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요약

간단 하 고, 다재 다능 한, 고 저가 생체 외에서 수경 시스템 성공적으로, 메 마른 조건 하에서 대규모 실험을 수 있도록 최적화 되었다. 이 시스템 솔루션 및 분자, 생화학, 생리 적 연구에 대 한 뿌리에 의해 그들의 효율적인 흡수 화학 물질의 응용 프로그램을 지원합니다.

초록

식물 생물학에 있는 연구의 넓은 범위는 수경 문화를 사용 하 여 수행 됩니다. 이 작품에는 체 외에서 수경 성장 시스템 식물 화학 물질 및 기타 물질의 응답을 평가 하기 위해 설계 된 제공 됩니다. 이 시스템은 각각의 C3 와 C4 모델 종 애기 thaliana 와 강아지 풀, 균질 하 고 건강 한 묘를 얻기에 매우 효율적입니다. 무 균 재배 식물 정상적인 성장과 개발 수경 법에 대 한 제한 요인으로 알려져 있다 조류 및 미생물 오염 방지 합니다. 또한,이 시스템은 확장성, 필요한 경우 작은 기계적 손상, 대규모 공장 설비 재료의 수확 뿐만 아니라 식물의 개별 부품의 수확을 사용. 자세한 프로토콜을 사용 하 여 피 펫 선반 주요 플랫폼으로 성장 하는 식물,이 시스템은 간편 하 고 저렴 한 비용 어셈블리, 있다 보여주는 제공 됩니다. 이 시스템의 타당성은 마약 AZD-8055, rapamycin (TOR) 키의 대상의 화학 억제제의 효과 평가 하기 위해 애기 묘를 사용 하 여 유효성이 검사 됩니다. TOR 금지 효율적으로 뿌리와 새싹에 AZD-8055 치료 후 30 분으로 일찍 발견 되었다. 또한, AZD 8055 치료 식물 표시 예상된 전 분 초과 표현 형. 우리 식물 연구원 식물 inducers 또는 억제제도의 동작을 모니터링 하는 것을 목표로 평가 일반적으로 비싼의 사용을 요구 하는 동위 원소 라벨 화합물을 사용 하 여 신진 대사 용으로 이상적인 방법으로이 수경 시스템 제안 시 약입니다.

서문

수경 법을 사용 하 여 성장 하는 식물의 장점은 재현 실험1,2,3을 사용 하는 크고 균일 한 공장의 생산에 널리 인정 되었습니다. 이 시스템에서 영양 솔루션의 구성 제대로 통제 되 고 식물 성장 및 개발의 모든 단계에 따라 재활용. 또한, 토양 재배, 식물 영양 기아 및 물 부족4등에서 발생할 수 있습니다으로 뿌리 abiotic 스트레스를 받게 하지 됩니다. 식물 성장 수경 존재 형태 및 생리 적 특성 토양에서 경작 하는 사람에 게 상당히 유사한로이 시스템은 광범위 하 게 고용 연구에서 루트/촬영 성장과 없이 그들의 수확의 모니터링을 허용 하기 때문에 부상2,5.

구성과 영양 용액의 농도 변경의 가능성으로 인해 수경 조건을 사용 하 여 연구의 대부분의 마이크로-macronutrients1,3 기능을 특성화 하 수행 되었습니다. 6,,78. 그러나,이 시스템은 다양 한 식물 생물학, 호르몬과 식물 화학 물질의 기능을 명료 하 게와 같은 응용 프로그램에 매우 유용을 입증 했다. 예를 들어, 호르몬9 및 brassinosteroid 응용 프로그램10 에 의해 실행 가속된 성장 표현 형의 새로운 클래스 strigolactones의 발견 수경 조건 하에서 수행 했다. 또한,이 시스템은 레이블이 동위 원소 실험을 수 있습니다 (예를 들어, 14N /15N 및 13CO2)11,단백질 및 대사 산물에 그들의 합동 평가12 의해 질량 분석.

