잎 스프레이 질량 분석: 식물 조직에서 대사를 직접 평가 하는 급속 한 대기 이온화 기술

요약

잎 스프레이 질량 분석 샘플 준비를 최소화 하 고 착 색 인쇄기, 식물 조직에서 작은 분자의 급속 한 탐지에 대 한 수를 제거 하는 직접적인 화학 분석 기술 이다.

초록

식물은 그들의 화학 속성에 다양 한 작은 분자의 수천을 생성 합니다. 질량 분석 (MS)는 높은 감도와 특이성 분자 중량을 제공 하기 때문에 식물 대사 산물을 분석 하기 위한 강력한 기술입니다. 잎 스프레이 MS 공장 조직 분무, 제거 과정에서 크로마토그래피를 통해 직접 화학 분석을 위해 사용 되는 주변 이온화 기법입니다. Metabolites 샘플링을이 이렇게 다양 한 화학 클래스에 대 한 샘플 준비 필요 최소화 그대로 식물 조직에서 동시에 검출 될 수 있습니다. 고해상도, 정확한 대량 MS와 함께 사용 하면 잎 스프레이 MS의 대사 산물의 급속 한 탐지를 촉진 한다. 그것은 또한 복합 식별을 용이 하 게이 기술 함께 탠덤 질량 조각화 데이터 수집 가능입니다. 정확한 질량 측정 및 조각화의 조합 복합 정체성 확인에 도움이 됩니다. 잎 스프레이 MS 기술 nanospray 이온화 소스에 약간의 수정만을 요구 하 고 더 질량 분석기의 기능을 확장 하는 유용한 도구입니다. 여기, Sceletium tortuosum (Aizoaceae), 남아 프리 카 공화국에서 전통적인 약용 식물에서에서 신선한 잎 조직을 분석 된다; 수많은 mesembrine alkaloids 잎 스프레이 MS와 검색 됩니다.

서문

식물에는 다양 한 화학 특성을 가진 작은 분자의 다양 한 포함 되어 있습니다. MS 검색 및 대사 산물¹의 식별에 대 한 높은 감도와 특이성 원소 구성을 제공할 수 있습니다 때문에 식물 화합물을 분석 하기 위한 강력한 기술입니다. 가장 일반적으로, MS는 MS 분석¹전에 크로마토그래피에 의해 구분 되는 용 매 추출 샘플에 수행 됩니다. 그러나, 액체 크로마토그래피 (LC)를 사용 하 여 긴 분석 시간을 요구 하며 관련 된 광범위 한 샘플 준비¹자주 됩니다. 반면, 크로마토그래피 circumvents 그대로 조직의 직접적인 화학 분석은 매우 빠른 기술, 요구 하는 최소한의 샘플 준비². 따라서, 경우에 컬럼에 단계를 forgone 있습니다 어디, 직접 화학 분석 매우 유리한 수 있습니다.

천연 제품 및 대사체학 연구를 위한 전형적인 액정-MS 냉동 또는 말린 식물 재료를 포함 하는 여러 조직 및 세포 유형³의 긴 대량 추출에 의존 합니다. 또는 식물 조직에서 대사 산물의 MS 검출 등의 직접적인 화학 분석 종류를 분리 하 고 준비 유물⁴를 피할 수 있습니다. 잎 스프레이 MS, 조직-스프레이^5,6, 라고도 본질적으로 아무 샘플 준비^5,7필요로 하는 직접적인 주변 이온화 MS 기술입니다. MS는 밀접 하 게 종이 스프레이 MS, 종이⁷에 예금 된 analytes의 검출을 허용 하는 분무 이온화의 특성을 가진 주변 이온화 기술 관련이 잎 스프레이. 이름, 불구 잎 스프레이 MS는 다양 한 유형의 식물 조직에 적용, 아니라 나뭇잎, 그리고 되었습니다^{6,,89, 과일, 씨앗, 뿌리, 꽃, 조직과 tubers, 다른 사람 사이 시연 10,,1112}. 기술은 탐지⁸질량 분석기로 공장 설비 재료에서 직접 생 phytochemicals의 이온화를 촉진 한다. 잎 스프레이 MS 또한 다른 조직 유형 식물¹³에서 화학 물질의 공간 분포에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 잎 스프레이 MS 용 매 추출 및 LC-MS와 비교 하는 경우 결과 잎 스프레이 MS trichomes¹³등 독특한 셀 형식에서 표면 대사 산물의 급속 한 탐지에 대 한 수 있습니다 제안 합니다. 그림 1 에서는 잎 스프레이 MS 실험 설정을 보여 줍니다. 직접 분무 이온화만 사소한 소스 수정 후 발생합니다. 금속 클램프를 통해 식물 조직에 적용 되는 높은 전압, 테일러 콘 운반 양 분무의 이온 유입에 이온을 형성 하는 고도로 청구 방울 스프레이 생산 이온화 발생 또는 용 매 appl에서 식물의 자연 액체에서 식물 표면에 폭발물입니다. 조직에 뾰족한 팁은 분무를 용이 하 게 하 고 자연스럽 게 발생 또는 수 만든 절단 하 여.

