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요약

이 프로토콜 설계 및 다중화 비활성화 융해 단백질 SID4X-dCas9-리아로 알려진 또한 증강 간섭 (증강 인자-i)와 강화의 대상으로 수행 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 이 프로토콜 유전자 발현을 조절 하는 강화의 식별을 가능 하 게 일반적인 대상 유전자 규제 강화 간의 관계의 해 부를 촉진 한다.

초록

여러 강화 종종 주어진된 유전자 조절 아직 대부분 유전자에 대 한 그것은 불분명 남아 있는 강화 유전자 발현에 대 한 필요 하 고 어떻게 이러한 강화 결합 transcriptional 응답. 강화의 수백만 확인 되었습니다로 높은 처리량 도구 게놈 넓은 규모로 증강 기능 확인 필요 합니다. 증강 기능 공부에 대 한 현재 방법은 유전자 삭제 nuclease 실력 Cas9를 사용 하 여 만드는 포함 하지만 여러 연속 클론 셀 라인으로이 기술을 사용 하 여 여러 강화의 조합 효과 공부 하기 어려운 생성. 여기, 선물이 증강-i, 그들의 생 loci에서 동시에 여러 강화의 기능 심문 수 CRISPR 간섭 기반 방법. 증강 인자-i 타겟된 loci에서 히스톤 deacetylation 통해 증강 비활성화 달성 하기 위해 융합 nuclease 불충분 한 두 억압 도메인의 Cas9, SID와 리아, 사용 만든다. 이 프로토콜 가이드 대상된 지역의 일시적인 비활성화 수 있도록 RNAs의 과도 transfection를 활용 하 고 특히 조직 문화 설정에서 자극을 유도할 수 있는 transcriptional 응답을 차단에 효과적 이다. 증강 인자-i은 모두 그것의 게놈을 대상으로 글로벌 유전자 발현에 미치는 영향에 매우 구체적인. 이 프로토콜에서 얻은 결과 증강 유전자 발현, 기여, 규모와 어떻게 기여는 영향을 받는 다른 인근 강화에 기여 하 고 있는지 이해 하는 데 도움이.

서문

시퀀싱 프로젝트 인코딩1, 로드맵 Epigenomics2, FANTOM 등 대규모3 확인 했습니다 인간 게놈 내 상 상속 강화의 수백만 수백 종류의 세포에서. 각 발기인 4.9 강화의 평균 연결 하 고 각 증강 연락처 2.4 유전자3의 평균 유전자 발현은 종종 여러 분산된 규정 상호 작용의 통합의 결과 제안 추정 된다. 중요 한 나머지 과제 정의 개별 강화 뿐만 아니라 유전자 발현에 기여 하는 하지만 어떻게 그들이 결합 하 여 식에 영향을 미칠. 유전 접근 일반적으로 쥐5 초파리4 에서 모형 유기 체에 강화 간의 관계를 식별 하는 데 사용 됩니다. 그러나,이 실험은 어렵고 여러 유전자에서 여러 강화의 연구에 대 한 낮은 처리량.

큰 규모로 증강 기능을 공부 하는 한 가지 방법은 대규모 병렬 기자 분석 실험을 포함 한다. 이 분석 실험 기자 유전자6식 드라이브를 그들의 능력에 대 한 DNA 시퀀스의 수천의 동시 상영에 대 한 수 있습니다. 이 분석 실험 DNA 순서 혼자 유전자 규칙 정보7전달 하기 충분할 수 나타났습니다, 그들은 온 네이티브 chromatin 컨텍스트 외부에서 수행 되 고의 주의 분리의 발기인. 또한, 대규모 병렬 기자 분석에 분석 되 고 DNA 시퀀스의 크기는 일반적으로 관련 주변 시퀀스를 제외 시킬 수 있습니다 미만 200 basepairs. 중요 한 것은, 기자가 분석만 한 번에 하나의 시퀀스의 활동 측정, 그들은 할 하지 고려 강화 사이 존재할 수 있는 복잡 한 관계. 따라서, 대규모 병렬 기자 분석 DNA 시퀀스의 본질적인 활동에 대 한 정보를 제공 될 수 있습니다, 그들은 할 하지 반드시 우리에 게는 게놈의 맥락에서 그 DNA 시퀀스의 기능.

최근 개발 된 CRISPR/Cas9 도구8 있다 그들은 내 생 로커 스에서 강화의 삭제에 대 한 허용 유전자 규칙의 연구를 촉진 했다. 그러나, genomic 불안정성으로 이어질 수 있습니다 여러 강화를 동시에 삭제 하 고 그것은 단일 셀 라인에서 연속 증강 삭제를 생성 하는 시간이 소요. 또한, 새로운 게놈 시퀀스 삭제 복구, 다음의 사이트에서 생성 되 고이 시퀀스 규제 기능을 얻을 수 있습니다. Cas9의 대체 버전9,10 활성화 또는 nuclease 불충분 한 형태의 Cas911,12 도메인을 억압의 융해에 의존 하는 유전자 발현을 변조를 위해 특별히 개발 되었습니다. (dCas9)입니다. 이 융해 단백질 그들은 육체적으로 DNA 순서를 변경 하 고 대신 epigenetics 규제 영역을 심문 하기 위해 변조로 여러 loci를 동시에 공부에 이상적입니다. 가장 널리 사용 되는 억압 적인 퓨전 리아, KAP1 공동 진압 복잡 한 신병이 억압 관련 히스톤 H3 리 진 9 trimethylation (H3K9me3)13의 증 착을 홍보입니다. dCas9-리아, 일컬어 CRISPR 간섭14,16; 유전자의 식15,그들의 공헌에 대 한 대상과 화면 개별 강화를 사용 되었습니다. 그러나, 그것은 하지 최적화 되었습니다 여러 영역을 동시에 대상에 대 한. 강화, 모자이크-seq17, 다중 CRISPR 간섭의 한 버전 사용 단일 셀 RNA-seq는 판독 하지만이 기술은 단일 셀의 낮은 감도 때문에 높게 표현한 유전자의 연구에만 적합 하 고 비싼 RNA-이

우리가 스 트로 겐에 transcriptional 응답의 컨텍스트 내에서 조합 증강 기능 해 부에 대 한 CRISPR 간섭을 기반 방법을 개발 하고자 했다. 스 트로 겐-응답 유전자의 약 절반 2 이상의 강화 근처의18, 에스트로겐 수용 체 알파 (응급실)을 준수할 여러 강화 에스트로겐 응답에 참여 하 고 규제 논리 필요 이해 수 있습니다 제안 포함 동시에 여러 명의 강화를 목표로. 초기 연구에서 발기인 CRISPR 방해를 사용 하 여 모든 발기인은 동등 하 게 리아 중재 억압19응답 제안, 우리 dCas9 별개의 억압 적인 도메인 추가의 비활성화를 촉진 수 있습니다 권유 다양 한 강화입니다. 우리 선택 Sin3a 상호 작용 도메인의 Mad1 (SID)20 히스톤 deacetylases21의 채용에 리드에 transcriptional 활동에 연관 된 히스톤 아 세 틸 그룹을 제거 하는. 중요 한 것은, SID 도메인 dCas922 와 이야기23, 융합 하는 때 유전자 발현을 감소에 효과적 이었고 Sin3a 다양 한 증강 시퀀스 컨텍스트24에 강력한 억압 적인 공동 요인이 될 표시 되었습니다. 우리 응급실, 준수할의 다른 강화 10 개를 대상으로 SID4x-dCas9-리아 (증강 인자-i)를 사용 하 고 응급실 바인딩 사이트 (ERBS) 4 유전자18에 스 트로 겐 transcriptional 응답에 필요한 식별 합니다. 우리는 또한 에스트로겐 transcriptional 응답의 생산에 협력 하는 사이트를 식별 하는 증강의 조합 대상. 우리는 50 개 사이트까지 잠재적으로 타겟팅 할 수 있습니다 동시에 감지 유전자 식 변화 발견. 칩 seq와 RNA-seq 사용 하 여, 우리는 증강-i은 여러 강화를 동시에 공부에 대 한 매우 구체적인 기술 시연 했다.