식물 연구에이 시스템의 중요성을 고려 하면 높은 수경 문화 수 수경 컨테이너3, 묘 판에서 전이 (i)을 사용 하는 시스템을 포함 하 여 지난 몇 년 동안에서 설계 되었습니다 13; (ii) rockwool 루트 개발2,,1415;의 초기 단계에 대 한 액세스를 제한 하 (3) 폴 리 에틸렌 알갱이 작은 분자/치료 어려운16;의 유형이 같은 응용 프로그램을 만드는 부동 본문으로 또는 (iv)는 감소 된 수의 식물9,17. 이러한 프로토콜의 대부분에서 설명 하는 수경 탱크의 볼륨은 일반적으로 대형 (최대 32 L 1-5 L에서 배열 하는 작은 볼륨)18, 화학 물질의 응용 프로그램을 매우 비싼 게. 몇 가지 연구는 무 균 조건8,에서 수경 재배를 설명 할19, 시스템의 어셈블리는 일반적으로 매우 힘 드는, 플라스틱이 나 유리에 나일론 메시의 완벽 한 조정의 구성 컨테이너5,8,,1720.

모델 식물으로 애기 thaliana 의 중요성 때문 수경 법 시스템의 대부분은이 종1,2,8,,1418, 을 위해 설계 되었습니다. 19 , 20. 그럼에도 불구 하 고, 그들의 발 아를 개선 하기 위해 씨앗의 전처리와 다른 식물 종의 수경 성장 기능을 보고 몇 가지 연구와 동기화 요금 체 외에서8,16 . 대규모 작업, 우리는 간단 하 고 저렴 한 비용 유지 보수 수경 시스템입니다 성장 하는 식물, A. thaliana 등 잔디 강아지 같은 다른 종족에 대 한 살 균 조건을 설정 하기 위한 프로토콜 개발 풀. 묘 종 성장을 최대화 수 있습니다 동기화, 그리고 쉽게 모니터링 방법을 여기에 설명 된 다른 실험을 위해 적당 하다. 또한,이 시스템은 많은 이점이 있다: (i) 해당 어셈블리는 간단 하 고 구성 요소를 다시 사용할 수 있습니다; (2) 액체 매체;에 다른 화학 물질의 쉬운 응용 프로그램 수 (iii) 묘 목 발 아 성장과 전이 필요 없이 문화 매체에서 직접 수경 법 시스템; (iv) 촬영 및 루트 개발/성장 밀접 하 게 감독 하 고 묘는 손해; 없이 수확 하 고 있다 (v) 그것은 가능 하 게 큰 규모로 일 생리 상태를 유지.

프로토콜

1. 액체와 고체 배양의 준비

  1. 비타민 [코발트 염화 물 pentahydrate의 0.0125 mg/L, copper(II) 황산 pentahydrate의 0.0125 mg/L, ethylenediaminetetraacetate 제 2 철 나트륨, 3.10 mg/L의 18.35 mg/L와 반 강도 Skoog (MS)와 村 重 매체를 사용 하 여 액체 매체 준비 붕 소의 산 성, 0.415 mg/L 요오드 화 칼륨, 망간의 8.45 mg/L의 황산 토스, 0.125 mg/L 나트륨 몰 리브 덴이 수화물, 4.30 mg/L 아연 황산 염 heptahydrate, 166.01 mg/L 칼슘 염화 물, 칼륨 디 인산, 950 mg/L의 85 mg/L의의 질 산 칼륨, 황산 마그네슘의 90.27 mg/L, 825 mg/L 질 산 암모늄의, 글리신의 1 mg/L, myo-이노 시 톨의 50mg/L, 니코틴산 산의 0.25 mg/L, 피리 독신 염 산 염의 0.25 mg/L 및 티 아민 염 산 염의 0.05 mg/L] 0.25 g/l의 보완 MES, 10 m 코 5.8에 pH를 조정 하 고.
  2. 한 천의 반 강도 MS-고체 매체를 만들기 위해 10 g/L를 추가 합니다. 압력솥 사용 하기 20 분 전에 121 ° C에서 매체.

