 실험 식의 동시 자격에 대 한 자동화 곡선 맞춤 제공 됩니다 하지만 개별 분석 실험은 R² 와 선형 적합의 기울기를 사용 하 여 한정할 수 있습니다. 대표적인 성공 및 실패 분석 결과 자격 플롯은 그림 2에 표시 됩니다.
2. 항 체의 세포 표면 마커 얼룩의 흐름 cytometric 패널을 개발 합니다.
   1. 각 항 체와 항 체 관련 샘플, 예를 들어 붉은 털 주변 혈액 단 세포 (PBMCs), 얼룩에 의해 적정. 100 µ L에서 테스트 당 항 체의 20 µ L로 시작 반응 얼룩이 지 고 8 개의 두 배 직렬 희석을 만들. 부정적이 고 긍정적인 인구 사이 명확한 분리를 유지 하면서 강도 얼룩 최대 전시 최적 농도 식별 합니다.
   2. 평가 단계 1.2.1에서 최적의 농도에서 모든 항 체의 혼합물을 사용 하 여 추가 셀 sample(s)에 결합 된 얼룩. 얼룩이 지는 개별 항 체 얼룩에 대 한 관찰과 비슷한 인지 확인 합니다. 얼룩 때 어떤 항 체 분리에 사용 된 관찰은 무엇 보다 작은 경우, 대체 형광 색소 변화 같은 항 체를 대체 하는 것이 좋습니다.

2. 진 식 시험 준비

1. 1-15 mL 튜브에는 RNase/DNase-무료 분석 실험 결합 96 유전자 발현 (크기는 정렬 번호판의 번호와 다를 수 있습니다). 이 연구에 사용 된 분석 실험의 패널은 표 1 과 표 2에 지정 됩니다. 결과 자료를 "분석 결과 믹스" 라고 합니다. 각 분석 결과 180의 최종 농도에 추가 정방향 및 역방향 뇌관의 nM. DNA 분석 결과 혼합의 적절 한 희석을 달성 하기 위해 서 스 펜 션 버퍼를 추가 합니다.
   참고: 실용적인 목적을 위해 사용자 정의 (사용자 생성) 분석 결과 주식 수 있습니다 준비 18 µ M 상용 "20 x" 진 식 정량 분석 (자료 테이블)의 농도와 일치 하도록. 각 유전자에 대 한 사용자 정의 앞으로 역 뇌관의 18 µ M 믹스 DNA 정지 버퍼 재고 솔루션에서 만들어집니다. 상업적으로 이용 가능한 분석 (자료 테이블) 프로브 포함 하지만 프로브 RT 또는 cDNA 사전 증폭 및 수 필요 하지 않습니다. 따라서 사용자 정의 분석 실험에 대 한 생략. 하나를 포함 하는 것이 좋습니다 또는 정렬, 셀 복구 및 cDNA 합성의 효율성을 평가 하기 위한 품질 관리에 대 한 더 많은 내부 관리 유전자 사용. CDNA를 생성 하기 위해 임의의 뇌관의 사용 결정 되지 않았습니다, 하지만 유전자 특정 뇌관 보다 덜 효율적일 것으로 예상 된다.
2. 분석 결과 판 x 2 단계 7.1 (다중 정량)에 사용 하기 위해 준비. 예상 각 96 x 96 칩 배열, 96-잘 PCR 접시의 지정 각 각 분석 결과의 6 µ L 플라스틱. 예를 들어 5 칩, 각 분석 결과의 30 µ L 96 잘 접시에 단일 잘을 차지할 것입니다. 96 분석 실험을 사용 하 여, 96 잘 접시의 각 잘 분석 결과 포함 됩니다. 접착제 인감과 접시를 봉인.
   참고: 이상적으로, 단계 2.1과 2.2 수행 됩니다, 동시에 유전자 표현 분석에 대 한 여러 freeze-thaw 주기를 피하기 위해. 분석 결과 배지 내의 모든 유전자도 되어 있어야 분석 결과 믹스 (2.1 단계)에. 분석 결과 믹스와 분석 결과 플레이트 모두 저장할 수 있습니다 장기 또는 단기적인 사용, 4 ° C 또는-20 ° C에 각각.

3. 표면 얼룩 가능한 셀

참고: 세포내 얼룩, permeabilization, 및 고정 호환 되지 않습니다이 방법으로 그들은 RNA 타협.