이 프로토콜에서 우리는 증강-i, 조직 문화 설정에 동시에 여러 강화의 기능 연구를 가능 하 게 하는 유연한 기술 수행에 관련 된 단계를 설명 합니다. 증강 인자-i 유전자 삭제와 상관 매우 하지만 히스톤 deacetylases (HDACs)에 따라 달라 집니다 일시적인 비활성화를 제공 합니다. 바이러스 성 벡터를 통해 안정적인 통합 반대 과도 transfection을 통해 가이드 RNAs를 제공,이 프로토콜 증 착 및 H3K9me3의 잠재적인 확산 방지 합니다. 이 프로토콜 세부 정보 가이드 RNA 디자인 및 깁슨 어셈블리의 transfection 통해 복제 RNAs lipofection를 사용 하 여 가이드와 결과 유전자 발현의 분석 정량 하 여 변경. 우리는 또한 게놈 transcriptome 수준에 증강-i 대상의 특이성을 평가 하기 위한 메서드가 포함 됩니다. 이 기술을 연구 개발 하는 동안 어 유전자 규정 강화 인간 암 세포 라인에서 어떤 포유류 증강의 해 부에 적용 됩니다.

프로토콜

1. 셀의 세대 라인 안정적으로 표현 하는 SID4X-dCas9-리아

참고: transfection 조건 및 약물 농도 여기 있다 최적화 되었습니다 이시카와 셀, 자궁내 막 암 세포 선, 10 %FBS 1% 페니실린/스 (완전 한 RPMI)와 보충 RPMI 1640 미디어에서 성장. 다른 셀 라인 다른 transfection 조건 및 약물 농도 필요할 수 있습니다. 사용자가 또한 야생-타입 셀, SID4X-dCas9-리아 가이드 RNA 플라스 미드; 표현 함께 표현 하는 플라스 미드와 안정 셀 라인을 생성 하는 대신에 과도 transfection 실험을 수행할 수 있습니다. 그러나, 일시적인 transfections에서 결과 transfection에 의해 다를 수 있습니다 SID4X-dCas9-리아 수준으로 재현 하기 어려울 수 있습니다.

  1. 완전 한 RPMI의 3 mL에 30-50% 합류 (약 300000 이시카와 셀)에서 6 잘 플레이트의 적어도 2 우물에 이시카와 셀 플레이트.
    1. 셀에서 미디어 발음 셀 1 x PBS (pH 7.4)을 한 번 씻어. PBS를 발음 하 고 트립 신 (4 mL 10 cm 접시 또는 T-75 플라스 크 5 mL)을 추가 합니다.
    2. 37 ° C에서, 분리 된 셀에 대 일 분 마다 확인 하 고 배를 부드럽게 흔들어 ~ 5 분에 대 한 셀을 품 어.
    3. 셀을 분리 했으면 일단 피 펫 위아래로 몇 번, 그리고 연결 된 셀 출시를 그릇의 측면 아래로 부드럽게 피 펫 셀 trypsinized.
    4. 15 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송 하 고 250 x g에 5 분에 대 한 셀 아래로 회전.
    5. 트립 신을 발음 하 고 미디어의 5-10 mL에 셀 resuspend. P1000 피 펫을 사용 하 여 필요한 경우 세포 덩어리를 분리.
    6. 셀을 계산 하 고 접시 당 3 mL의 총 볼륨에 잘 ~ 300000 셀 하는 데 필요한 볼륨을 결정 합니다. 6 잘 플레이트의 2 별도 우물에 셀을 추가 합니다. 각 채우기 완료 RPMI와 3 mL을 잘.
    7. 셀은 접시에 고르게 분포 되도록 도금 후 접시 마다 5 분 첫 번째 15 분에 부드럽게 흔들어. 현미경을 사용 하 여 셀 우물의 중간에서 분산가 되도록.
  2. 도금의 24 시간 안에 다음 transfections 관심의 셀 라인에 대 한 적절 한 transfection 시 약을 사용 하 여 수행 합니다. 이시카와 셀 아래에 설명 된 절차를 사용 합니다.
    참고:이 프로토콜 양이온 liposome에 기초를 둔 transfection 시 약의 사용을 가정합니다. Electroporation 종류는 이러한 시 약에 매우 민감한 또는 lipofection와 낮은 transfection 효율을 전시 하는 대체 방법을 제공 합니다. Transfection 조건 증강-i 실험을 시도 하기 전에 관심의 셀 라인에 대 한 낙관 되어야 한다.
    1. 1.7 mL Eppendorf 관에에서 희석 SID4X-dCas9-리아 플라스 미드의 2.5 μ g 및 800 튜브에 최종 볼륨 155 µ L 이며 플라스 미드의 최종 농도 0.020 µ g / µ L를 혈 청 자유로운 미디어에 형광 단백질을 표현 하는 플라스 미드의 ng.
    2. 다른 튜브에 pCMV GFP 등 네오 마이 신 저항 카세트를 포함 하지 않는, 혈 청 자유로운 매체에 관에서 마지막 볼륨 155 µ L 이며 플라스 미드의 최종 농도 0.020 µ g / µ L 플라스 미드의 3.3 µ g을 희석.
    3. 소용돌이 각 튜브를 짧게 하 고는 microfuge를 사용 하 여 아래로 회전.
    4. 각 튜브를 transfection 시 약 (자료 테이블)의 9.9 µ L를 추가 합니다. 짧게 낮은 속도에서 vortexing에 의해 혼합. microfuge와 다운 튜브를 회전 합니다.
    5. 적어도 5 분, 하지만 20 분 더 이상 실내 온도에 튜브를 품 어.
    6. Biosafety 캐비닛에 추가할 준비 DNA: 시 약 믹스의 150 µ L dropwise 6 잘 플레이트에 대 한 잘. 시 약 DNA 준비: 믹스의 다른 튜브에 대 한 반복 합니다. 부드럽게 소용돌이 의해 접시를 혼합 하 고 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
  3. 하루 2 게시물 transfection에 미디어를 변경 하 고 600 ng/μ의 최종 농도에 G418 보충. 이 농도 셀 형식에 대 한 최적화 할 수 있습니다.
  4. 완전 한 RPMI 미디어 변화와 G418 컨트롤 페 셀은 죽은 포함 하는 SID4X-dCas9-리아 우물 confluent 될 때까지 2-4 주 동안 매일 보충. 정확한 양의 셀 복구 하는 데 필요한 시간 셀의 2 배 시간에 따라 달라 집니다.
  5. 때, confluent 될 셀 통로 있는 T-25 또는 T-75 배를 완전 한 RPMI G418의 낮은 복용량 (이시카와 셀 300 ng/μ). 이 통로 중 확인 2 aliquots ~ 100, 000 셀의 각 (약 1/10일 6 잘 플레이트의) 2 별도 1.7 mL Eppendorf 관에 RNA와 DNA 분리, 각각. (5 분, 250 x g) 아래로이 관을 회전, pipetting, 여 트립 신을 제거 하 고 나중에 사용-20 ° C에서 튜브를 고정.
  6. 상업적으로 사용할 수 있는 키트를 사용 하 여 게놈 DNA를 분리 하 고 셀 라인 내의 융해 단백질의 존재를 확인 하는 "pAC95_PCR" 또는 "SID4X_PCR" 뇌관 (표 1)를 사용 하 여 PCR을 수행. 긍정적인 통제로 부정적인 컨트롤로 부모의 선에서 추출 하는 genomic DNA와 SID4x-dCas9-리아 플라스 미드 DNA를 사용 합니다. 게놈 DNA와 자전거 다음과의 50-100 ng 높은 중 합 효소 마스터 혼합 사용: 98 ° C 30에 대 한 s, 25의 사이클 (98 ° C 10 s, 58 ° C 30에 대 한 s, 2 분 동안 72 ° C), 5 분 동안 72 ° C 4 ° c.에서 개최
  7. RNA 수준에 융해 단백질의 표현을 확인 하려면 상용 키트를 사용 하 여 셀 라인에서 추출한 RNA 정량 수행 합니다. "DCas9_qPCR" 뇌관 (표 1),이 프로토콜의 단계 6.3에서에서 제공 1 단계 정량 Pcr 프로토콜을 사용 합니다.
  8. 확인 하려면 융합 단백질 수준 표현 수행 하십시오 서쪽 lysates 셀 라인에서에 오 점. 반대로 깃발 또는 안티를 사용 하 여-하 항 체 융합 단백질을 검출 하기 위하여.