2. 수경 시스템 조립

참고:이 단계를 따라야 한다 꼼꼼하게 수경 시스템을 구축.

  1. 소재 살 균
    1. 팩 압력솥 가방에 피 펫 팁 랙 (커버) 없이 minitanks로 사용 될 것 이다. 오토 클레이 브 랙 20 분, 15 psi에 대 한 121 ° C에서.
      참고: 우리가 사용 하는 폴 리 프로필 렌 피 펫 팁 랙 했다 다음 치수: 120 mm (길이) x 89 mm (폭) x 55 mm (높이). 피 펫 팁 평평한 표면 문화 매체의 추가 대 한 영역을가지고 있어야 합니다. 다른 팁 랙 사용 될 수 있다 ( 재료의 표참조).
      참고: 수경 시스템의 조립 절차, 그것은 청소 되어야 하며 사용 하기 전에 70% 에탄올으로 소독 하는 층 류 후드, 사용 하는 데 필요한. 실험 실험실 외 투를 착용 해야 합니다, 그들의 손을 씻고 하 고 노출 된 피부, 70% 에탄올으로 소독. 장갑은 약물 응용 프로그램 제외 옵션입니다.
    2. 층 류 두건에 들어가기 전에 70% 에탄올 (일회용 플라스틱 상자, 접착 테이프, 펫가 위, 및 핀셋) 위에서 설명한 모든 액세서리를 청소. 후드 허용 하는 경우 소독 작업 영역을 유지 하기 위해서는 수경 시스템을 조립 하기 전에 10 분 동안 UV 빛을 켜십시오.
  2. Minitank 조립
    1. 피 펫 팁 평평 접착 테이프로 (그림 1B)의 상부 표면 인감. 가능 하면 두고 자외선 아래 빛 10 분.
    2. 잘 사용 하 여 각 멀티 채널 피 펫 (그림 1C)에 녹은 고체에 MS 문화 매체 (약간 따뜻한)의 180 µ L를 추가 합니다.
      참고: 많은 탱크를 준비할 때 응고에서 MS 중간을 열판을 사용 합니다.
    3. 완전히 (약 30 분) 동안 강화 하기 위해 매체를 허용 합니다.
      참고: 응고 기간 동안 UV 빛 설정할 수 있습니다.
    4. 피 펫 팁 랙 액체 MS 문화 매체 (그림 1D)와 완전히 위로 고체와 액체 미디어 간의 긴밀 한 접촉 보장.
    5. 피 펫 팁 플랫의 상부 표면의 접착제 테이프를 제거 하 고 신중 하 게 선반에 맞는. 수경 시스템 이제 소독된 씨앗을 받을 준비가 되어 있습니다.

3. 종자 살 균

  1. 1.5 mL microtube에 장소 500 애기 씨앗. 많은 microtubes를 사용 하 여 실험에 필요한 식물의 수에 따라 필요에 따라.
  2. 부드러운 동요와 함께 2 분 동안 70% 에탄올과 씨앗을 씻어. 씨앗 정착, 다음 에탄올을 신중 하 게 제거 하자.
  3. 폴 20 세제의 2 µ L을 포함 하는 10% 염소 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 교 반 하십시오 5 분 제거를 위한 솔루션 솔루션 신중 하 게.
  4. 모든 표 백제 잔류물은 완전히 제거 (약 5 배) 될 때까지 살 균 증류수와 함께 씨 린스.
    참고: 표면 살 균 후 씨앗 살 균 증류수에 몰입 되었고 5 d는 발 아를 동기화를 위해 어둠 속에서 4 ° C에서 층 화.
    참고: 강아지 풀 (증가 A10.1)의 씨앗 15 분 (휴식 물리적 휴면) 집중된 한 황산에 preincubated, 멸 균 증류수에 철저 하 게 세척 되었고 5% 염소 솔루션 disinfested 포함 하는 부드러운 동요215 분 0.1% 폴 20. 나머지 살 균 단계 애기 씨앗에 대 한 설명에 동일 했다.

