제자리에 Myelinated 축 삭에 스펙트럼 Reflectometric 현미경

요약

여기, 우리는 레이블 없는 나노 이미징 기술 스펙트럼 셋에 기반을 사용 하 여 고정된 뇌 조각에 myelinated 축 삭 이미징을 위한 단계별 프로토콜 제시.

초록

포유류 신 경계에서 수 초 다층된 소용돌이에 축 삭 섬유 enwrapping 여 전기 절연을 제공 합니다. 그것의 높은 조직 subcellular 아키텍처에 의해 영감을, 우리 최근 전례 없는 레이블 없는 나노 이미징 라이브 myelinated 축 삭 제자리의 가능 하 게 스펙트럼 셋 (SpeRe) 라는 새로운 이미징 적임 개발. 기본 원리는 다층된 subcellular 구조의 반사율 스펙트럼을 분석 하 여 nanostructural 정보를 얻을 것입니다. 이 문서에서는, 우리는 화이트 라이트 레이저와 가변 필터 상업 confocal 현미경 시스템을 사용 하 여 신경 조직의 기본 SpeRe 이미징 수행 하기 위한 자세한 단계별 프로토콜을 설명 합니다. 샘플 준비, 스펙트럼 데이터 및 nanostructural 정보를 얻기 위해 처리 하는 이미지의 취득의 절차 설명 합니다.

서문

포유류 신 경계에서 수 초 다층된 막 덮개와 축 삭 섬유 enwrapping 여 빠른 신경 전도 및 axonal 무결성 제공 합니다. 그것의 다층된 구조 번갈아 나노 박막-필름 플라즈마 세포 막의 구성의 구성 (~ 5 nm), cytosol (~ 3 nm), 및 세포 외 공간 (~ 7 nm)^1,2. 광학 현미경 검사 법, 최근 슈퍼 해상도 현미경을 포함 하 여 광학 회절^3,,45로 인해 부족 한 해상도 인해 나노 myelin 역학을 관찰을 위한 적합 하지 않습니다. 전자 현미경은 myelin nanostructure의 좋은 정보를 제공할 수 있습니다, 그것은 화학 고정 및 ultrasectioning^{6,7 매우 침략 샘플 준비 인 생활 생물 학적 시스템와 호환} . 최근까지, 거기 되었습니다 아무 기술 나노 역학 myelinated 축 삭 제자리의 관찰에 적용.

Schain 외. 이전 myelinated 축 삭 다채로운 빛 반사율⁸전시 보고. 채택 하 여 반사 된 빛의 분 광 분석, 우리는 새로운 이미징 형식 스펙트럼 셋 (SpeRe)⁹라는 myelinated 축 삭의 나노 이미징에 대 한 고안 했다. SpeRe 박막 간섭 myelin 칼 집 (그림 1)의 다층된 구조에서 발생을 기반으로 합니다. 다양 한 축 삭에 광학 시뮬레이션에 의해 우리는 밝혀 그 반사율 스펙트럼 wavenumber 및 그것의 주기 주기 기능 ()은 축 삭 직경 (d)에 반비례 한다. 이 간단한 관계 () SpeRe 데이터에서 축 삭 직경의 손쉬운 정량화를 제공 합니다. 이 활용 하 여, 우리가 우리의 이전 보고서에서 온화한 외상 성 뇌 손상에서 불 룩 유행 축 삭을 밝혔다.

SpeRe 시스템 confocal 현미경 검사 법에 따라 특수 레이저 소스 구성 되어 있으며 필터 (그림 2). 입력된 소스 화이트 라이트 레이저, 광대역 스펙트럼 출력 적외선 영역 표시를 제공 하는. 스펙트럼 검사에 대 한 시스템은 갖추고 두 acousto 광학 장치: 반영 선택한 지도 대 한 입력된 광대역 소스와 acousto 파이버 빔 스플리터 (AOBS)에서 선택 된 파장을 제공 하는 acousto 광학 가변 필터 (AOTF) 검출기의 파장 Hyperspectral confocal 현미경 검사 법에 대 한 소프트웨어 ( 재료의 표참조) 순차적으로 다양 한 입력된 파장에서 반사율 이미지를 수집 하는 사용자 정의 스펙트럼 스캔 옵션을 제공 합니다. 또한, 색수차 수 있습니다 비판적으로 간섭 스펙트럼 측정; 따라서,는 apochromat 렌즈의 사용을 권장 합니다.