2. 가이드 RNA 디자인

참고:이 프로토콜은 U6 가이드 RNA 벡터 교회 연구소에 의해 만들어진된 Addgene (Addgene 41824)에서 사용할 수 있는 복제와 함께 사용 하기 위해 설계. Puromycin 저항 41824로 동일한 복제 전략에 대 한 허용을 포함 하는이 벡터의 버전을 만들려면, 우리 pGL3 U6 sgRNA PGK puromycin 벡터 (Addgene 51133)에이 벡터에서 여러 복제 사이트를 이동. Addgene 41824 또는 puromycin (Addgene 106404) 우리의 버전 아래에 설명 된 복제 전략와 호환 됩니다.

  1. 600-900 basepairs를 관심의 각 규제 지역에 대 한 DNA 시퀀스를 가져옵니다. 어디 (그림 2A) 관심 영역을 정의 하는 지침에 대 한 전사 인자 바인딩 사이트 또는 chromatin 내게 필요한 옵션을 사용 합니다.
    참고: 예제 그림 2A 에서 업스트림 및 다운스트림 기능을 하는 동안 그것은 또한 규제 요소 introns 내에 있는 대상 수 있습니다.
  2. 모든 시퀀스 FASTA 형식을 사용 하 여 단일 텍스트 파일에 배치 합니다.
  3. 하지 하지 관심의 셀 라인에 표현 되는 유전자의 발기인과 같은 실험 조건에 따라 변경 하는 것으로 예상 하나 이상 부정적인 제어 영역을 식별 합니다. 이 지역에 대 한 DNA 순서를 얻을 FASTA 형태로 텍스트 파일에 추가 합니다.
    참고: 우리는 가이드 우리가 타겟팅 하는 모든 지역에 대 한 부정적인 컨트롤로 IL1RN 발기인25 를 대상으로 하는 RNAs를 사용 합니다. 사용자가 또한 부정적인 컨트롤로 전사 인자 바인딩 사이트를 포함 하지 않는 관심 영역 근처 intergenic 시퀀스를 선택할 수 있습니다. 그러나, 여러 loci 동시에 타겟이 되고있다, 만약 하나의 부정적인 제어 영역 실험 설계 및 결과의 해석을 간소화 합니다. 타겟된 증강 intronic 이면 대상 추가 부정적인 컨트롤로, dCas9 퓨전으로 상 상속 규정 요소를 포함 하지 않는 같은 로커 스에서 intronic 지역 전사 방해할 수 유용할 수 있습니다.
  4. 긍정적인 통제 지역, 관심, 규제 영역의 상 상속 목표는 발기인 등 높은 관심의 셀 라인에서 복사할 유전자의 발기인을 식별 합니다. 이 지역에 대 한 DNA 순서를 얻을 FASTA 형식의 텍스트 파일에 추가 합니다.
  5. E-선명26 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)와 같은 프로그램을 사용 하 여 찾으려고 가이드 RNAs 낮은 떨어져 목표 (이상적으로 0-3)와 생성 된 DNA 순서에. Protospacer 인접 한 모티브 (PAM), S. pyogenes에서 dCas9에 대 한 폼 "NGG" 소요의 20 뉴클레오티드 상류 가이드 RNAs에 의하여 이루어져 있다.
    1. E-선명 웹사이트에서 드롭-다운 메뉴를 사용 하 여 관심사의 유기 체를 선택 합니다. 게놈 어셈블리 종 이름 오른쪽에 나타납니다.
    2. 입력은 FASTA 시퀀스 라디오 버튼을 선택 합니다. 위에서 FASTA 시퀀스를 복사 하 고 대화 상자에 붙여 넣어. FASTA 헤더 각 시퀀스에 포함 되어 있는지 확인 합니다.
      참고: 최대 50 시퀀스 쿼리할 수 있습니다 동시에.
    3. 드롭 다운 메뉴에서 단일 디자인과 매체 라디오 버튼을 선택 합니다.
    4. SgRNA 검색 시작버튼을 클릭 합니다. 새로운 브라우저 소프트웨어 탭, 열리고 결과가 표시 됩니다. 함께 모든 쿼리 시퀀스에 대 한 서식이 지정 된 Excel 테이블 형식 보고서를 다운로드버튼을 클릭 하 여 후보 시퀀스를 다운로드 합니다.
    5. Excel 또는 텍스트 편집 프로그램을 사용 하 여 테이블 형식 보고서를 엽니다.
  6. UCSC 게놈 브라우저 게놈을 BLAT 후보 전체 길이 gRNA 시퀀스 (23 basepairs)를 사용 합니다.
    1. 브라우저에서 UCSC 게놈 브라우저 웹사이트 (http://genome.ucsc.edu)으로 이동. 우리의 도구섹션에서 공격기 단어 찾아서 그것을 클릭 합니다. BLAT 검색 도구가 열립니다.
    2. BLAT 검색 게놈 텍스트 아래에 있는 드롭-다운 메뉴를 사용 하 여 관심의 유기 체와 게놈 어셈블리 선택.
    3. E-선명 하 여 생성 된 테이블 형식 보고서에서 가이드 RNA 시퀀스를 복사 및 대화 상자에 붙여 넣어. 각 시퀀스는 독특한 FASTA 헤더, 제출 대화 상자 아래쪽에 클릭 있는지 확인 하십시오.
      참고: 25 시퀀스까지 수 검사 한 번에. BLAT 검색 결과 페이지에서 정렬을 나타내는 각 줄과 각 가이드 RNA 시퀀스의 정렬 표시 됩니다. 이상적으로, 각 가이드는 가이드 RNA의 고유성을 나타내는 RNA에 대 한 하나의 정렬 해야 합니다.
    4. 가능 하면 게놈에서 여러 위치에 정렬 가이드를 하지 마십시오.
    5. 가이드 RNA 지역화 및 관심의 영역 내에서 배포 검사, 쿼리 가이드 RNAs 중 하나에 대 한 작업 섹션에서 브라우저 링크를 클릭 합니다. 게놈 브라우저 표시 됩니다 및 선택된 가이드 RNA에 중심 것입니다. 페이지의 상단에 축소 버튼을 사용 하 여 시각화 RNAs e-선명 관심 영역 내에서 식별 하는 다른 가이드의 배포.
  7. 4 가급적 이면 겹치지 가이드 RNA 순서 (그림 2B)의 지역에 걸쳐 배포 되는 선택 합니다. 관심 영역 600을 초과 하는 경우 혈압, 1-2 추가 가이드를 추가 하십시오. 가이드를 RNAs homopolymeric 뻗 기 및 극단적인 GC 콘텐츠,이 기능 가이드 RNA 복제 프로세스를 방해 하 고 효율성을 대상으로 하는 가이드 RNA를 줄일 수 하지 마십시오.
  8. 일단 가이드를 선택 각 원하는 가이드에 대 한 전체 가이드 RNA 순서 (23의 뉴클레오티드)를 포함 하는 파일 만들고 3' 끝에서 PAM (NGG)로 서 5' 뉴클레오티드를 제거 합니다. 이 단계는 oligo 주문 수 있습니다.
  9. Oligonucleotide 시퀀스의 5' 끝에 다음을 추가: GTGGAAAGGACGAAACACCG.
  10. 3' oligonucleotide 시퀀스의 끝에 다음 추가: GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.
    참고: 마지막 시퀀스 해야 59 뉴클레오티드 오랫동안 봐이 같은: GTGGAAAGGACGAAACACCG 대상 (19 nt)-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.
  11. 각 규정 요소 증강 i 타겟이 될 그것을 위한 적어도 4 독특한 oligonucleotides 있는지 확인 하십시오. 표 1에 나열 된 "U6_internal" 뇌관 함께 이러한 시퀀스를 주문.