1. 셀 얼룩을 위해 사용 하는 것 2.5-fold 높은 농도에서 보상 구슬의 40 µ L에 재료의 테이블에 에서 나열 된 각 항 체를 추가 하 여 보상 샘플을 준비 합니다. 빛에서 보호 하는 25 ° C에서 20 분 동안 품 어. 구슬 및 25 ° c.에 3 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기에 PBS의 3 mL를 추가 PBS를 발음 하 고 ~ 300 µ L의 PBS에 구슬 resuspend.
2. 흐름 cytometric 셀 정렬 샘플 처리에 대 한 준비: 보상 튜브 확보, 보상 행렬, 만들고 실험 표본에 대 한 수집 파일에 행렬을 적용.
3. 테이블의 재료, 스테인드 될 모든 샘플에 대 한 호박 1.5 mL 튜브에 지정 된 대로 각 항 체의 적절 한 볼륨을 결합 하 여 형광 항 체 칵테일의 마스터 믹스를 준비 합니다. 소용돌이 원심 분리기 21000 x g 작은 항 체를 25 ° C에서 2 분 동안에 칵테일 집계 합니다.
   참고: 여기에 사용 되는 항 체 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.
4. 12 mL PBS의 15 mL 튜브, 25 ° c, 3 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기에 세포 현 탁 액의 2 분 추가 0.5-2 mL에 대 한 37 ° C 물 욕조에 cryopreserved 세포를 해 동 하 고 PBS 발음. 3 ml PBS와 5 mL 폴리스 티 렌 튜브에 resuspend. 위와 같이 원심 고 ~ 20 µ L 잔여 PBS를 떠나 PBS 발음.
   참고: 착 온도 따뜻한 또는 추운 온도에 따라 조건 얼룩 (단계 1.2 참조) 항 체 적정을 수정 하 여 특정 응용 프로그램에 대 한 필요에 따라 적응 수 있습니다.
5. Resuspend 2 x 10까지⁷ 칵테일 항 체의 80 µ L에서 세포를 씻어 하 고 빛 으로부터 보호 하는 25 ° C에서 20 분 동안 품 어. 샘플 2 x 10⁷ 셀을 초과 증가 착 반응 볼륨 따라 유지 위해 < 2 x 10⁷ 셀/100 µ L.
6. PBS의 3 mL를 추가 하 여 셀을 씻어 3 분, 500 x g 에서 centrifuging와 발음은 상쾌한.
7. 철저 하 게 35 µ m 나일론 셀 스 트레이너 모자를 통해 pipetting으로 300-500 µ L의 PBS와 필터 셀 resuspend. 얼음에 세포를 유지 하 고 정렬까지 빛 으로부터 보호.

4. 준비 셀 컬렉션 접시, FACS 정렬 수행 및 생성 cDNA

1. RT-앰프 반응 혼합 부품 (표 3)를 결합 하 여 단일 RNAse/DNAse 없는 무 균 튜브에 pipetting으로.
   참고: 이전에 또는 3 단계에서 착 색 하는 동안이 단계를 수행할 수 있습니다. RT 효소 정량 신호에 DNA 템플렛의 기여를 확인 하려면 여기 생략할 수 있습니다.
2. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 실시간 앰프 반응 혼합의 10 µ L 96 잘 PCR 정렬 컬렉션 번호판의 원하는 수로 분배. 접착제 필름, 접시를 봉인 하 고 미리 냉장된 96 잘 알루미늄 블록에 접시를 놓습니다.
3. 얼룩진된 샘플의 약 20000 셀에서 데이터를 획득 하 여 교류 cytometer에 제어 체계를 정렬 셀을 설정 합니다. 보상 매트릭스 수집 된 데이터에 적용 됩니다 확인 하십시오. 그리기 문 고 격리 유전자 표정 분석에 대 한 관심의 셀 population(s)을 나타내는 제어 트리를 정의 합니다.
   참고: 잠재적인 SIV vRNA⁺ 셀의 컬렉션에 대 한 사용 제어 트리는 그림 3에 표시 됩니다.
4. 각 잘으로 분류 될 수와 셀의 하위 집합을 지정 하려면 적절 한 악기 설정을 입력 하십시오. 정렬 중 하나에 대 한 자세한 지침을 추가 제한 셀 희석 시리즈 또는 단일 셀에에서 제공 됩니다 단계 5와 6, 각각.
5. FACS 준비 96 잘 PCR 컬렉션 접시로 셀을 정렬 합니다. 정렬 전에 접착 씰을 제거 하 고 신선한 물개 종류를 다음으로 바꿉니다.
   참고: 항상, 정렬 하는 동안 포함 하 여 미리 냉장된 알루미늄 블록 플레이트를 유지.
6. 정렬, 소용돌이 및 원심 분리기 직후 컬렉션 접시 2000 x g 4 ° c.에 1 분에서
7. Thermocycle 따뜻한 뚜껑 다음 조건을 사용 하 여 PCR 기계에 접시: 15 분 (RT), 2 분 동안 95 ° C 50 ° C 95 ° C의 18 주기 다음 15 s 및 4 분 (사전 증폭) 60 ° C.
8. 새로운 96-잘 PCR 접시에 DNA 정지 버퍼의 20 µ L에 cDNA의 5 μ를 전송 하 여 cDNA 1: 5을 희석. 희석된 cDNA 저장할 수 있습니다 4 ° C 또는-20 ° C에 무기한이 시점에서. cDNA를 정량 (단계 5.2, 7.4)에 대 한 서식 파일로 사용할 수 지금 이다.
   참고:이 희석 하면 RT preamp 반응에 뇌관 다운스트림 정량에 기여 하지 않습니다.

