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요약

꽃 식물에 균 스프레이 고독한 꿀벌 꽃가루 부담 균 잔류물의 높은 농도에 노출 될 수 있습니다. 실험실 기반 실험 체 외에관련 된을 사용 하 여-reared 꿀벌 애벌레,이 연구 균 처리 꽃가루 호스트와 호스트 비 식물에서 파생 된 소모의 대화형 효과 조사.

초록

고독한 꿀벌 와일드 하 고 관리 되는 작물에 대 한 중요 일 분의 서비스를 제공 하는 있지만이 종 부유한 그룹 크게 간과 되어 농약 규제 연구. 살 균 제 잔류물에 노출의 모험 경우 스프레이 또는 호스트 식물 근처에, 꿀벌은 그들의 둥지를 구축 하는 꽃가루를 수집 하는 동안 특히 높을 것입니다. 꽃가루 식물 (oligolecty)의 선택 그룹에서 사용 하는 Osmia 의 종, 비 호스트 식물에서 꽃가루를 사용 하는 무 능력 살 균 제 관련 독성에 대 한 그들의 위험 요소를 높일 수 있습니다. 이 원고는 성공적으로 oligolectic 메이슨 꿀벌, 표준화 된 실험실 조건에서 세포 배양 배지 내에서 prepupal 단계를 달걀에서 Osmia ribifloris sensu lato 후면에 사용 되는 프로토콜을 설명 합니다. 생체 외에서-reared 꿀벌 이후 벌 체력에 살 균 제 노출 및 꽃가루 소스의 효과 조사 하기 위해 사용 됩니다. 2 × 2 완전히 넘어 계승 디자인에 따라 실험 prepupal 바이오 매스, 애벌레 발달 시간 및 survivorship 계량 애벌레 피트 니스에 살 균 제 노출 및 꽃가루 근원의 주요 및 대화형 효과 검사 합니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 외에서사용 하 여-reared 꿀벌 자연 배경 가변성을 감소 시킨다 고 여러 실험적인 매개 변수의 동시 조작 있습니다. 설명된 프로토콜 가설 꿀벌 건강에 영향을 미치는 요인의 제품군과 관련 된 테스트에 대 한 다양 한 도구를 제공 합니다. 중요 한, 지속적인 성공을 충족 되어야 보존 노력에 대 한 꿀벌 감소를 촉진 하는 생리와 환경 요인의 복잡 한 상호 작용으로 이러한 통찰력 중요할 증명할 것 이다.

서문

곤충 가루1의 지배적인 그룹으로 서의 역할을 감안할 때, 꿀벌 인구에 있는 글로벌 손실 위협이 식량 안보 및 생태계 안정성2,3,,45,6 ,7. 모두와 야생 꿀벌 인구에 있는 감소 추세 있다 서식 지 파편, 신흥 기생충 및 병원 균, 유전적 다양성의 손실 및 침입 종3의 도입을 포함 한 여러 공유 위험 요인에 기인 ,4,7,8,9,10,,1112. 특히, 증가 (예를 들어, neonicotinoids), 농약의 사용은 꿀벌13,,1415간의 해로운 효과에 직접 연결 되었다. 여러 연구 neonicotinoids 사이의 ergosterol 생 합성 억제 (비) 살 균 제 성분 여러 벌 종16,,1718 에서 높은 사망으로 이어질 수 있습니다. , 19 , 20 , 21 , 22. 그럼에도 불구 하 고, 살 균 제, 긴 ' 비 안전 '으로 간주 많은 감시23없이 꽃에서 작물에 살포 될 계속. 채집 자 벌 려 정기적으로 살 균 제 잔류물24,,2526으로 오염 하는 꽃가루 중 문서화 되었습니다. 같은 살 균 제 ladenpollen의 소비 애벌레 꿀벌27,,2829,30및 성인 꿀벌16 중 하위 치명적인 효과의 제품군 중 높은 사망을 일으킬 수 있습니다. , 31 , 32 , 33 , 34. 최근 연구 제안 fungicides 꿀벌 꽃가루 부담 미생물35사이 중요 한 공생을 방해 함으로써 하이브 저장 꽃가루 내 미생물 커뮤니티를 변경 하 여 비 손실을 발생할 수 있습니다.