4. 씨앗 응용 프로그램

  1. 약간 메 마른 메스의 도움으로 200 µ L 팁의 말단 절단.
  2. 애기 씨 플랫 피 펫 팁의 상부 표면에 고체 배양으로 플라스틱. 매체는 평면;에서 느슨하게 하지 않습니다 돌 봐 그렇지 않으면, 씨앗 음영 처리 되며 묘 제대로 성장 하지 것입니다 (그림 1E).
    참고: (와 함께 위쪽으로 위치 배아) 강아지 씨에 대 한 살 균 족집게를 사용 합니다.
  3. 환경 미생물 (1 층 그림)에서 무료로 유지 하 고 높은 습도 유지 하는 일회용 플라스틱 상자 안에 가능한 많은 minitanks를 저장 합니다.
  4. 철저 하 게 오염을 피하기 위하여 접착 테이프를 사용 하 여 일회용 플라스틱 상자를 봉인 합니다.
  5. 수경 시스템의를 공장에 대 한 적절 한 성장 조건 성장 챔버에 넣으십시오.
    참고:이 작품에서 다음 조건 사용 되었다: 75%의 습도, 및 150 µmol m-2의 -1 의 irradiance 무더운 12 h 빛 (21 ° C) / 12 h 어두운 (19 ° C)에 대 한 조건을 애기, 또는 300 µmol m-2의 -1 의 irradiance와 12 h 빛 (28 ° C) / 12 h 어두운 (25 ° C) 강아지 (그림 1G 및 1 시간).

5. 검증 대상 Rapamycin 키 니 아 제를 억제 하기 위해이 수경 시스템의 사용

참고:이 수경 시스템 처음 식물을, 일반적으로 매우 비싼 대규모 실험에 적용 되는 화학 물질의 관리를 촉진 하기 위하여 개발 되었다. 개념의 증거로 서 ATP 경쟁 억제 물 AZD-8055, 특히 토르 단백질 키 니 아 제22의 ATP 바인딩 사이트를 대상으로 알려져, A. thaliana 컬럼비아-0 (모 종에서 토르 활동의 억압에 따라 고용 했다 노팅엄 애기 사진 센터, NASC ID: N22681). 여기, 사용 하는 프로토콜은 간단히 설명 합니다.

  1. 성장 씨앗 수경 무대 1.04는 BBCH 따라 규모23 (약 11 d) 때까지 위에서 설명한 기후 조건. 신선한 중간 포함 0.05 %DMSO (제어), 2 µ M로 영양소 솔루션 교체 AZD-8055 (토르 억제제) 밤 (EN)의 끝에 치료 (모의) 없이 DMSO, 또는 희석.
  2. 치료 후 다른 시간 지점에서 일부 묘 목 수확 하 고 뿌리와 새싹으로 그들을 분리. 액체 질소에서 샘플을 동결, 로봇 분쇄기에 정밀한 분말에 갈기 ( 재료의 표참조), 사용까지-80 ° C에서 분말을 저장.
  3. Phosphorylated 및 비 phosphorylated 형태의 로부터 40 ribosomal 단백질 S6 (RPS6) Dobrenel 그 외 여러분 에 따르면 Immunoblot 24.
  4. 샘플 depigmentation에 대 한 그대로 묘 표 백제, 증류수에 세척, 5 분25, 요오드 용액에 담가 그리고 stereomicroscope (목표, 20 x 근사, 및 7.5 x 크기 X 0.63)에 묘 목에 대 한 사진 한 녹말 함유량의 질적 평가입니다.
  5. NADPH26,27NADP+ 의 감소에 결합 하 여 효소 저하 및 출시 된 혈당 측정을 spectrophotometrically 다음 전 분을 계량.
  6. 총 RNA 추출, cDNA 합성, 그리고 Caldana 그 외 여러분 에 의해 설명된대로 양적 RT-PCR 분석 실험을 수행 긴장의 다른 종류와 관련 된 유전자의 식 수준을 평가에 28 .
  7. 필요한 경우, 유사한 기후 조건 [습도 60%, 150 µmol m-2의 -1 의 방사, 및 무더운 조건 12 h 빛 (21 ° C) / 12 h 어두운 (19 ° C에서 0.1 L 용량 플라스틱 화분에서 원 예 기판에 묘 목 성장 )] 모 종 수경 재배와 그들을 비교 하기 위해
    참고: 대상 유전자 유전자 표정 분석 실험에 사용 했다 ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), 및 TPS5 (At4g17770), 및 그들의 식 수준 를 사용 하 여 델타 Ct 방법29 고용 정상화 했다 ACT2 (At3g18780) 또는 PDF2 (At4g04890) 내부 기준 유전자로 모든 샘플에서 PCR 증폭 효율의 100%를 가정. 양이 많은 PCR에 사용 하는 oligonucleotide 쌍 했다: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG), 및 PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT)입니다.