잎 스프레이 MS은 다양 한 응용 프로그램에 대 한 유틸리티 있는 그대로 식물 조직의 질적 및 반 정량 분석에 대 한 빠른 방법입니다. 예를 들어 기술 관련된 종, 구별 하 고 다른 조건 하에서 성장 하는 동일한 종에서 변화를 평가 내 인 성 화합물을 검출 하기 위하여 사용 되었습니다. 이전 연구이 방법은 beautyberry (새 나) 대사 산물을 측정 하 여 ¹² 및 미국 인삼 (Panax quinquefolium L.) ⁶. 후자의 예에서 ginsenosides, 아미노산, 및 oligosaccharides 검출 될 수 원시 인삼 조직 일로 후. 야생 및 재배 미국 인삼은 괴 조각⁶에서 분화 되었다. 삼 괴 무결성 성공 잎 스프레이 MS, 후속 형태학 및 현미경 검사⁶에 대 한 허용 되는 보존 되었다. 또한, 공장 샘플에 외 인 화합물도 감지할 수 있습니다. 농약 (acetamiprid, diphenylamine, imazalil, linuron, 및 thiabendazole) 수 껍질 또는 과일과 야채⁹의 펄프에서 발견 되었습니다. 이러한 연구와 많은 다른 다양 한 특정 목적을 위한 잎 스프레이 MS의 유틸리티를 표시는, 상세한 프로토콜 하지 이전 보고 되었습니다.

여기, 프로토콜 설명 방법 특정 조직에 대 한 또는 화합물의 최적화에 집중 하지 않습니다. Mesembrine 알 카 로이드에서 Sceletium tortuosum (나) N.E.Br (Aizoaceae)의 탐지 종족, 조직에 대 한 리프 스프레이 MS 실험을 설정할 때 수행 해야 하는 필요한 최적화 대책을 논의 하기 위해 예제로 사용은 오히려, 또는 처음으로 compound(s)입니다. S. tortuosum 는 남아 프리 카 공화국의 반건조 Karroo 지역에 즙이 발병입니다. San의 전통 의학 및 코 코 사람들, 식욕과 갈증을 억제 뿐만 아니라 그것의 정신 및 진통 효과^14,15에 관해서는 위해 이용 되었다. 현재, 표준화 된 추출 물 정신병과 신경 심리적 장애^16,17의 치료에 사용 됩니다. 관심의 주요 화합물에는 알칼로이드 mesembrine와 그 파생 상품, 어떤의 대부분은 또한 관련된 Sceletium 종¹⁵에 발견 포함 됩니다. S. tortuosum 의 야생 및 재배 인구는 mesembrine alkaloids의 가변 농도 따라서 품질 관리 도전¹⁸을 제시. Mesembrine 알 카 로이드, 잎 스프레이, MS 등의 급속 한 탐지 하는 방법 Sceletium 제품 모니터링에 유용할 수 있습니다. 때문에 이전에 잎 스프레이 MS 기술에 대 한 더 자세한 시각적 실험 프로토콜 왔다, 우리는 S. tortuosum의 예를 사용 하 여 메서드를 보여주는 것입니다 다음 설명: nanospray 소스 수정에 선택 및 식물 조직의 준비, 데이터 수집, 결과의 해석 및 MS 매개 변수의 최적화.