고독한 꿀벌은 여러 야생 및 농업 식물36,37,의 수 분에 대 한 중요 한38, 가루의이 다양 한 그룹 연구를 모니터링 하는 농약에 훨씬 덜 관심을 받고 있다. 성인 고독한 여성의 둥지 5-10 봉인된 브루 드 챔버, 각 임산부 수집 꽃가루와 꿀, 그리고 단일 계란39의 유한 질량 갖춰져 있습니다. 후에 부 화, 애벌레 할당 된 꽃가루 규정 그리고 적절 한 영양40,41관련된 꽃가루 부담 microbiota에 의존 합니다. 사회 생활의 혜택, 부족 하기 때문에 고독한 꿀벌 농약 노출42에 더 취약 있을 수 있습니다. 예를 들어, 다음 스프레이 사회 꿀벌에 적자 동안 보상 수도를 일부 노동자에 의해 확장 하 고 새로 가만히 신흥, 단일 성인 고독한 여자의 죽음 끝 모든 생식 활동43. 민감성에 이러한 차이 ecotoxicological 연구와 야생 꿀벌 모두에 대 한 적절 한 보호를 보장 하기 위해 다양 한 비 taxa를 통합할 필요가 강조 표시 합니다. 그러나, 연구의 한 줌, 외 균 노출의 효과에 대 한 조사는 주로에 초점을 맞춘 사회적 꿀벌18,23,32,44,45 ,,4647,,4849.

고독한 꿀벌 속 Osmia (그림 1)에 속하는 몇 가지 중요 한 과일 및 견과 작물39,50,,5153, 의 효율적인 가루로 사용 되었습니다. 53. 다른 관리 pollinator 그룹24,54,,5556,,5758성인 Osmia 꿀벌은 정기적으로 44-꽃 작물 살포 하는 균에 노출. 최근 스프레이 작물에 식량 약탈을 배워 성인 여성 수집 하 고 재고 나중 발전 애벌레에 대 한 유일한 다이어트를 형성 하는 균 라덴 꽃가루와 그들의 브루 드 실 수 있습니다. 오염된 꽃가루 규정 사용 후 살 균 제 잔류물42애벌레를 노출할 수 있습니다. 노출의 위험 몇 가지 밀접 하 게 관련된 호스트 식물59,,6061에 사료 oligolectic 종 가운데 더 높은 수 있습니다. 예를 들어 특정 megachilid 꿀벌 우선적으로 기생62를 줄이는 수단으로 고품질 국화과 꽃가루에 대 한 마 초 나타납니다. 그러나,는 균 중 oligolectic 고독한 꿀벌 애벌레 피트 니스 영향 정도 하지 되었습니다 실험적으로 측정할. 이 연구의 목표 주요 테스트 프로토콜을 개발 하는 것 이며 생체 외에서 의 피트 니스에 살 균 제 노출 및 꽃가루 소스의 대화형 효과 reared 고독한 꿀벌. 조사, O. ribifloris sensu lato (s.l.)의 계란 얻어질 수 있다 상업적으로 (자료 테이블). 이 인구는 네이티브 pollinator는 지역53,63,64 내 과즙이 풍부한 Mahonia aquifolium (오 레 곤 포도)에 대 한 그것의 강한 취향이로 그것의 중요성 때문에 이상적인 (그림 2).