5. 변형 a: FACS 정렬 셀 시리즈로 제한 희석 vRNA⁺ 의 주파수를 결정 하기 위해 셀 또는 실험 품질 관리 수행

참고: 단일 셀 정렬을 수행 하기 전에 그것은 복제에 직렬 희석으로 셀을 정렬 하 여 관심의 세포의 주파수를 결정 하는 사용의 있을 수 있습니다. 이 단계 또한 제공 한다 귀중 한 품질 관리 정렬 효율, 세포 세포의 용 해, RNA 복구 및 cDNA 합성 단계 5.3에서에서 설명한 대로. VRNA⁺ 셀 주파수의 이전 결정은 적절 하 게 구동된 vRNA⁺ 세포 유전자 표정 분석에 대 한 충분 한 샘플 크기를 달성 하기 위해 정렬 되어야 하는 단일 셀의 수의 더 정확한 견적에 대 한 수 있습니다.

1. FACS 단계 4.1-4.2, 같이 준비 96 잘 접시에 셀을 정렬 하 고 여러 복제에 잘 당 1-1000 셀을 수집 합니다.
   참고: 각 셀 희석에 복제 우물의 수는 일반적으로 잘 당 세포 농도와 반비례 연결. 감염 된 세포 주파수 1% 아래 이면 셀 희석 잘 당 100-1000 셀에 집중 해야 한다. 예를 들어 정렬 판 지도 그림 1, 왼쪽 상단에에서 제공 됩니다. 잘 당 1000 셀 초과 결과 증가 때문에 피해 야 한다 반응 볼륨 및 다운스트림 cDNA 합성 및 정량화와 간섭.
2. 표 4에서 마스터 믹스 솔루션에 정량 시 약을 결합 한다. 25 µ L 반응 볼륨, 마스터 믹스의 22.5 µ L 단계 3.9에서에서 희석된 cDNA 템플릿의 2.5 µ L와 결합 된다. 표준 자전거 상태를 사용 하 여 정량 Pcr을 수행 (예를 들어, 5 분, 94 ° C 94 ° C의 40 주기 다음 15 s를 1 분 동안 60 ° C).
   참고: Singleplex 정량 반응 기존의 실시간 정량 악기를 사용 하 여 하나 또는 몇 가지 분석 실험의 경제적인 예비 분석으로 효율적인 셀 정렬, RNA 복구 및 cDNA 합성 권장 됩니다. 그것은 또한 vRNA⁺ 세포의 주파수를 계산에 사용할 수 있습니다. Biomark를 사용 하 여 다중 정량 반응은 일반적으로 더 대규모 단일 세포 분석에 적합 합니다.
3. 품질 관리에 대 한 플롯 외 값 (동부 표준시 = Ct_최대 − Ct) 셀의 숫자 대 로그₁₀ 규모로 잘 당 정렬 하 고 선형 회귀 분석을 적용.
   참고: 일관성이 복제, 3.3 (± 0.3), 선형 회귀 기울기와 R² > 0.9는 효율적인 실험의 지표. 최적의 차선 일종의 예, RT-앰프 실험 그림 4에 나와 있습니다.
4. VRNA⁺ 세포의 주파수를 결정, 셀 숫자 x 축 (로그₁₀ 규모)의 분수에 잘 당 정렬 플롯 vRNA는 y 축에 각 셀 희석에 대 한 긍정적인 우물. 예를 들어, 그림 1 (더 낮은 왼쪽된, 포아송 분포)를 참조 하십시오. 항구의 한 긍정적인 셀 평균, 웰 스 포지티브 (y 축에 0.632)²¹의 63.2%에 해당 하는 셀의 수를 결정 하려면 데이터를 선형 회귀 모델을 적용 합니다. 이 셀 희석 수 (x 축 절편) 주파수 백분율 표현으로 변환 합니다. 예를 들어, 48 셀 당 하나의 vRNA⁺ 셀은 2.1%의 주파수.