3. 가이드 RNA 복제

참고: 벡터 유일한 컨트롤에 몇 가지 경우 식민지와 식민지 접시, 당 수백 저조한 우리의 손에 매우 효율적으로 입증 깁슨 어셈블리를 통해 가이드 RNA 복제. 이러한 효율성은 풀링된 복제 하는 동안 복잡성을 유지 중요 합니다. 깁슨 어셈블리 복제의 또 다른 장점은 사용자 제한 효소 절단 가이드 RNA U6 클로닝 벡터에 삽입 하려는 사이트의 존재에 대해 걱정할 필요가 없습니다. 그럼에도 불구 하 고,이 프로토콜은 전통적인 제한 효소 기반으로 원하는 경우 복제에 대 한 적용할 수 있습니다.

  1. (RNase 무료, DNase 무료) 초순에 100 μ M의 최종 농도에 가이드 RNA oligos를 다시 구성. 적어도 4 별도 가이드 RNA oligos 관심의 각 지역에 대 한 있어야 합니다.
  2. 관심의 각 규제 지역에 대 한 관심의 영역에 해당 하는 모든 oligos의 풀을 만듭니다. Eppendorf 관에서 각 지역에 대 한 각 개별 재구성된 가이드 RNA 올리고의 5 μ를 결합 한다. 수영장 vortexing, 잘 혼합 후 1 μ를 제거 하 고 초순에이 aliquot 1: 200을 희석.
    참고: 원하는 경우 개별 규제 지역 타겟팅이 풀 수 더 결합 될 여러 영역을 대상으로 복잡 한 풀을 생성 하. 50 규제 지역 최대 수 있습니다 대상 동시에 단일 풀 (그림 3C).
  3. 깁슨 조립 전에 oligos에 상 동 영역을 연결할 U6 뇌관으로 짧은 PCR을 수행 합니다. 약 40 기지 각 올리고, 저조한 양쪽 끝에 U6 벡터에 충분 한 상 동에 있는 ~ 100 bp 제품에 추가 됩니다.
    1. 각 가이드 RNA 수영장, 20 μ PCR 높은 중 합 효소 마스터 믹스와 다음 구성 요소를 설정: 1 μ 단계 3.2, U6 앞으로 뇌관 (10 μ M), U6의 1 μ의 1 μ에서에서 희석된 올리고 풀의 반전 뇌관 (10 μ M) 최대 20 μ를 물.
    2. 다음 조건 열 cycler에서 품 어: 30 98 ° C의 10의 주기 (98 ° C 10 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 2 분 동안 72 ° C), 72 ° C 5 분 및 4 ° c.에서 개최
    3. 낮은 분자량 사다리와 함께 1-2 %agarose 젤에 반응의 5 μ를 실행 합니다. 최종 제품 ~ 100 basepairs (그림 2C) 해야 합니다.
    4. 열 기반 DNA 정제 키트, 확장 반응을 청소 하 고 차입 버퍼는 키트에 제공 된의 20 μ에 elute.
      참고: 짧은 제품으로, 사용 하지 않도록 비드 기반 청소-ups, 100 보다 작은 파편을 제외 하도록 설계 된 bp.
    5. Fluorometer 또는 분 광 광도 계를 사용 하 여 순화 된 DNA를 계량 (예상 수확량은 10-20 ng/μ). 가이드 RNA 삽입-20 ° C에서 저장 될 수 있다 또는 선형화 U6 벡터와 깁슨 어셈블리에서 즉시 사용할 수 있습니다.
  4. U6 클로닝 벡터 깁슨 어셈블리에 대 한 받는 사람을 준비 하는 금지 효소 다이제스트를 설정 합니다. 많은 깁슨 어셈블리 반응을 수행할 수 있다면, 컷된 벡터의 충분 한 수익률을 보장 하기 위해 여러 요약을 설정 합니다.
    1. AflII 효소의 20 단위 및 플라스 미드의 1 μ g를 사용 하 여 적절 한 제한 효소 버퍼 20 μ 반응에서. 1-2 h 37 ° C에서 품 어.
    2. 구슬 또는 열 기반 DNA 정화 킷 다이제스트를 청소 하 고 차입 버퍼의 20 μ에 elute. Fluorometer 또는 분 광 광도 계를 사용 하 여 순화 된 DNA를 계량. 샘플 나중 사용을 위해-20 ° C에서 동결 될 수 있습니다.
  5. 준비 된 벡터에 깁슨 어셈블리 수행을 삽입 합니다.
    1. 얼음에 깁슨 어셈블리 반응 설정. 벡터 및 7의 사용 50 ng ng 20 μ 반응에 삽입의. Pipetting 촉진을 초순에 삽입 1시 10분 희석. 벡터만 깁슨 어셈블리 반응, 50를 사용 하 여 설정 물으로 삽입을 대체 하는 벡터의 ng.
    2. 깁슨 어셈블리 반응 뒤에 4 ° c.에 보류 하는 50 ° C에서 15 분 동안 품 어
    3. 얼음 조립된 제품을 전송 합니다. 조립된 제품 1:4 초순 얼음에 희석. 예를 들어 초순의 15 μ를 깁슨 어셈블리 제품의 5 μ를 추가 합니다.
  6. 변환 희석된 깁슨 어셈블리 제품.
    1. 얼음에 고효율 유능한 세포를 해 동 하 고 각 변화에 대 한 25 μ aliquots. 여러 사이트를 대상으로 하는 복잡 한 수영장을 원하는 경우 같은 복잡 한 gRNA 풀의 여러 독립적인 변환을 수행 하는 다른 튜브에 충분 한 세포를 녹여.
    2. 각 희석된 제품에 대 한이 희석의 1 μ 1.7 mL Eppendorf 관 유능한 세포의 25 μ를 포함에 추가 합니다. 짧게 튜브를 터치 하 여 혼합. 30 분 동안 얼음에 튜브를 품 어.
    3. 열 충격 30 셀 42 ° c, s 다음 2 분 동안 얼음에 즉시 전송.
    4. 300 μ SOC 미디어 (2 %tryptone, 0.5% 효 모 추출 물, 10 m m NaCl, 2.5 m m KCl, 10mm MgCl2, 10 m m MgSO4, 및 20 m m 포도 당)을 추가 하 고 셀 떨고 (300 rpm) 37 ° C에서 1 시간에 대 한 복구를 하자. 이 시간 동안, 암 피 실린/carbenicillin 인큐베이터에서 37 ° C를 가진 한 천 배지 따뜻한. 한 접시를 사용 하 여 각 변환에 대 한.
    5. 셀의 50 μ 접시와 격판덮개 37 ° C 배양 기에서 밤새 껏 두기 위하여. 개별 사이트를 대상으로 하는 풀에 대 한 포함 하는 암 피 실린/carbenicillin (1 mg/mL) 파운드 국물 (자료 테이블)의 3-5 mL에 직접 놓고 250 rpm minipreps 37 ° C에서 흔들어와 밤새 품 어.
  7. 세포를 수확 하 고 DNA를 분리.
    1. 큰 가이드 RNA 라이브러리 여러 사이트를 대상으로 한 maxiprep (150 mL 액체 문화)으로 각 개별 접시에서 모든 식민지를 수집 플레이트 스 크레이 퍼를 사용 합니다. 이 50 mL 팔 콘 튜브 및 튜브에는 식민지를 근 근이 적절 한 항생제와 파운드의 붓는 ~ 5 mL에 의해 촉진 수 있습니다. 개별 사이트를 대상으로 하는 라이브러리에 대 한 miniprep (3-5 mL 액체 문화)에 번호판을 다쳤어요.
    2. 37 ° C에서 3-5 h 250 rpm에서 진동에 대 한 적절 한 항생제와 함께 이러한 문화를 품 어.
    3. DNA 추출도 무료 preps에서 키트를 사용 하 여 수행 합니다.
    4. Fluorometer 또는 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA를 계량. 플라스 미드 transfection에 즉시 사용 하거나 나중에 사용-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
  8. 생어를 사용 하는 단일 사이트를 대상으로 하는 작은 풀 가이드 RNA 순서 U6 벡터 내에서 존재를 확인 하려면 "U6_PCR_R" 뇌관 준비 miniprep에 시퀀싱 표 1에 나와 있습니다. 가이드 RNAs의 풀링 때문 19 basepair gRNA 대상 시퀀스 혼합된 기지를 얻을 것입니다 하지만 U6 발기인 및 가이드 RNA 비 계가이 시퀀스를 둘러싼 그대로 이어야 한다.