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그림 1입니다. 성인 Osmia ribifloris의 고해상도 사진. 사진 박사 짐 지팡이, 연구 곤충학자, 미국 농 무부-ARS 신용 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 2입니다. 중첩 중첩 여성 전경. 에 Osmia ribifloris (s.l.) 의 갈 대 Phragmite 챔버 파티션 및 갈 대에 대 한 터미널 플러그 masticated 잎에서 건설 한다. 사진 제공 씨 킴 볼 클락, NativeBees.com 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

이 연구의 첫 번째 목적은 애벌레 피트 니스 (개발 시간 및 prepupal 생물 측정)에 살 균 제 처리 꽃가루를 사용의 효과 평가 하는 것입니다. 일반적인 적용된 살 균 제 propiconazole에 노출은 여러 종 23,,2432,44,45, 전체 성인 꿀벌 중 사망률 증가에 연결 되었다 하는 동안 은 54,55,56,,5758,65,66,67, 애벌레 꿀벌에 미치는 영향 알려진. 이 연구의 두 번째 목적은 비 호스트 꽃가루 애벌레 체력에 소모의 효과 평가 하는 것입니다. 이전 연구 oligolectic 꿀벌의 애벌레 아닌 호스트 꽃가루68소비 하도록 개발 실패를 나타냅니다. 이러한 결과 변화 비 생리학69, 꽃가루 생화학70, 그리고 자연 꽃가루 규정71와 관련 된 유익한 미생물에 표시 될 수 있습니다. 이 연구의 세 번째 목적은 애벌레 체력에 균 치료와 식이 꽃가루의 대화형 효과 평가 하는 것입니다.

모성 신체 크기를 포함 하 여 수많은 생물 학적 특성, 속도, 프로비저닝 구하고 전략과 꽃가루 수량72,,7374,75 알려져 있습니다 고독한 꿀벌 중 애벌레 적합성에 영향을 미칠. 이러한 요소는 애벌레 건강을 평가할 때 방어할 수 있는 실험적인 디자인을 개발에 도전 포즈 갈 대 사이 뜻깊은 가변성을 발생할 수 있습니다. 또한, 애벌레의 개발 된 중첩 갈 대 내부에서 발생, 그 자손에 이러한 가변성의 효과 시각화 하기가 어렵습니다과 계량 없이 치명적이 지 않은 기법 (그림 3). 이 문제를 해결 하려면 모든 가설이이 연구에서 그들의 중첩 갈 대 외부 reared 애벌레를 사용 하 여 테스트 합니다. 실험 설계는 완전히 교차 2 × 2 계승 설정, 각 인자 2 수준; 구성 된 대표 요인 1: 살 균 제 노출 (살 균 제; 아니 살 균 제); 팩터 2: 꽃가루 소스 (호스트 꽃가루, 비-호스트 꽃가루). 꿀벌 계란에서 통제 된 실험실 조건에서 살 균 multiwell 세포 배양 배지 내에서 prepupal 단계를 발생 합니다. 각 잘는 개별적으로 각종 꽃가루 제공 및 단일 계란 표준화 된 양의 있습니다. 해칭, 후 유 충 우물 내에서 할당 된 꽃가루에 피드를 애벌레의 개발을 완료 고 pupation 시작. 과거의 연구 원인 불명된 사망은 야생49,76에서 발생 보다이 인공 양육 환경 내에서 발생 하는 꿀벌 가운데 낮은 나타났습니다. 생체 외에서의 사용-reared 꿀벌 필드 기반 연구를 통해 몇 가지 이점이 있다: 1) 그것은 자연적인 가변성 및 필드 기반 연구;와 일반적으로 관련 된 통제 요인의 혼동 영향을 최소화 2) 그것은 조작 각 factor(s)에 대 한 관심을 동시에 치료 그룹; 테스트의 여러 레벨을 허용 한다 3) 복제의 수를 미리 결정 된, 수 및 각 복제에 대 한 실험적인 요소를 개별적으로 조작할 수 있습니다. 4) 애벌레 응답 변수를 쉽게 시각화 하 고 방해 인접 한 애벌레; 없이 독립적으로 기록 된 수 있다 5) 프로토콜 여러 요인과 반응 변수 관련 된 더 복잡 한 실험 설계에 맞게 수정할 수 있습니다.