메모의 화이트 라이트 레이저 고르지 스펙트럼 출력을 생성 하 고 광학 구성 요소 스펙트럼 프로필에도 영향을 줍니다. 따라서, 인수 스펙트럼 후속 정량 분석에 대 한 보정 필요. 보호은 거울은 일반적으로 전체 표시 영역 위로 거의 일정 한 반사율 (> 97%)을 제공 하는 참조로 사용 됩니다. 인수 스펙트럼 다음 미러에서 참조 스펙트럼으로 나누어집니다.

스펙트럼 검사에 대 한 스펙트럼 스텝 크기 결정 수집 속도; 따라서, 그것은 최적화가 필요 합니다. 더 큰 축 삭은 더 높은 스펙트럼 기간, 그것은 스펙트럼 샘플링을 세밀 하 게 필요 합니다. 예를 들어 가장 큰 생리 축 삭 중 10 µ m의 직경을 가진 축 삭 스펙트럼의 기간이 ~ 8 nm. 나이 키스 트 샘플링 조건을 적용 하 여 우리 고용 스펙트럼 샘플링 간격 4 nm 마우스 신경 조직에서 모든 생리 축 삭을 커버. 이 방법은 일반적으로 전체 스펙트럼 검사에 대 한 몇 초 동안 걸리며 따라서 적합 하지 않습니다 vivo에서 응용 프로그램 (예: 호흡 및 심장 박동) 생리 모션 안정적 스펙트럼 수집을 방해. 우리는 이전 배열 분석기 (수집 속도 ≈ 픽셀 당 30 밀리초)를 사용 하 여 각 지점에 대 한 전체 스펙트럼을 확보 하도록 설계 된 사용자 지정된 수직 현미경 계측 하 여이 문제를 해결.

이 보고서에서 우리는 상업 hyperspectral 현미경에서 실행 될 수 있는 고정된 뇌 조각에 SpeRe 이미징에 상세한 프로토콜을 설명 ( 재료의 표참조). 따라서, 프로토콜 광 계측에 전문성 없이 경험 하 여 완료할 수 있습니다. 우리는 또한 잠재적인 문제 및 수집 및 SpeRe 데이터의 분석에 대 한 문제 해결을 커버.

프로토콜

모든 수술 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 성균관 대학에 의해 승인 되었다.

1. 샘플 준비

참고: 오토 클레이 브 동물 처리 하기 전에 모든 수술 기구. 수술에 전념 한 방에 모든 수술 성능을 수행 합니다. 수술 실에서 모든 직원에 의해 불 임 수술 가운과 장갑을 항상 착용 되어야 한다.

1. 조직의 고정
   1. 각 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 4 %paraformaldehyde (PFA) PBS에 가득 두 10 mL 주사기를 준비 합니다.
   2. 7 12 주 된 마우스 (C57BL/6J 이나 어느 성별 어떤 마우스 라인) zoletil와 xylazine (1:1, 20 mg/kg 각) 또는 다른 적합 한 마 취 정권 (예를 들어, 80 mg/kg 케 타 민 고 10 mg/kg의 혼합물의 혼합 투여 하 여 anesthetize xylazine)는 복 주사로.
   3. 마우스에는 마 취 (발가락 핀치-응답 방법 사용)의 수술 평면에 도달 했습니다, 일단가 위 피부와 흉 곽을 절단 하 여 마음을 노출 합니다.
   4. 오른쪽 아 트리 움 분출 혈액과 바늘으로 순차적으로 좌 심 실 통해 PBS와 PFA 솔루션 perfuse 작은 위로 싹 둑 (관류 속도 4 mL/min, 볼륨 = = 각 솔루션에 대 한 10 mL).
      참고: 마우스 뻣 뻣 한 경우 프로시저가 성공적으로 완료 됩니다. 눈 연 고 또는 살 균의 사용 절차는 터미널로 필요 하지 않습니다. 고정 절차를 건너뛸 수 있습니다. 그러나,이 단계는 구조적 변형 기계적 조직 손상 등 허 혈 성 axonal 붓기를 최소화 하기 위해 권장 됩니다. 에 대 한 자세한 내용은 조직 고정, 게이지, G. J. 그 외 여러분 에 의해 문서를 참조 ¹⁰
2. 두뇌 슬라이스 준비
   1. 복 부 흉부와 복 부를 통해 수술가 위로 마우스를 목을 벨.
   2. 두 피와과 완벽 하 게 노출 된 두개골까지 적당 하 게 작은 위를 사용 하 여 제거 합니다.
   3. 전 뼈를 휴식 하 고 두뇌를 손상 않기로 주의 작은 위를 사용 하 여 후 두 뼈에서 화살 봉합을 따라 두개골을 잘라.
   4. 부드럽게는 두개골 및 dura mater 미세 집게를 사용 하 여 순차적으로 제거 합니다.
   5. 뇌를 조직을 손상 하지 않도록 주의 복용, 부드러운 플라스틱 숟가락을 사용 하 여 압축을 풉니다.
   6. 린스 및 4 ° c.에 30 분 동안 4 %PFA 솔루션에서 추출한 뇌를 담가
   7. vibratome을 사용 하 여 100-150 µ m 섹션으로 고정된 두뇌를 슬라이스.
      참고:에 대 한 자세한 내용은 조직 준비, 참조 문서 Segev 외. ¹¹. 후속 절차, 조직 해야 될 슬라이스 섹션으로는 스페이서의 두께 보다 얇은.
3. 뇌 조각의 장착
   1. 각 조직 조각 1 유리 슬라이드와 2 평방 커버 안경 (22 × 22 × 0.17 m m)를 준비 합니다.
   2. 반으로 잘라 사각형 커버 안경 중 하나 (2 개의 직사각형 조각) 유리 커터를 사용 하 여.
   3. 슈퍼 접착제를 사용 하 여 슬라이드 유리에 등분된 커버 안경의 두에 연결.
      참고: 두 개의 등분된 안경 사이 공간 조직 조각의 크기 보다 약간 더 큰 수 한다.
   4. 브러쉬 또는 한 피 펫을 사용 하 여 뇌 슬라이스를 수확 하 고 슬라이드 유리는 공백 사이 조직 하다. 알아서 하지 조직 접어.
   5. 조직 표면에 PBS의 100 μ 분배.
   6. 조직 위에 다른 평방 덮개 유리를 두십시오. 이 단계 동안 공기 방울의 포함을 하지 마십시오.
   7. 후속 이미징 세션 동안 먼지에 의해 PBS의 증발 및 오염을 방지 하기 위해 매니큐어 (또는 또는 적당 한 접착제)를 사용 하 여 덮개 유리 주위 인감.
      참고:는 실험이이 단계에서 일시 중지 될 수 있습니다.