프로토콜

1. 잎에 대 한 Nanospray 소스 수정 스프레이 MS

1. 잎 스프레이 MS에 대 한 수정된 nanospray 소스를 사용 합니다. 으로 유체 구성 잎 스프레이 MS, 소스에서 LC 프로브를 제거 하 여 소스를 수정 합니다.
2. 조립 잎 스프레이 MS 철사를 소스에 연결에 대 한 적절 한 핀 식물 조직에는 전압을 적용 됩니다. 솔더 핀 절연된 전선;의 한쪽 끝을 솔더 와이어의 반대쪽 끝을 클램프.
   참고: 클램프 (악어 클립 타입) 되거나 치아를 없을 수 있습니다. 작은 조직에 대 한 치아 없이 클램프가 좋습니다. 클램프와 선택적 플렉스 팔 위치 식물 조직에 도움을 nanospray 소스에 추가할 수 있습니다. 이 프로토콜 특히 하이브리드 4 극 자 이온 함정 질량 분석기 MS 시스템에 잎 스프레이 MS를 수행 하는 방법을 설명 하는 참고 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오); 그러나, 다른 MS 시스템 수행이 기술은⁶을 변경할 수 있습니다. 잎 스프레이 커플링 MS 휴대용 질량 분석기 실시간 화학 분석을 수행할 수 있습니다 현장 실험실^19,20공장 설비 재료를 수송 하는 필요 없이.
3. 소스는 소스에서 높은 전압을 사용 하는 경우 발생할 수 있는 전기 방전을 줄이기 위해 아래 바닥에는 정전기 방지 바닥 매트를 배치 합니다.

2. 잎 스프레이 ms MS 시스템의 준비

1. 시스템 최근 사용 되었습니다, 그것은 냉각 하는 터치 하 고 대체 소스 및 스윕 콘 제거 허용 합니다. Nanospray 잎 스프레이 MS 소스를 첨부 합니다.
2. 다음과 같이 설정 하는 적절 한 이온화 매개 변수 조정 파일을 만듭니다: 칼 집, 보조, 그리고 청소 가스 0; 2-5 kV; 스프레이 전압 모 세관 온도 150-250 ° c; 그리고 50 S 렌즈 RF 레벨. 원하는 매개 변수^8,13조정 파일을 저장 합니다. 전압 및 온도 조직의 최고의 이온화와 관심의 compound(s)에 대 한 최적화.
   참고: 좋은 시작 포인트는 4 kV와 200 ° C
3. 와 잎 스프레이 MS 조정 파일을 포함 하 여 방법 파일: 긍정적이 고 부정적인 전체 MS; 70000;의 해상도 1 x 10⁶;의 AGC 대상 최대 200 ms;의 그것 그리고 원하는 스캔 범위 m/z. 또는, 1 극성을 사용 합니다.

3. 악기, 용 매, 및 식물 조직 준비

참고: 항상 장갑을 착용 하 고 맨 손으로 처리 된 식물 조직을 사용 하지 마십시오. 그렇지 않으면, 폴 리 에틸렌 글리콜 등 오염 이온 것 이다 스펙트럼을 지배 하 고 있다.