figure-introduction-7790
그림 3입니다. 자연 중첩 리드의 내용을 Osmia ribifloris (s.l.). (A) 개별 챔버, 꽃가루 규정 및 파티션, 및 (B)를 갓 보여주는 해 부 리드 수확 꽃가루 규정과 관련 된 계란 (검은 원 표시) 닫습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

프로토콜

1. 살 균 제 노출 실험을 위한 Propiconazole 솔루션 준비

  1. 실험의 하루 살 균 물에 상업적으로 구입한 propiconazole 14.3%의 적절 한 볼륨을 용 해 하 여 균 솔루션 x 0.1을 준비 합니다. 모든 치료에 대 한 유일한 갓된 균 솔루션 사용은 확인 합니다.
  2. 꿀벌 수집 꽃가루24 (0.361 PPM 또는 꽃가루의 활성 성분 g-1 의 µ g)에서 이전에 보고 된 propiconazole의 최대 농도를 꽃가루의 그램 당 균 솔루션 x 0.1의 23 µ L를 추가 합니다.

2. 계란과 호스트 Osmia 갈 대에서 꽃가루 규정을 수확

  1. 멸 균된 메스를 사용 하 여, 갓 갈 대 Osmia의 중첩, 개별 실 노출 리드의 길이 따라 두 부분으로 분할 연결 해 부.
    참고: 각 둥지는 8 ~ 14 챔버와 챔버 내에서 단일 계란 사이 포함할 수 있습니다.
  2. 이전에 게시 지침77에 따라 남성 계란을 포함 하는 실을 식별 하는 시각적으로 갈 대를 검사 합니다. 중첩 리드에서 관련된 달걀 함께 각 꽃가루 규정을 제거 하 고 깨끗 한 장소 소독된 구부러진된 바늘을 사용 하 여 보트 무게.
  3. 부드럽게 깨끗 한 벌금 페인트 브러시를 사용 하 여 제공에서 계란을 분리 하 고 꽃가루 조항의 신선한 무게 기록 표준 실험실 균형을 사용 하 여 계란. 남성 꽃가루 규정의 평균 중량을 계산 합니다.
  4. 초과 온도 탈수에 노출에서 계란에 손상의 기회를 줄이기 위해 최소 지연으로 다음 단계를 수행 합니다.

3. 준비 호스트 식물 꽃가루 규정

  1. 없는 기생충 현재78되도록 중첩 챔버에서 발굴 임산부 수집된 호스트-식물 꽃가루를 않았는지 살펴보십시오. 어떤 잠재적인 모성 편견을 줄이기 위해 멸 균 페 트리 접시에 단일 대량으로 꽃가루 규정을 결합 하 고 멸 균된 바늘을 사용 하 여 잘 혼합 합니다.
  2. 새로운 꽃가루 규정, 각 재구성의 무게는 자연스럽 게 할당 된 남성 규정의 평균 무게에 거의 같은 보장에 결합 된 질량을 분할 (의미 ± SE, 0.35 ± 0.01 g, N = 42).
    참고: 때문에 Osmia sp. 작은 꽃가루 규정 남성 자손, 여성77에 비해 남성 애벌레의 낮은 몸 무게에이 결과에 할당 합니다. 어떤에 게 섹스의 차이점에서 발생 하는 이러한 바이어스를 방지 하려면 실험에서 남성 계란만 사용 합니다.

4. 비 호스트 식물 꽃가루 제공 준비

  1. 표준 실험실 볼 밀을 사용 하 여 정밀한 분말에 상업적으로 구입한 꿀 꿀벌 수집 꽃가루 격파
  2. 임산부 수집 호스트 꽃가루 규정 (~ 20%)의 함량에 따라 달라 집니다, 꽃가루 가루 반죽 같은 일관성을 형성 하기 위하여 철저 하 게 소독 40% 설탕 솔루션79 및 혼합의 적절 한 볼륨을 사용 하 여 하이드 레이트.
  3. 개별 꽃가루 질량으로 분할 자연스럽 게 할당 된 남성 규정의 평균 무게와 같은 무게 약 각.
    참고: 규정 30 무작위로 선택 된 남성 챔버80에서 꽃가루 규정의 신선 하 고 건조 중량을 비교 하 여 사전에 표준화 될 수 있다 임산부 수집된 호스트 꽃가루 수 분 콘텐츠입니다. 건조 중량을 얻으려면, 꽃가루 규정 한 lyophilizer에서 동결 해야 (1.5 72 h에 대 한 펜 실바 니 아).