2입니다. 보정

1. 현미경 적어도 1 시간에 전환 하기 전에 레이저의 열 안정화 수 있도록 영상 소스 ( 재료의 표참조). 다음, 소프트웨어 스펙트럼 스캔 ( 재료의 표참조)를 설정 하 고 GUI (그림 3a). 의 정상 취득 버튼을 클릭
2. 백색-빛 레이저 (WLL) 및 광 전 증폭 관 관 (PMT) (그림 3a)에 대 한 소프트웨어 셔터를 켭니다.
3. 획득 모드에서 드롭-다운 목록에 xyΛ 모드 를 선택한 다음 레이저 입력된 모드는 일정 한 힘을 일정 % 에서 자동으로 변경 된다. 자동 SP 움직임의 확인란 선택을 취소 합니다. 다음, 470-670 nm와 4 스펙트럼 스텝 크기 입력된 레이저의 스펙트럼 창 설정 Λ에 nm-여기 람다 스캔 설정 (그림 3b).
4. 두 번 클릭 하거나 막대를 이동 하면 조정 스펙트럼 범위 (그림 3c) 450-690을 PMT의 스펙트럼 범위를 설정 합니다.
   참고:이 스펙트럼 범위 입력 소스의 완전 한 대역폭을 포함 해야 합니다.
5. 적당 하 게 높은 수 가늠 구멍으로 물 침수 대물 렌즈 선택 (NA > 0.7) AOBS 구성 및 라이브 스캔 버튼을 활성화 하려면 PMT와 레이저 파워에 어떤 가치를 부여 하 고. AOBS 구성 (그림 3)에서 반사를 확인 하 여 광학 경로 전환 합니다.
6. 참조 미러 마운트 ( 재료의 표참조) 현미경 스테이지. 미러 표면 목표 렌즈에 대 한 직면 한다. 그렇지 않으면 미러 현미경 무대에 넣어 쉽게, 플랫 플레이트 (예: 슬라이드 유리)에 미러 본드.
7. 거울 표면에 초점 비행기를 정렬할 현미경 단계를 제어 합니다.
8. PMT 이득 및 레이저 전력 검출기의 동적 범위를 고려 하 고 조정 하 고 일정 한 힘을 일정 % 에서 레이저 입력된 모드를 변경 합니다.
   참고: 일반적으로 PMT 500 (V)의 고 0.1%의 상대 레이저 파워 570에 사용 된다 nm.
9. 파장 범위에 걸쳐 채도 없음 확인 의사 색상 모드에서 확인 합니다. 채도 관찰 되는 경우 낮은 레이저 파워 (그림 3a).
10. 람다 검색 인수를 실행 합니다.
11. 무대에서 미러를 제거 하 고 어두운 참조 (즉, 어두운 오프셋)를 얻기 위하여 샘플 없이 동일한 수집을 반복 합니다.
12. Multistacked TIF 형식에 데이터를 저장 합니다.