4입니다. transfection 증강 인자-i의

참고: 이시카와 셀에 증강-i를 사용 하 여 에스트로겐 응답의 성공적인 봉쇄에 대 한 그것은 페 놀 레드에서 그들을 유지 하 여 transfection 5-7 일전 10% 무료 RPMI 숯-박탈 FBS와 1%에 대 한 에스트로겐의 세포를 박탈 하는 데 필요한 페니실린/스입니다. 셀 해야 될 교양이 미디어에 transfection 전후 동안 에스트로겐 응답을 차단 하려는 경우. 완전 한 페 놀 레드 셀의 무료 RPMI 페 놀 레드 무료 trypsin의 사용을 권장 합니다.

  1. Transfection, 전날 30-50 %confluency (이시카와 셀 잘 당 ~ 60000 셀)에서 24-잘 접시에 셀 (야생-타입 또는 안정적으로 표현 하는 SID4X-dCas9-리아) 접시. Transfections 복제, 수행할 수 있습니다 및 제어 가이드 RNAs 페 하 웰 스를 포함 되도록 충분 한 세포를 플레이트.  세포 단계 1.1.7 에서처럼 셀 도금 후 접시를 부드럽게 흔들어 잘 걸쳐 고르게 배포 됩니다 확인 하십시오.
    참고:이 프로토콜 양이온 liposome에 기초를 둔 transfection 시 약의 사용을 가정합니다. Electroporation 이러한 시 약에 매우 민감한 종류는 대체 방법을 제공 합니다. Transfection 조건 증강-i 실험을 시도 하기 전에 관심의 셀 라인에 대 한 낙관 되어야 한다.
  2. 다음 날, 선택의 transfection 시의 지침에 따라 transfections을 준비 합니다. 이시카와 셀, 24-잘 접시의 각 음에 대 한 총 플라스 미드의 사용 550 ng. 혈 청 무료 미디어 (1.1 μ g의 DNA에 transfecting 2 웰 스에 대 한 전체 볼륨의 52 μ)에서 0.020 μ g/μ의 최종 농도에 플라스 미드를 희석. Transfection 시 약의 3 μ를 사용 하 여 DNA의 모든 1 μ g에 대 한 소용돌이 1.2 단계에서 설명한 대로 품 어. 각 우물에 최종 혼합물의 25 μ를 추가 합니다.
    참고: 사이트의 대상 조합에 무게를 사용 동일한 플라스 미드의 각 개별 사이트에 대 한 하 고 컨트롤 플라스 미드 (빈 가이드 RNA 클로닝 벡터 또는 가이드 IL1RN 같은 부정적인 제어 영역을 대상으로 하는 RNAs 남은 무게를 채울 발기인)입니다. 변이 transfections에 대 한 3:2 Cas9 퓨전: 가이드 RNA 플라스 미드의 비율을 사용 합니다. 형광 기자를 포함 하는 플라스 미드 transfection 효율 모니터링을 추가할 수 있습니다.
  3. 36 h 게시물 transfection에 변경 페 놀 레드를 사용 하 여 미디어 RPMI 10% 숯 박탈 FBS와 1% 페니실린/스 (이시카와 셀)에 대 한 무료 및 puromycin 공급 (최종 농도: 1 μ g/mL)과 네오 마이 신 (최종 농도: 300 ng/mL). 세포 transfection 시 약에 민감한 경우, 미디어는 앞으로 바뀔 수 있다 하지만 항생제를 24 h 게시물 transfection 보다 일찍 추가 해야 합니다.
    참고: 셀을 수확 하기 전에 항생제를 추가한 후 적어도 24 시간을 기다립니다. 48 h 일찍 transfection를 게시 하 고 최대 5 일 게시 transfection 식 변경 때문에 증강-i를 감지할 수 있습니다. 작업 하는 경우 에스트로겐의 박탈 하는 이시카와 셀 8 h 10 nM 17β-estradiol (e 2) 유도 후 항생제 치료를 수행 하 고 즉시 세포를 수확.

5. 세포 수확 및 RNA 추출

  1. 1% β-mercaptoethanol (공학은) 세포의 용 해 버퍼를 준비 합니다. 충분 한 세포 공학은 혼합물 (300 μ 각 잘 수확 되 고에 대 한) 인지 확인 합니다.
  2. 진공 흡 인기를 사용 하 여 미디어 발음
  3. 1 x PBS의 동등한 양 가진 한 번 세포 세척 (500 μ)와 가능한 많은 PBS를 제거 하는 aspirate.
  4. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 각 잘을 300 μ의 세포 공학은 솔루션을 추가 합니다. 세포의 용 해 솔루션을 플라스틱 그리고 8-아래로 10 번, 그리고 깊은 잘 격판덮개 또는 1.7 mL Eppendorf에 얼음에 관. RNA는 즉시, 추출 될 수 있다 또는 lysates 미래 처리를 위한-80 ° C에 얼 수 있다.
  5. Lysates에서 RNA를 추출, DNase 치료를 포함 하는 상업적으로 사용할 수 있는 키트를 사용 합니다. 초순의 최소 권장된 볼륨에 elute (RNase 무료, DNase 무료) 또는 차입 버퍼 및 RNA를 정량. 샘플의 작은 숫자, fluorometer 또는 분 광 광도 계를 사용 하 여. 샘플의 많은 수를 감지 하는 RNA 측정 플레이트 리더에 형광 프로브를 사용 하 여. 샘플은 정량화 전후-80 ° C에서 동결 될 수 있습니다.

6. 측정 단계 정량 및 RNA-seq를 사용 하 여 유전자 표현 변경

  1. 정량 Pcr 뇌관의 유전자 및 하나 이상의 내부 관리 유전자는 타겟된 유전자의 수준에 가까운 표현 하 고 실험 조건에서 변경 되지 않습니다 얻을. 이상적으로, 이러한 뇌관을 genomic DNA의 증폭을 피하기 위해 엑손-엑손 접합을 스팬 됩니다.
    1. RNA의 셀 라인에서 얻은에이 뇌관을 테스트 합니다. 사용 녹아 곡선 분석을 단일 제품의 생산을 확인. 단일 제품 제작 하지 않은 경우 추가 뇌관 쌍을 테스트 합니다.
  2. 샘플에 대 한 각 증강-i 및 제어 가이드 취급 하는 RNA, 그 샘플에 얼마나 많은 유전자를 분석 해야 합니다 식별 합니다. 유전자의이 세트는 CTCF 등 GAPDH하우스키핑 유전자를 포함 해야 합니다.
  3. 정량 Pcr 반응을 설정 합니다.
    1. 물에 동일한 농도에 모든 샘플을 희석 그런 50 총 RNA의 ng pipetted 쉽게 그리고 충분히 각 반응에 대 한 RNA를 희석. 예를 들어 ~16.6 ng/μ에 RNA를 희석 하 고 사용 하는 각 반응에서 RNA의 3 μ. 믹스 마스터를 설정 하는 동안 얼음에 RNA를 유지.
    2. 상용 1 단계 정량 키트를 사용 하 여 측정 각 유전자에 대 한 별도 마스터 믹스를 준비 합니다. 각 뇌관 (10 μ M 재고 솔루션)의 1 μ와 20 μ 반응 볼륨을 사용 합니다. 얼음에 이러한 반응을 설정 합니다.
    3. 적합 한 열 cycler는 반응 접시에서 RNA 샘플 뒤에 마스터 믹스를 추가 합니다. 플레이트 마감재와 함께 밀봉 하 고 vortexing 또는 pipetting으로 부드럽게 혼합. 짧게 접시 원심 (140 x 60에 대 한 g s) 우물의 바닥에는 그 액체를 위해.
    4. 다음과 같이 열 cycler에 접시를 품 어 (또는 키트로 지시): 30 분, 10 분 동안 95 ° C 48 ° C 40의 사이클 (15 95 ° C s, 1 분 동안 60 ° C).
  4. 각 샘플 내에서 측정 된 각 유전자에 대 한 Ct 값을 가져옵니다. 유전자 발현에 변화를 확인 하는 비교 Ct 메서드를 사용 합니다.
    1. 정규화 된 Ct 값을 생성 하는 각 샘플에 대 한 관심의 각 유전자의 Ct에서 하우스키핑 유전자의 Ct를 뺍니다.
    2. 치료 컨트롤 샘플에 대 한 각 유전자에 대 한 정규화 된 Ct 값의 평균 걸릴. 로그 기본 2 규모 배 억압 다음 해당 유전자에 대 한 처리 컨트롤 샘플에 대 한 동일한 값에서 각 유전자에 대 한 정규화 된 증강 인자-i 치료 샘플 Ct를 빼서 계산할 수 있습니다.
  5. 증강 인자-i 치료 따르는 유전자 발현에서 세계적인 변화를 확인 하려면 사용자의 시퀀싱 기술과 호환 상용 키트를 사용 하 여 RNA 시퀀싱에 대 한 샘플을 준비 합니다. 시작 물자에 대 한 RNA의 사용 ~ 500 ng 이상 2 생물 복제에 대 한 라이브러리를 준비 하는 고.