5. 준비 Multiwell 세포 배양 배지

  1. 압력가 주석 컵 (5 × 9 cm)와 살 균 48-잘 문화 판의 개별 웰 스 라인. 꽃가루 조항을 수용할 수 있도록 살 균 겸 부드럽게 캡슐의 위쪽 테두리 밖으로 감각을 사용 합니다.
  2. 호스트 또는 호스트 비 꽃가루의 단일 대량 치료 그룹에 따라 살 균 도구를 사용 하 여 주석 컵 안에 배치 합니다.
    참고: 교차 오염을 피하기 위해, 치료 및 제어 그룹에 대 한 별도 접시를 사용 합니다.

6. Fungicides를 추가

  1. 메 마른 나무 막대기를 사용 하 여 꽃가루 질량 내의 중앙 배치 우울증을 확인 합니다. 새로운 막대기를 사용 하 여 각 꽃가루 조항에 대 한.
  2. 우울증에 (치료)에 대 한 살 균 제 솔루션 또는 살 균 물 (컨트롤)에 대 한 적절 한 볼륨을 추가 합니다. 핀치는 살 균 제 사이의 표면 접촉을 최소화 하기 위해 살 균 집게를 사용 하 여 우울증의 열기 / 살 균 물과 계란.
  3. 실험적인 디자인의 계승 설정 그 일치 해야 도식 표현 (그림 4)에 묘사 된.

figure-protocol-2718
그림 4입니다. 실험적인 체제의 도식 대표. 실험을 완전히 넘어 2 × 2 계승 설정을 나타냅니다. 1 살 균 제 노출 나타냅니다 비율과 2 레벨의 구성: (i) 균 (N = 10), 그리고 (ii) 균 (N = 10). 2 꽃가루 소스 나타냅니다 비율과 2 레벨의 구성: (i) 호스트 꽃가루 (N = 8), 그리고 (ii) 비-호스트 꽃가루 (N = 8). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

7. 후방 고 애벌레 관찰

  1. 장소 깨끗 한 벌금 페인트 브러시를 사용 하 여 꽃가루 규정의 위쪽 표면에 임의로 선택 된 남성 계란. 일단 계란 모든 규정에 배치 되었습니다, 그리고 라벨 모서리에 테이프와 보호 셀 문화 접시의 뚜껑을 대체.
  2. 깨끗 한 쟁반에 잘 접시를 놓고 직접 빛과의 접촉을 방해 어두운 천으로 커버. 장소 6 잘 플레이트의 건조를 방지 하기 위해 트레이 내의 살 균 물 포함 30 mL. 실 온에서 부 화 쟁반 인큐베이터 안에 그대로 둡니다.
  3. 잘 접시의 뚜껑을 제거 하지 않고 해 현미경 매일 잘 접시를 관찰 합니다. 애벌레는 살아 움직임을 확인 하 여 확인 합니다. 아무 움직임을 감지할 경우 죽은 애벌레와 나머지 꽃가루 규정을 포함 하는 주석 컵 폐기. 모든 살아남은 애벌레 prepupal 단계를 도달할 때까지 그대로 잘 플레이트 내에서 개발 하는 것을 허용 한다.
  4. Prepupal 단계41에 도달 하면 주석 컵에서 유 충을 제거 합니다. 어떤 청소 브러쉬를 사용 하 여 실크 누에고치에서 똥. 신중 하 게 해 현미경을 사용 하 여 실크 누에고치를 극복 하 고 고무 집게와는 prepupa를 추출 합니다.
  5. Prepupa 도구 소프트 바디 피어스 하지 할 수 있도록 부드럽게 처리 합니다. Prepupa (prepupal 바이오 매스)의 prepupal 단계 (애벌레 발달 시간)에 계란에서 개발 시간 신선한 무게를 기록 합니다.
    참고: 모든 죽은 유 충 시신에 남은 꽃가루 조항 원치 않는 미생물 성장을 방지 하기 위해 즉시 삭제 됩니다 해야 합니다. 이 나머지 건강 한 애벌레를 감염의 위험을 줄여줍니다.