1. MS 시스템 빠른 샘플링을 같은 방에 분석에 대 한 식물 조직을.
2. 자연스럽 게 뾰족한 끝이 없는 식물 조직에 대 한 유리 슬라이드에 면도날을 사용 하 여 잘라 테이퍼 포인트 (그림 2). 악기 감도, 조직 유형, 그리고 관심의 compound(s)에 따라 분석에 필요한 조직의 양을 결정 (예를 들어, 젊은 S. tortuosum 잎 길이 즉 ~ 5 m m).
   1. 잘라 S. tortuosum 10 주에 각각 포인트를 테이퍼 끝을 얇은 스트립으로 후 발 아 나뭇잎.
3. 집게를 사용 하 여 부드럽게 채워 것입니다 끝에 식물 조직을 선택 합니다. 조직 집게로 잡고, 신중 하 게 그것을 옮길 클램프.
   주의: 경우에 전압은 악기 소스를 만지지 마십시오.
4. 유연한 팔과 와이어 클램프 식물 조직과 MS의 이온 입구 사이의 거리는 5-10 m m 3 배 4 중 극 (예를 들어, TSQ)에 대 한 MS 입구 라인 조직 위치 조정 및 선형 함정 4 중 극 (LTQ) 및 10 -이온 트랩 질량 분석기 (예를 들어, orbitrap)⁸50 m m.
   1. 소스에는 와이어의 반대쪽 끝을 연결 합니다. 첫 번째 시도 낮은 신호 강도 생성 하는 경우 이온 입구 가까이 식물 조직 이동 (최적화에 대 한 논의 를 참조).
5. 방법 파일; 데이터 파일의 이름을 지정 하 고 파일 저장 위치를 설정 합니다. 다음 MS 시스템에서 재생 을 클릭 하 여 설정 하 고 데이터 획득을 시작 하려면 시작 을 클릭 합니다.
6. 용 매 (예를 들어, 메탄올) 적용 손과 사용자를 보호 하기 위해 높은 전압 사이의 거리를 최대화 하기 위해 젤 로드 팁을 피펫으로 사용 하 여.
   참고: 용 매 볼륨 필요한 크기, 건조, 및 직물의 질감에 따라 달라 집니다, 일반적으로 잎 2 ~ 20 µ L. S. tortuosum 필요 하지 않습니다 추가 하는 어떤 용 매. 신중 하 게 용 매를 적용 하 고 때에 전압은 악기 소스를 만지지 마십시오. LC MS 학년 용 매 및 산 세척 되었습니다 하 고 세제의 무료로 유리를 사용 합니다. 일부 조직에서 신호 식물 조직의 자연 물 콘텐츠 인 용 매를 추가 하지 않고 관찰할 수 있습니다. 그러나, 더 큰 신호 강도 및 감소 된 S/N 일반적으로 조직에 용 매를 적용 하 여 달성 된다.
7. 신호 지속으로 또는 적절 한 스펙트럼이 수집 될 때까지 데이터를 수집 일반적으로 30-60 s. 필요한 경우, 추가 용 매는 더 긴 시간 동안 높은 신호 강도 유지 하기 위해 적용 됩니다. 데이터 수집을 중지 하 고 MS 시스템 일시 중지.
8. 조직을 제거 하 고 세척 100% 메탄올과 보풀 지우기와 클램프. 공급 업체의 사양에 따라 잎 스프레이 MS에 의해 약 1-2 h 인수 후 MS 이온 입구 청소. 또한, 다른 조직 유형 분석 사이 MS 이온 입구 청소.

4. 데이터 품질 평가

1. 데이터 파일을 열고 기본 피크 대량 chronogram를 육안으로 직접 검사 합니다. 신호 강도 5.0 x 10 ~1.0 x 10⁷ 인지 확인⁸. 신호가 낮은 경우에, 이온 유입에 조직 가까이 이동 합니다. 높은, MS 시스템의 프런트 엔드는 더러운 될 것 이다, 그래서 이온 입구에서 조직을 이동 합니다.
2. 생산 하는 질량 스펙트럼의 이온의 유무에 따라, 매개 변수를 변경 합니다.
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.

5. 협동 대량 파편

1. 이온 탠덤 대량 조각 (MS/MS);에 대 한 관심은 결정 > 1.0 x 10은 질량 스펙트럼 신호⁵ MS/MS에 대 한 이온의 선택에 대 한 충분 하다.
2. 4 소수 자릿수 밖으로 m/z 의 포함 목록으로 새로운 방법 파일을 만듭니다. 전역 목록 및 포함을 클릭합니다. PRM의 속성선택 조각화 에너지 [예를 들어, 30-50의 정규화 된 충돌 에너지 (후부 터)에 좋은 범위는 시작] 및 다른 MS/MS 매개 변수.
   1. Mesembrine 알 카 로이드에 대 한 MS/MS 데이터를 얻기 위해 다음 이온, 276.1583 m/z, 290.1742 m/z및 292.1897 m/z, 후부 터 35 조각화.
      참고: MS 후 즉시 또는 나중에 MS/MS 데이터 수집을 수행할 수 있습니다. 동일한 조직 수 자주 채워 후 전체 MS 고 MS/MS 데이터를 다시 사용할 수 있습니다. 그러나, respraying는 충분 한 신호를 제공 하지 않으면, 새로운 조직을 사용 합니다.
3. MS/MS 방법 파일 명명 된 데이터 파일을 로드 합니다. 켜고 MS 시스템 데이터 획득, 필요한 경우 용 매를 추가 시작 합니다. 적절 한 스펙트럼이 수집 하는 때 일반적으로 30-60 s 후 중지 인수.
4. 조각 이온을 할당할 때 많은 다른 에너지 조각을 수집 합니다.
   참고: 이후 잎 스프레이 MS 컬럼에 분리 부족, 조각화 스펙트럼 많은 이온을 포함과 선명도가지고 도움이 될 것입니다 다른 에너지에서 분할 합니다.