6. 변형 b: FACS 정렬 세포를 단일 세포 분석

1. 4.1-4.8, 단계 고 좋은 위치에 잘 교류 cytometer 인덱스 정렬 기능을 사용 하 여 정렬 하 고, 각 셀에 대 한 개별 FCS 파일을 만드는 당 정렬 한 셀을 지정 합니다.
   참고: 정렬 컬렉션 접시의 수는 사용 가능한 thermocyclers의 수를 초과 하면, 사이클링 역전사 비활성화 단계 (2 분 동안 95 ° C) 후 중지할 수 있습니다 및 thermocyclers 사용할 수 있습니다 때까지 4 ° C에서 cDNA를 저장할 수 있습니다. 이 경우에, 15 95 ° C의 첫 번째 사이클에서 사전 증폭 시작 s.
2. 선택 사항: 만들 cDNA 잔여 undiluted cDNA를 사용 하 여 관심사의 희귀 셀에 대 한 화면에 단일 셀의 사용자 정의 된 일괄 처리에서 cDNA의 구성 된 "풀". 새로운 96 잘 접시에 멀티 채널 피 펫 2 µ L undiluted 단일 셀 미리 증폭 된 cDNA의 전송. 여 반복 지정 된 풀의 모든 추가 단일 셀에서 cDNA의 pipetting 2 µ L 동일한으로 잘 합니다. 관심 (예를 들어, vRNA) 기존의 정량 Pcr를 사용 하 여 긍정적인 셀을 포함 하는 그 결정의 gene(s)에 대 한 cDNA 풀 화면. 풀링 각 셀에서 cDNA의 작은 약 수만 필요, cDNA의 나머지 ~ 8 µ L 이므로 여전히 단일 세포 분석에 사용할 수 있습니다.
   참고: 풀링 전략은 리소스가 다중 정량에 의해 심문을 하는 단일 셀의 수를 줄이기 위해 노력에서 단일 셀 유전자 표정 분석을 수행 하기 전에 것이 좋습니다. 그것은 예비 단일-플렉스 정량 분석 결과 의해 관심사 (예를 들어, SIV mRNA +)의 세포 수 있습니다 식별 하는 경우에 적합 합니다. CDNA 풀 만들 간단 높은 처리량 전략 새로운 접시에 단일 잘으로 2 µ L 컬렉션 정렬 접시의 행 (즉, 모든 12 행 A에서 세포) 또는 열 (즉, 열 1에 있는 모든 8 셀), undiluted cDNA의 결합을 포함 됩니다. 전략을 풀링 하는 최고를 확인 하려면 단계 5.4에서 셀의 예상된 주파수를 고려 하십시오. 예를 들어 셀의 10%는 긍정적인 것으로 예상 된다, 6 단일 셀 cDNA 샘플 구성 풀 자주 음수가 될 것입니다 그리고 그 수영장에서 세포 따라서 다운스트림 단일 세포 분석에서 제외할 수 있습니다.

7. 다중 정량 Biomark 플랫폼에

참고:이 섹션은 버전 A 또는 B 위에서 설명한을 추적할 수도 있습니다. 여기서 설명 하는 연구에서 그것은 단일 세포 분석에 독점적으로 적용 했다.