결과

애벌레 피트 니스 3 통계 (i) 애벌레 발달 시간, (ii) prepupal 바이오 매스, 그리고 (iii) %survivorship 사용 하 여 정량 했다. 양방향 ANOVA 균 노출을 사용 하 여 실시 되었다 (2 레벨: 아니 살 균 제, 살 균 제) 및 꽃가루 소스 (2 레벨: 호스트 꽃가루, 비-호스트 꽃가루) 독립 변수와 종속 변수 애벌레 발달 시간으로. 살 균 제 노출에 대 한 주요 효과 (F1,28 = 1.24, P = 0...

토론

그들의 자연적인 중첩 갈 대, 실험실 조건 하에서 외부 꿀벌을 양육 애벌레 피트 니스에 관한 여러 가설의 테스트 수 있습니다. 수 정체 불명된 요인 계속 비 사망 원인, 위험 평가 연구 생체 외에서 사용 하 여 실험 수 잠재적인 위협을 식별 하 고 야생 가루 12의이 종 부유한 그룹에 대 한 관리 사례를 알려 ,38,49,...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

저자 감사 실험실 박사 카 메 론 커리, 크리스텔 Guédot, 테리 Griswold, 마이클 Branstetter,에 대 한 3 명의 익명 검토자에 몰리 Bidwell, 디스 네 스 빗 및 Osmia 중첩 갈 대를 제공 하기 위한 팀 Krogh, Kimball 클락 원고를 개선 하는 그들의 유용한 의견. 이 작품은 미국 농 무부 농업 연구 서비스 충당 자금 (현재 연구 정보 시스템 #3655-21220-001), 위스콘신 농업의, 무역 및 소비자 보호 (#197199), 국립 과학 재단 (에 의해 지원 되었다 부여 번호 DEB-1442148), 미상 그레이트 호수 Bioenergy 연구 센터 (과학 BER 드-FC02-07ER64494의 암컷 사무실).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
eggs of O. ribifloris sensu lato (s.l.)Kaysville, Davis County, Utah, USA
Osmia reedsNativebees.comNAFreshly plugged reeds
Dissection setVWR89259-964Sterilize before use
Long Nose PliersHusky1006
6 well culture platesVWR10062-892Sterile sealed
48 well culture platesVWR10062-898Sterile sealed
Petri dishesVWR25373100Sterile sealed
Square Weighing BoatsVWR10770-448
Camel Hair BrushBioquip1153A
Tin capsulesEA ConsumablesD1021Sterilize before use
SucroseVWR470302-808
Propiconazole 14.3Quali-Ppro60207-90-1Propiconazole 14.3%
Honey bee pollenBee energised897098001244Untreated, natural, raw pollen
MicrobalanceVWR10204-990
PulverisetteLAB SYNERGY INC.30334913
Wooden sticksVWR470146908Sterilize before use
Sealing tapeVWR89097-912
MicroscopeVWR89403-384
Planting trayVWR470150-632
EthanolVWRBDH1158-4LP
Centrifuge tubeVWR21008936
MicrosyringeCole-PalmerUX-07940-07
Rubber tweezerAmazonB0135HWPN4
Syringe needlesVWR89219-334
Freeze drierLabconoLFZ-1L
Statistical softwareSPSSVersion 21.0

참고문헌

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