7. SID4X-dCas9-리아를 사용 하 여 칩 seq 하 여 타겟팅 특정 게놈의 확인

참고: SID4X-dCas9-리아 융해 단백질 플래그 피토 프 태그와 하 피토 프 태그를 모두 포함 하지만 칩 seq에 대 한 최상의 결과 반대로 플래그 항 체와 가져온. 원하는 경우, 사용자 증강-i에 의해 영향을 받을 녹음 방송 요인 또는 H3K27ac, 증강 활동 증강-i에 의해 감소의 마크에 대 한 추가 칩 seq 실험을 수행할 수 있습니다. 그러나, 각 칩 seq 실험 10 x 106 세포, 그래서 계획에 따라 필요 합니다.

  1. 증강 인자-i 풀 셀 transfect
    1. 15 cm 조직 문화 접시에 접시 10 x 106 셀. 각 접시의 1 인자에 대 한 1 칩 seq 실험을 나타냅니다.
    2. 다음 날, transfect 접시 당 총 DNA의 20 μ g을 사용 하 여 셀. Transfections SID4X-dCas9-리아를 안정적으로 표현 하는 셀 라인에,에 대 한 DNA 가이드 관심의 모든 사이트를 대상으로 하는 RNAs의 플라스 미드 풀 그리고 선택적으로 플라스 미드 형광 단백질을 표현 한다. 변이 transfections에 대 한 3:2 dCas9 융합 단백질: 가이드 RNA 풀의 비율을 사용 합니다. 다른 TFs 또는 히스톤 수정 칩 seq, 다른 접시에 하나 이상 추가 제어 가이드 RNA transfection를 수행 합니다.
    3. 네오 마이 신 (300 ng/mL) 24-48 h 게시물 transfection에 puromycin (1 μ g/mL)와 요리를 취급 합니다. Chromatin 수확 하기 전에 적어도 24 시간을 기다립니다.
  2. 요리에서 chromatin 수확.
    참고: 이시카와 셀에 응급실 게놈 바인딩에 증강 인자-i의 효과 연구, 요리에 1 h 10 nM E2 치료를 수행과 제어 가이드 RNAs 증강-i 전에 수확 페. H3K27ac에 증강 인자-i의 효과 연구, 요리에 8 h 10 nM E2 유도 수행과 제어 가이드 RNAs 증강-i 전에 수확 페.
    1. 각 접시 (1%의 최종 농도)을 37% 포름알데히드의 500 μ를 적용 합니다. 짧게 판을 소용돌이 친다. 10 분 동안 실내 온도에 앉아 접시를 보자.
    2. 2.5 M 글리신 (125 m m의 최종 농도)의 1 mL를 추가 합니다. 짧게 판을 소용돌이 친다.
    3. 포름알데히드와 글리신 미디어에서 부 어. 감기 1 x PBS의 동일한 볼륨 (~ 20 mL)를 추가 합니다.
    4. PBS에서 부 어. 가능한 많은 PBS를 제거 하는 진공 흡 인기와 발음. 얼음에 요리를 놓습니다.
    5. 3-5 mL PBS 또는 Farnham 세포의 용 해 버퍼 x 감기 1의 추가 (5 m m 파이프 pH 8.0, 85 m m KCl, 0.5 %NP-40) protease 억제제 (그냥 사용 하기 전에 추가) 각 접시에 x 1. 요리 판 스 크레이 퍼로 긁어와 얼음에 15 mL 원뿔 튜브에 솔루션을 전송.
    6. Chromatin 1000 x g. 폐기에 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기에 튜브 아래로 회전 하 여 작은 공의 상쾌한 고 차후 사용을 위해-80 ° C에서 펠 릿 저장 하거나 반대로 플래그 항 체 또는 다른 타겟팅 하는 항 체를 사용 하 여 선택의 칩 seq 프로토콜 진행 녹음 방송 요인 또는 관심 (H3K27ac, H3K9me3)의 히스톤 수정.

결과

그림 1 프로토콜에서 설명 하는 워크플로의 회로도 보여준다. 근처에 스 트로 겐 통제 유전자 MMP17, 칩 seq (그림 2A)에 의해 정의 된 인근 3 바인딩 사이트가 어 바운드 강화 기여 가이드 RNAs를 확인 하려면 각 지역에 대 한 설계 되었습니다. 디자인 가이드 RNAs, 시퀀스를 둘러싼 각 응급실의 600-900 bp 창 관심의 바인딩 사이트 선택 하 고 가이드 RNA 디자인 프로그램에 넣어 했다. 가이드 인 RNA 0-2 사이트는 BLAT을 사용 하 여 인간 게놈에 정렬 했다 목표 예측 시퀀스. 및 칩 seq에 의해 정의 된 영역을 스팬 RNAs 가이드 4 겹치지 DNaseI 과민 증 (그림 2B)를 대상으로 선정 됐다. 추가 시퀀스 (표 1) 다운스트림 복제 및 결과 59 뉴클레오티드 조각을 주문 했다 각 끝에 추가 되었습니다. 도착 후, 가이드 RNAs 희석 되었고 사이트, 그리고 짧은 PCR에 의해 풀링된 깁슨 조립 전에 상 동 영역을 추가 하려면 수행 되었다. 그림 2C 59 basepair의 각 끝에 시퀀스의 20 basepairs를 추가할 것입니다 "U6_internal" 뇌관 (표 1)를 사용 하 여 짧은 PCR 후 예상된 가이드 RNA 제품 가이드 RNA 조각, 100 ~ basepair 시퀀스에 결과 보여줍니다. 깁슨 어셈블리에 따라 이러한 가이드 RNA 풀 박테리아로 변형 되었다 그리고 플라스 미드 minipreps 다음 날을 준비 했다. 그림 2D MMP17 근처 여러 강화 혼자 표적으로 증강 해 부 실험, 및 조합 증강-i를 사용 하 여 결과 보여줍니다. 증강-i 대상 사이트는 검은 육각형으로 표시 됩니다. 표시 된 사이트를 대상으로 하는 가이드 RNA 플라스 미드를 박탈 하는 에스트로겐 이시카와 셀 라인으로 안정적으로 표현 하는 SID4X-dCas9-리아 페 했다. 2 일 후, 미디어 변경 되었습니다과 puromycin transfected 세포에 대 한 풍부 하 게 추가 되었습니다. 다음 날, 셀 8 h 10 nM estradiol 치료 따르는 것을 수확 했다. RNA 격리, 고 1 단계 정량 수행 되었다. 이 예제에서 사이트 1과 2는 사이트 3 (그림 2D, 레인 ii-4)이이 조건 하에서 기여 하지 않는 하는 동안 MMP17의 완전 한 estrogenic 응답 필요 하다. 때만 2 또는 3 사이트는 활성 (vi와 vii), 에스트로겐 응답은 때 없는 사이트는 유사한 활성 (viii), 제안 하는이 사이트를 독립적으로 기여할 수 없습니다. 사이트 1 자체 (v), 일부 식을 기여할 수 있지만 가장 큰 활동은 볼 때 사이트 1 및 2 활성 (iv).