1. 분석 결과 각 잘에서 시 로드 4 µ L를 포함 하 새로운 96-잘 PCR 격판덮개로 분석 결과 플레이트 (준비 단계 2.2에서에서) x 2에서 각 분석 결과의 pipetting 4 µ L에 의해 정량 분석 결과 접시를 준비 합니다. 분석 결과 플레이트 4 ° c.에 유지
   참고: 분석 결과 접시와 한 달 동안-20 ° C에서 최대 1 주일까지 4 ° C에서 안정적입니다. 따라서, 그것은 여러 개의 칩에 대 한 충분 한 자료를 준비 하 고 적절 하 게 저장 하려면 유용할 수 있습니다.
2. 칩의 2 개의 흡 기 밸브에 못쓰게 주사기에서 제어 라인 체액을 분배. 접시 아래 보호 플라스틱을 제거 합니다. A 1 위치에서 노치 면 IFC 컨트롤러에 칩을 놓습니다. 주 메뉴에서 "총리" 스크립트를 선택 합니다. 스크립트를 실행 합니다.
3. 실시간 반응 혼합 시 약 각 미세 칩에 대 한 PCR 마스터 믹스 (자료 테이블)의 500 µ L 로드 하는 샘플의 50 µ L를 혼합 하 여 준비 합니다. 새로운 96-잘 PCR 접시 이제부터 "샘플 접시"로 지정의 각 음에 4.4 µ L 플라스틱.
4. 4.8 실시간 반응 혼합을 포함 하는 샘플 접시에 단계에서 1:5 희석된 cDNA의 3.6 µ L 플라스틱
   참고: 경우 PCR 다운 선택 단계 6.2에서에서 설명한 것 처럼 희귀 (예를 들어, vRNA⁺)에 대 한 다운스트림 분석에 대 한 셀 화면, 긍정적인 풀에서 셀만 포함을 위해 수행 되었습니다.
5. 칩 못쓰게 완료, 다음 로드는 칩의 노치 (시험) 측에 잘 해당 시험 접시에서 분배 5 µ L 및 5 µ L 칩 후미 샘플 접시에서 잘 (샘플) 반대편에는 칩의 해당. IFC 컨트롤러에 칩을 삽입 하 고 "로드 믹스" 스크립트를 실행 합니다.
6. 멀티플렉스 정량 Pcr을 수행 하기 위해 Biomark 플랫폼에 칩을 전송. 악기 설정 및 다음 단계별 실시간 PCR 분석 소프트웨어에서 제공 하 고 PCR의 40 주기 함께 진 식 (GE) 96.96 표준 V.1 프로토콜을 사용 하 여 정량 프로그래밍을 진행. 지정 된 폴더에서 ChipRun 파일을 저장 합니다.
   참고: 여러 개의 칩 하루와 여러 일 동안 실행할 수 있습니다.
7. 정량 데이터를 분석 합니다.
   1. 실시간 PCR 분석 소프트웨어를 엽니다. "ChipRun.bml" 파일은 "파일 | 열기"메뉴입니다.
   2. "칩 탐색기"와 "칩 실행 요약" 소프트웨어 윈도우의 상단 왼쪽된 모서리에 찾습니다. 칩 실행 요약의 세 가지 구성 요소를 식별: 분석 보기, 샘플 설치 및 감지기 설치.
   3. "감지기 설치"를 클릭 하십시오. "작업"에서 "새로 만들기"를 클릭 하 고 컨테이너 유형 "SBS 판", 및 컨테이너 형식 "SBS96"를 선택 합니다. "매핑"을 옆에 클릭은... "M96-분석 결과-SBS96.dsp"를 버튼을, 선택한.
      1. 선택 사항: 할당 각 검출기 (시험) 숫자 또는 각의 "이름" 섹션에서 이름 잘 1^세인트 에 두 번 클릭 합니다. 잘 "F2"를 눌러 다음으로 이동 합니다.
   4. "샘플 설치"를 클릭 하십시오. "작업" 옆 "매핑"을 클릭 합니다는... "M96-샘플-SBS96.dsp"를 버튼을, 선택한.
   5. "분석 보기"를 클릭 하십시오. "정량" 탭에서 "작업", 선택 "선형 (파생)에 대 한 기준선 보정", 그리고 "사용자 (감지기)에 대 한 Ct 임계값 방법". "Ct 임계값" 탭에서 "자동 상자 초기화"를 확인 하십시오. 위의 "분석" 버튼을 클릭 합니다.
   6. "분석 보기"의 상단 오른쪽 사분면에서 두 번째 탭 "결과 표"를 클릭 합니다. 드롭 다운 메뉴에서 "열 지도 보기"를 선택 합니다. 열 지도 데이터와 함께 표시 됩니다.