6. 상 상속 식별 정확한 질량과 탠덤 질량 조각화 하 여

1. Metlin²¹, 인간의 대사체 데이터베이스²², 대량 은행²³, 지질 지도²⁴, 국립 연구소의 공개적으로 사용 가능한 대사 산물 데이터베이스에서 정확한 질량 측정을 참조 하 여 상 상속 신원 확인 표준 및 기술 MS 검색²⁵, Phytochemicals²⁶또는 GNPS²⁷에 대 한 존중.
2. 이러한 데이터베이스는 완전 한, 필요에 따라 화학적 특징 식물 종에 추가 문학 검토를 수행 합니다.
3. 잎에서 일치 조각화 이온 스프레이 MS/MS MS/MS 정보는 때 상기 데이터베이스 또는 문학. MS/MS 조각 이온의 수동 해석 또는 직접 분사 또는 LC-MS/MS에 의해 수행 하는 정통 표준의 조각화를 또는 사용.

7. 데이터 분석

1. Proteowizard²⁸에서 msConvert 도구 mzXML 파일을 MS raw 파일을 변환 합니다.
2. 최대 따기에 대 한 R에서 구현 XCMS 소프트웨어 패키지를 사용 합니다. 사용 하 여 직접 주입 처리 잎 스프레이 MS 분석 방법.
   참고: 잘 주석 스크립트 데이터 처리에 사용 되는 https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code에서 찾을 수 있습니다.
3. 반 정량적 측정, 실험 가변성에 대 한 회계 표준화 각 대사 산물의 강도 총 이온 전류 (TIC)에 의해 잎 스프레이 MS 신호 강도 다를 수 있습니다, 일부의 위치에서 약간의 변화 때문으로 소스와 잎 모양과 크기 차이에 잎.
4. 또는 사용 하 여 데이터 분석 또는 MZmine2에 대 한 공급 업체에서 제공한 소프트웨어 (http://mzmine.github.io/에서 찾을 수)²⁹.

결과

10 주 후 발 아, 갓 수집 온실 재배 S. tortuosum 단풍 잎 스프레이 MS에 의해 분석 되었다. S. tortuosum 에서 대사 산물을 검출 하기 위한 실험 워크플로 MS는 그림 2에 나와 있는 잎 스프레이 사용 하 여 나뭇잎. 잎 선정, 테이퍼 끝 포인트를 형성 하는 얇은 스트립으로 잘라 되었고 잎 스프레이 MS 와이어 클램프 기구와 고정. 식물 조직 이온 입구?...

토론

이 프로토콜의 성공적인 사용은 식물 종, 조직 유형, 및 관심의 대상 compound(s)에 대 한 다양 한 단계의 최적화에 의존합니다. 프로토콜에서 설명 하는 매개 변수는 좋은 시작 지점을 제공 합니다. 필요가 다음과 같은 실험 결정을 만든 테스트: 여부 사용 (1) 절단 또는 포경된 조직 (2) 용 매 없는 용 매, 사용 하는 (3) 용 매 그리고 어떤 볼륨, (4) 이온 입구에서 조직의 거리 있어야 합니다 (5) 전압 진폭....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Conn Pin	Digi-Key elctronics	WM2563CT-ND	pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage
small clamp	Digi-Key elctronics	314-1018-ND	CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A
large clamp	Digi-Key elctronics	290-1951-ND	ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A
Heat shrink	Digi-Key elctronics	Q2Z1-KIT-ND	to cover soldering joints
NSI source Nanospray Ion Source	Thermo scientific	NA	Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap	Thermo scientific	NA	Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Tune Software	Thermo scientific		Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Xcalibur Software	Thermo scientific
Plant of interest - S. tortousum