4 다른 유전자 근처 10 강화를 동시에 조작 하기 (그림 3A)의 복잡 한 풀 가이드 RNAs 42 증강 가이드 및 16 발기인 가이드 생성 된. 가이드 RNA oligos 초기 가이드 RNA 확장 PCR (단계 3.3), 전에 풀링된 했다 그리고 결과 PCR 제품 정화 깁슨 어셈블리를 사용 하 여 빈 puromycin U6 클로닝 벡터와 결합 했다. 깁슨 어셈블리에 따라 여러 개의 독립적인 변환은 수행 하 고 도금 했다. 플레이트는 파운드에 긁힌 것 이었고 2-4 h maxiprep 이전에 대 한 밖으로 성장할 수 있습니다. 그림 3B 표시 대표 감소 유전자 발현에 정량 하 여 때 이러한 가이드 RNA 풀을 한 스 트로 겐 박탈 이시카와 셀 라인으로 안정적으로 표현 하는 SID4X-dCas9-리아 페 (그림 2D) 위에서 설명한 대로 처리 됩니다. 증강 인자-i에서 감소는 상 상속 대상 유전자의 발기인을 대상으로 얻은 그 비슷합니다. 그림 3C RNAs 증강-i를 사용 하 여 에스트로겐 응답의 감소에 가이드의 희석의 효과 보여줍니다. 1:50 G0S2 아직도 근처 증강을 대상으로 가이드 RNA 수영장의 희석 생성 증강-i 50까지를 대상으로 사용할 수 있습니다 제안 하는 유전자 발현에 있는 뜻깊은 감소는 한 번에 사이트. 그러나, 비활성화 사이트의 수백 더 민감한 탐지 방법을 채용 하지 않는 한 동시에 대상 수 없습니다 것을 나타내는, 희석 수 있습니다.

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그림 1입니다. 프로토콜 증강-나를 사용 하 여 다중 증강 해 부에 대 한 도식 가이드 RNAs (빨간색과 파란색)은 e-선명 및 UCSC 게놈 브라우저를 사용 하 여 선택한 사용 하 여 설계 되었습니다. 4 명의 가이드 RNAs는 관심 (전사 인자 바인딩 사이트 칩 seq에 의해 정의 된 대로) 영역에 걸쳐 선택 됩니다. (빨간색과 파란색)의 지역별 풀링된 가이드 RNA oligonucleotides 깁슨 어셈블리 및 변환 전에 상 동 영역 (주황색)을 추가 하는 PCR를 받 다. 안정적으로 표현 하는 SID4X-dCas9-리아 셀 라인 또는 SID4X-dCas9-리아 플라스 미드와 함께에서 야생-타입 셀 결과 플라스 미드 풀 lipofection을 통해 페는. 가이드 RNA 플라스 미드 풀은 한 번에 또는 동시에 여러 사이트를 대상으로 한 사이트를 대상으로 개별적으로 페 수 있습니다. Transfected 세포 가이드 RNAs를 포함 하는 셀에 대 한 풍부 하는 항생제로 처리 됩니다. 에 ~ 72 h 게시물 transfection, 세포 수확. 핵 산 정량, RNA-seq, 또는 칩이 추출 될 수 있다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 2입니다. MMP17를 위한 RNA 설계 및 증강 해 부 안내. 근처 타겟 응급실 알파 바인딩된 강화 (회색)의 (A) 게놈 브라우저 화면 MMP17. 이 그림에서 칼튼, 외. 수정 되었습니다. 18. (B) 가이드 RNA 바인딩 사이트183에 대 한 설계. ER 칩 seq에 의해 정의 된에 대 한 바인딩 사이트는이 지역에 걸쳐 대상과 4 가이드 RNAs 타일입니다. 바인딩 사이트에 걸쳐 있는 DNaseI 감도 신호 가이드 RNA 디자인에 대 한 대상 시퀀스를 정의 하기 위해 사용할 수 있습니다. 칩 seq와 DNaseI HS 데이터 1 헤 (C) 대표 가이드 RNA 시퀀스 깁슨 어셈블리, 상 동 영역을 추가 하는 짧은 PCR을 받은 것에 대 한 준비가 된 10 nM estradiol로 치료 시 세포에서 얻은 했다. (D) MMP17 의 상대 식 정량 특정 지역 증강-i와 8-h 10 nM estradiol 치료의 대상으로 다음을 통해 측정. 식 세포 estradiol 치료 하지 않을 MMP17 의 CTCF 및 식 수준에 상대적입니다. 제어 가이드 RNAs의 발기인 대상 IL1RN. 모든 오차 막대를 나타내는 SEM, 이중 별표 나타냅니다 p < 0.01 및 단일 별표 나타냅니다 p < 쌍된 t-검정에서 0.05. 이 그림에서 칼튼, 수정 된 외. 18. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 3입니다. 증강-i. 풀링 대상 근처에 다른 유전자를 동시에 여러 강화 바인딩 사이트와 풀링된 증강-i에 타겟이 될 발기인의 (A) 회로도 (B) 이시카와 셀에 E2 치료 증강-i 플라스 미드 풀 (녹색), (파란색) 발기인-i 플라스 미드 풀 또는 제어 gRNAs (화이트)18페 후 정량 Pcr로 측정 된 식에 효과. 모든 유전자에서 중요 한 감소는 증강 i 관찰 됩니다. 이 그림에서 칼튼, 수정 된 외. 18. (C) 가이드 G0S2를 대상으로 하는 RNAs의 다른 양의 페 이시카와 셀에 G0S2 식 레벨 e 2 치료 후에 효과. 상당한 감소 가이드 RNA의 소량으로도 볼 수 있다 (1시 50분 희석), 제안 하는 최대 50 개 사이트 동시에 대상 수 있습니다. 모든 오차 막대를 나타내는 SEM, 이중 별표 나타냅니다 p < 0.01 및 단일 별표 나타냅니다 p < 쌍된 t-검정에서 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

이름시퀀스
U6_internal_FTTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG
U6_internal_RGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC
U6_PCR_FCCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA
U6_PCR_RAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA
gRNA_qPCR_FGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG
gRNA_qPCR_RAAAAAGCACCGACTCGGTGCC
dCas9_qPCR_FGTGACCGAGGGAATGAGAAA
dCas9_qPCR_RAGCTGCTTCACGGTCACTTT
pAC95_PCR_FAGAAGAGAAAGGTGGAGGCC
pAC95_PCR_RCGTCACCGCATGTTAGAAGG
SID4X_PCR_FCAATAGAAACTGGGCTTGTCG
SID4X_PCR_RTCGTGCTTCTTATCCTCTTCC

표 1입니다. 가이드 RNA 확장 및 시퀀싱, 정량, 융해 단백질의 탐지 사용 한 뇌관

토론

이 프로토콜 증강 기능 생 genomic 소재 시에 DNA 순서를 실제로 변경 하지 않고 해 부에 대 한 간단 하 고 유연한 방법을 설명 합니다. 반면 비슷한 개념 dCas9 리아27을 사용 하 여 이전에 게시 CRISPR 간섭 프로토콜, 증강 인자-i는 3 가지 주요 방법으로 이러한 프로토콜에서 다릅니다. 첫째, 증강 인자-i MAD120 증강 비활성화 달성 하기의 SIN3A 상호 작용 도메인을 활용 합니다. 증강 비활성화 HDAC 저 해제, 비활성화 하는 기본 메커니즘 HDAC 의존 하자를 사용 하 여 구출 될 수 있다. CRISPR dCas9-리아와 간섭, 달리 증강-i H3K9me3의 증 착에 연결 되지 않습니다. 사실은 RNAs, 3 일에 수확 되 고 세포 transfection 게시 가이드의 변이 도입에 의존 하는 증강 인자-i이 높습니다. CRISPR 간섭, H3K9me3 증가 7 일 게시물 변환12에서 관찰 됩니다. 마지막으로, 증강 인자-i 프로토콜 여러 사이트를 동시에 대상 및 대상의 효율성을 모니터링할 수 있는 전략을 제공 합니다. 모자이크-seq17, dCas9-리아는 여러 강화를 동시에, 대상 하는 데 사용 됩니다 하지만이 기술은 식 변화를 식별 하는 단일 셀 RNA 시퀀싱에 의존 하 고 (스 트로 겐-응답 유전자) 등 많은 유전자가 들 키 지 않고는 난청 단일 셀 RNA이 증강 인자-i의 감도 개별적으로 강화 연구 조합 어떤 유전자에 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 제공 합니다.