      1. 선택 사항: 칩에 걸쳐 균일 한를 이용한 형광을 되도록 선택 "열 맵 보기" 대신 "이미지 보기" 같은 메뉴에서 합니다. 열 지도 위에 오른쪽 창에서 두 번째에 "를 이용한"을 선택 합니다. 오른쪽 창에서 첫 번째, 1-40 주기 중 하나를 선택 합니다. 이용한 형광의 흑백 디스플레이를 전환 오른쪽 창에서 4를 클릭 하십시오. 이미지를 알리는 뿌려 놓은 것 요, 입자, 또는 칩에 결함이 표시 됩니다. 이용한 균일 가려진 조잡 한 경우 다시 칩을 실행 합니다.
   7. 열 지도 아래 "임계값" 및 "로그 그래프"를 클릭 합니다. 지 수 단계에 증폭 곡선을 교차 하는 데 필요한 임계값 분석 (열의 열 지도)에 클릭 하 여 수동으로 각 검출기에 대 한 Ct 임계값을 조정 합니다. 완료 되 면, "분석"을 클릭 합니다.
8. 정량 데이터를.csv 파일로 내보냅니다. 스프레드시트 또는 통계 분석 소프트웨어 (예를 들어, JMP)로 데이터를 가져올 하 고 칩 샘플 및 분석 결과 위치로 결과. 새 열을 만들고 조건부 수식을 사용 하 여 바이러스 성 유전자의 표현에 따라 그룹으로 셀을 구성 합니다. "분석"에서 "맞는 Y에서 X", 선택 하 고 그룹 대 유전자 발현을 플롯 합니다. 통계 분석을 적용 합니다.
   참고: 4 개의 SIV RNA 종의 대표 단일 셀 양적 표현 그림 5A에서 이항 플롯에 그려져 있습니다. SIV RNA⁺ 세포에 양적 호스트 유전자 발현은 그림 5B에 표시 됩니다.
9. 단일 셀 FACS 데이터에서 정량적 단백질 식 값을 추출 합니다.
   1. .fcs를 열고는 FACS에서 파일 정렬 (단계 6.1) 96 잘 접시 FlowJo 버전 9 사용 하 여 해당. 선택 강조 표시 파일 이름으로 "플랫폼 | 이벤트 번호 게이트 | 만들 인덱스 정렬 게이츠 ". 개별 셀 행에 의해 표시 된 표시 됩니다.
   2. 모든 96 셀 (안 행)를 선택 하 고 선택 "작업 영역 | 수출 | 선택 모든 보상된 fluors ". "데이터 형식"에서 "FCS 파일"을 선택 하 고 "내보내기"를 클릭 하 고 지정 된 폴더를 선택.
   3. 새로운 FlowJo 작업 영역으로 개별 셀에 대 한 새로운.fcs 파일을 끕니다. 모든 셀을 강조, "통계 추가" (왼쪽된 상단에 있는 "Σ" 버튼)을 클릭 합니다 "| 의미 | 모든 fluor 매개 변수 "입니다.
   4. 왼쪽된 상단에 있는 왼쪽에서 4 번째 버튼을 클릭 하 여 "테이블 편집기"를 엽니다. 첫 번째 셀의 모든 fluores를 선택 하 고 테이블 편집기 창으로 끕니다. 테이블 편집기 창에서 "만들기 및 보기 테이블" 맨 같은 단추를 클릭 합니다. 이것은 96 셀의 각 형 석에 대 한 숫자 매개 변수 테이블을 만듭니다.
   5. 출력 데이터베이스 소프트웨어 (예를 들어, MS Excel, JMP)에 두 복사/붙여넣기 또는 "저장 하 고 시작 응용 프로그램"을 클릭 하 여 (4에서 복사 테이블 위의 왼쪽된 버튼).
      참고:이 절차는 FlowJo 버전 9에 대 한 특정. FlowJo 버전 10 인덱싱된 데이터를 가져올 다른 절차를 사용 합니다. 인덱싱된 흐름 데이터 복사/붙여 JMP 셀 정렬에서 만든.csv 파일에서 직접 하실 수 있습니다.
10. 단일 셀 FACS 데이터 및 번호에 의해 정량 데이터를 병합 하 고 잘 위치. 결합 된 단일 셀 유전자 (정량)에 그래픽 및 통계 분석을 수행 하 고 단백질 식 (FACS) 데이터.
    참고: 단일 셀의 예 결합 정량 및 FACS 데이터는 그림 6 에 나와 있습니다 (호스트 SIV에 감염, 접합 vRNA⁺ 붉은 털 원숭이 세포 표면 단백질 식 프로필), 그림 7 (c d 4 유전자 발현 표면 대 CD4 단백질 식 접합된 vRNA⁺ 붉은 털 원숭이 세포에서), 그리고 이전²⁰출판. 차동 식별 하 셀 population(s) 관심 있는 유전자 표현, 단일 세포 분석 방법에서 설명한 권장된^20,22,,2324, 차지 하는 연속 유전자 식 값으로 유전자에 대 한 긍정적인 셀의 비율.