결과

토르 니 영양소와 세포 증식 및 성장 모든 진핵생물에서 신호 에너지를 통합 하는 주요 레 귤 레이 터 이다. 애기 유전자 변형 줄 RNA 간섭 또는 인공 예측에 관한28,,3031, 토르 조건부 억압의 생성을 포함 하는 식물에서 TOR 기능을 명료 하 게 하는 노력 토르 녹아웃 식물32,...

토론

이 최적화 된 수경 구조 식물의 성공적인 생체 외에서 문화를 수 있습니다. 씨앗은 잘 피 펫 팁 평평한 표면에 고체 매체, 씨앗 영양 솔루션 젖된 시스템에 비해 상당한 이득에 출 아 할. 이 시스템의 큰 장점은 그 종묘 개발 하는 동안 뿌리 연락해 직접 전이의 필요 없이 액체 매체 이다. 또한, 화학 치료 감소 볼륨에 액체 매체에 쉽게 적용할 수 있습니다. 습도 높은 영양소 솔루션 및 그것의 ...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 작품은 상 파울로 연구 재단 (FAPESP;에 의해 지원 되었다 12/19561-0 부여) 및 막스 플랑크 협회. 엘리아스 F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), 캐롤라이나 C. 몬테 벨로 (FAPESP; 14/10407-3 그랜트) Valéria Mafra (FAPESP; 부여 14/07918-6), 그리고 비비 안 C. H. 다 실바 (망 토/CNPEM 24/2013)는 장학금에 대 한 감사. 저자 아낌없이 RPS6에 대하여 항 체를 제공 하는 기독교 메이어 인 장 피에르 Bourgin (INRA, 베 르 사 이유, 프랑스)에서 감사 합니다. 저자 감사 RTV UNICAMP와에 드 파울로 Aparecido de Souza Manoel 오디오 동안 그들의 기술 지원에 대 한 기록.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
EthanolMerck100983
Sodium hypochlorite solutionSigma-Aldrich425044
Polysorbate 20  Sigma-AldrichP2287
Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins Duchefa BiochemieM0222
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrateDuchefa BiochemieM1503
Agar Sigma-AldrichA7921
Potassium hydroxideSigma-Aldrich484016
Laminar flow hoodTelstarBH-100
HotplateARECF20510011
Growth chamberWeiss TechnikHGC 1514
Glass Petri dish (150 mm x 25 mm)Uniglass189.006
200 μL pipette tip racks KasviK8-200-5 *
300 μL multichannel pipetteEppendorf3122000060
300 μL pipette tipsEppendorf30073088
200 μL pipette Eppendorf3120000054
200 μL pipette tipsEppendorf30000870
ScissorsTramontina25912/108
TweezerABC Instrumentos702915
Scalpel bladeSigma-AldrichS2771
Adhesive transparent tape (45mm x 50m)Scotch 3M5803
Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H)Maxipac32771

참고문헌

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