증강 인자-i의 가장 중요 한 단계가 이다 transfection, 관심의 셀 라인에 대 한 최적화 되어야 합니다. 이 프로토콜 transfected 세포에 대 한 풍부 하 게 puromycin 치료에 의존 하지만 그 공동 transfecting 가이드 RNAs 형광 단백질 및 형광 셀 cytometry 사용 하 여 정렬 일부 셀에 대 한 더 나은 농축 방법으로 증명할 수 있습니다. 유형입니다. 문제 해결 및 확인 transfection 정량 식 가이드 RNAs의 수준과 SID4x-dCas9-리아 모니터링 하는 것이 좋습니다. 가이드 RNA 레벨은 낮은 경우 (사이클 임계값 > 30), 사용자가 고려할 수 있습니다 또한 대체 가이드 녹음 방송 생체 외에서 28등 RNA 생산 전략. 그것은 또한 가능한 높은 gRNA 수준에도 불구 하 고 가이드 RNA는 SID4x-dCas9-리아 단백질의 대상으로 하는 것은 비효율적, 어떤 경우에 다른 선택 가이드 RNA 시퀀스 할 수 있습니다. 증강 인자-i 치료 세포에서 chromatin와 융합 단백질에 칩 seq를 수행 하 여 대상으로의 효율성을 모니터링할 수 있습니다. SID4x-dCas9-리아, 관심 영역에서의 높은 신호는 그것의 상 상속 대상 유전자 식 변경 감지 하는 경우 다음 가능성이 지역 공부 하는 조건 하에서 그 유전자의 표정에 공헌 하지 않는다.

증강 인자-i의 한 가지 잠재적인 한계는 오프 대상 효과 너무 많은 사이트는 동시에 표적으로 하는 경우 누적 될 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 최저 CRISPR 방해 전략 있다 대상 효과 RNAi29, 보다 적은 특히 dCas9 리아 표현 polyclonal 셀 라인을 사용할 때. 우리가 본 SID4X-dCas9-리아의 게놈 바인딩 대상에서 동시에 10 개의 사이트를 대상으로 하는 동안 우리가 하지 그 바인딩 이벤트의 결과로 유전자 식 변경 확인 했습니다. 일부 강화 여러 발기인 또는 다른 강화 연락처 수 있습니다, 비록 유전자 규칙의이 형태는 일반적인 경우에 명확 하지 않다 많은 유전자 단일 증강의 대상으로 시 식에 변경 될 수 있음을 가능 하다. 식 변화는 특정 증강을 대상으로 관찰을 확인 하 고 오프-목표는 아니지만 효과, 사용자가 수행할 수 증강-i 겹치지 가이드 같은 지역 타겟팅 하는 RNAs의 두 가지 세트와 함께. 또한, nuclease 유능한 Cas9를 사용 하 여 영역의 유전자 삭제 추가 유전자 발현에 미치는 영향을 확인할 수 있습니다.

히스톤 deacetylation 통해 증강-i 기능으로 그것은 그것의 비활성화 능력 histone acetylation 감지할 수준을 강화 제한 가능. 타겟팅 특정 강화에 더 효과적일 수 있습니다 대체 억압 융해의 다양 한이 있다. DCas9 DNA methyltransferase 융해 유전자 발현 원심 강화30, 대상으로 하는 경우를 줄이기 위해 사용할 수 있습니다 하지만이 억압은 자주 과도. 또 다른 억압 적인 퓨전 히스톤 H3 리 27 trimethylation 리드 하 고 다양 한 세포 선 및 발기인31dCas9-리아와 비슷한 수준에서 유전자 발현을 누르는 GATA1 친구 (FOG1) 도메인을 사용 합니다. 흥미롭게도, 발기인, SID 도메인의 단일 복사본 증강-i에서 현재 사용 하는 4 복사본 보다 더 증강 비활성화를 제공할 수 있습니다 제안에 억압 적인 잠재력을 감소 dCas9 FOG1의 더 많은 복사본을 추가 합니다. 그것은 일부 loci 위의 dCas9 융해의 다른 조합에 의해 듀얼 타겟팅에서 이점을 얻을 수 있습니다. 예를 들어 안정적인 장기 억압 dCas9 DNMT3a 및 dCas9-리아32동시 변환에 의해 얻을 수 있습니다. 이러한 억압 적인 융해의 대부분만 타깃이 되어 단일 장소에 한 번에, 그리고 그것은 불분명 남아 있는 여러 강화를 동시에 조작에 가장 효과적 이다.

증강 인자-i, 유전자의 소수에 대 한 강화의 조합을 공부에 대 한 적합 한 방법 동안 사용자 putative 강화 유전자의 수백을 공부 하고자 하는 경우 처리량에 여전히 다소 제한 됩니다. 이 기술의 미래 응용 프로그램 이미징 기반 기술을 여러 샘플에서 여러 유전자를 동시에 계량을 통합할 예정 이다. 중요 한 것은, 이러한 기술은 시간이 걸리는 RNA 격리에 대 한 필요성을 제거, lysate에서 RNA 분자의 직접적인 탐지와 호환 됩니다. 이러한 적응 강화의 더 큰 세트의 심문을 촉진 한다.

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 작품은 NIH/NHGRI R00 HG006922 및 J.G.에 NIH/NHGRI R01 HG008974 그리고 사냥꾼 Cancer 학회에 의해 지원 되었다. J.B.C.는 유전자 T32GM007464에 NIH 연수 프로그램에 의해 지원 되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
ZR 96-well Quick-RNA KitZymo ResearchR1053
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-StepApplied Biosystems4389986
AflII restriction enzymeNEBR0520S
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF BufferNEBM0531L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621L
FuGENE HDPromegaE2312
DNA Clean & Concentrator KitZymo ResearchD4013
Buffer RLT PlusQiagen1053393
b-estradiolSigma-AldrichE2758
Human: Ishikawa cellsECACC99040201
H3K27ac rabbit polyclonalActive Motif 39133
H3K9me3 rabbit polyclonalAbcam ab8898
FLAG mouse monoclonalSigma-Aldrich F1804
ER alpha rabbit polyclonalSanta Cruzsc-544
pGL3-U6-PGK-Puro plasmidAddgene 51133Shen et al., 2014
gRNA_cloningVector plasmidAddgene 41824Mali et al., 2013
AflII U6 puromycin plasmidAddgene 106404Carleton et al., 2017
SID4X-dCas9-KRAB plasmidAddgene 106399Carleton et al., 2017
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250-10ML
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterThermoFisher Scientific10977-023
Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco31985070
KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture BeadsKapa BiosytemsKK8420
Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini TabletsThermoFisher ScientificA32959
Formaldehyde solutionSigma-Aldrich252549-25ML
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)ThermoFisher Scientific10131035
LB BrothThermoFisher Scientific10855001
Quick-DNA Miniprep KitZymo ResearchD3020
Quick-Load Purple 2-Log DNA LadderNEBN0050S

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