결과

전체 프로토콜에 대 한 워크플로 그림 1에 묘사 된다. 그것은 이루어져 있다 2 개의 유사 콘텐츠를 정렬 하는 셀의 수에 의해 정의: 어느 제한 희석 또는 텍스트에 설명 된 대로 셀, 싱글로. 2-fold 직렬 RNA 희석에 뇌관 프로브 자격 분석의 예는 그림 2에 표시 됩니다. 잠재적인 SIV⁺ 셀을 식별 하는 제어 전략은

토론

프로토콜 여기에 설명 된, tSCEPTRE 되 나, 높은 다중화 실시간 정량 Pcr에 의해 양적 단일 셀 mRNA 식 multiparameter cytometry에 의해 통합 하는 단일 세포 표면 단백질 정량. 이 두 기술의 조합 transcriptional는 결합의 높은 콘텐츠 스냅샷 및 높은 처리량 형식에서 단일 세포의 단백질 프로필 수 있습니다. 우리는 메서드를 사용 하 여 지금까지 애매 셀 SIV에서 vivo에서, 감염을 식별 하 고 차동 표현된 호?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA extraction and PCR reagents and consumables
Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate	BioExpress/VWR	T-3060-1
Adhesive PCR Plate Seals	ThermoFisher	AB0558
Armadillo 384-well PCR Plate	ThermoFisher	AB2384
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems/ThermoFisher	4311971
DEPC Water	Quality Biological	351-068-101
Glass Distilled Water	Teknova	W3345
Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen/ThermoFisher	11732088
SUPERase-In Rnase Inhibitor	Invitrogen/ThermoFisher	AM2696
Platinum Taq	Invitrogen/ThermoFisher	10966034
dNTP Mix	Invitrogen/ThermoFisher	18427088
ROX Reference Dye (if separate from kit)	Invitrogen/ThermoFisher	12223012
DNA Suspension Buffer	Teknova	T0223
RNAqueous kit	Invitrogen/ThermoFisher	AM1931
TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
CD6	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs00198752_m1
TLR3	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs1551078_m1
Biomark reagents
Control Line Fluid Kit	Fluidigm	89000021
TaqMan Universal PCR Mix	Applied Biosystems/ThermoFisher	4304437
Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000736
Sample Loading Reagent	Fluidigm	85000735
Dynamic Array 96.96 (chip)	Fluidigm	BMK-M-96.96
FACS reagents
SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)	Spherotech Inc.	CMIgP-30-5H
CompBeads Anti-Mouse Ig,k	BD Biosciences	51-90-9001229
5 ml Polystyrene tube with strainer cap	FALCON	352235
Aqua Live/Dead stain	Invitrogen/ThermoFisher	L34976	dilute 1:800
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2	BD Biosciences	563916	dilute 1:40
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200	BD Biosciences	563914	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8	BD Biosciences	564804	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2	Biolegend	302948	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2	BD Biosciences	564710	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2	Biolegend	301842	dilute 1:83
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8	Biolegend	302048	dilute 1:167
Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7	Biolegend	302340	dilute 1:37
Anti-CD38-R PE clone OKT10	NHP reagent recource	N/A	dilute 1:100
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50	BD Biosciences	564364	dilute 1:10
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6	BD Biosciences	561358	dilute 1:20
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A	Biolegend	313528	dilute 1:80
Instruments
BioPrptect Containment Enclosure	Baker
BD FACS Aria	BD Biosciences
ProtoFlex Dual 96-well PCR system	Applied Biosystems/ThermoFisher	4484076
Quant Studio 6 qPCR instrument	Applied Biosystems/ThermoFisher	4485694
IFC controller HX	Fluidigm	IFC-HX
Biomark HD	Fluidigm	BMKHD-BMKHD