3. SpeRe 이미지 수집

1. 탑재 된 조직 현미경 스테이지에 배치 합니다. 대물 렌즈의 초점면에 조직을 맞추려면 대략 눈 조각을 통해 넓은 필드 형광 모드를 사용 합니다.
2. 라이브 검색 에, 조직에 대 한 관심의 영역에 초점 비행기를 정렬할 현미경 단계 제어할. 커버 슬립에서 배경 잡음을 방지 하려면 유리-조직 인터페이스에서 적어도 15 μ m 깊이의 대상 영역을 선택 합니다.
3. 취득 단계 2.1-2.10에서에서 설명한 대로 동일한 절차를 사용 하 여 대상 지역에 대 한 스펙트럼 이미지 스택.
4. Multistacked TIF 형식에는 조직 및 어두운 오프셋에 대 한 데이터를 저장 합니다.
   참고:는 실험이이 단계에서 일시 중지 될 수 있습니다.

4. 이미지 처리 및 분석

1. ImageJ에서 참조 거울과 뇌 조직에 대 한 스펙트럼 데이터 (multistacked TIF)를 엽니다.
2. 열린된 이미지 스택을 ROIs (관심 지역) 선택-참조 거울과 뇌 조직에 대 한 축 삭 섬유의 세그먼트에 대 한 중앙 지역.
3. 실행 이미지 → 스택 → 선택한 ROIs에 대 한 원시 스펙트럼을 취득 ImageJ 메뉴에서 플롯 z 축 프로필 .
4. 어두운 오프셋된 데이터, 참조 거울 하 고는 다른 뇌 조직에 대 한에 대 한 하나를 엽니다.
5. 실행 이미지 → 스택 → 어두운 오프셋에 대 한 스펙트럼을 취득 ImageJ 메뉴에서 플롯 z 축 프로필 .
6. 복사 및 붙여넣기 옵션을 사용 하 여 모든 인수 스펙트럼을 저장 합니다.
   참고: SpeRe 이미징, 꺼짐-축 광학 착오를 최소화 하기 위해 중앙 이미지 필드의 사용은 권장 됩니다. 축 삭 섬유는 구조적으로 그들의 길이 따라 다른 유형의 수 있습니다. 따라서, 작은 축 삭 세그먼트에 ROI를 선택 하면, 일반적으로 부분 볼륨 유물을 최소화 하기 위해 < 5 µ m 것이 좋습니다.

5. 기준선 보정 및 SpeRe 신호 분석

1. 뇌 조직과 참조 거울의 스펙트럼에서 오프셋된 스펙트럼을 뺍니다.
2. 스펙트럼의 최대 강도 분할 하 여 각 스펙트럼을 정상화.
3. 참조 거울의 정규화 된 스펙트럼에 의해 축 삭의 정규화 된 스펙트럼을 분할 하 고 정규화 된 스펙트럼에서 DC 오프셋을 뺍니다.
4. 피팅 한 정현파를 인수 스펙트럼 wavenumber 주파수 측정 곡선 ( 재료의 표참조), 그리고 다음 복용 상호 여 주기 인수 wavenumber를 변환할.
5. 그림 4c에서 방정식을 사용 하 여 축 삭 직경 wavenumber 주기를 변환 합니다.

결과

프로토콜에 따라 고정된 뇌 조각 exogenous 얼룩, myelin 타겟팅 fluorophore과 준비 ( 재료의 표참조). SpeRe 이미징 confocal 형광 이미징 (그림 4a)와 함께에서 상업 hyperspectral confocal 현미경을 사용 하 여 두뇌 조각에서 수행 되었다. SpeRe, 5 µW / µ m² ~ 1 µs의 픽셀 드웰 타임을 입력된 광 강도 설정 되었습니다. 이 빛 복용량은 순서의 크기는 ?...

토론

SpeRe는 새로운 라벨 무료 이미징 형식 스펙트럼 간섭계는 처음으로 라이브 myelinated 축 삭에서 나노 정보 제공에 따라 이다. 현재 수집 프로토콜에서 축 삭 직경에 대 한 공간적 해상도 10의 순서의 이다 nm. 또한, SpeRe 크기 순서 낮은 빛 복용량 다른 슈퍼 해상도 microscopies;에 비해 활용 따라서, phototoxicity 및 photobleaching에서 무료입니다. SpeRe myelinated 축 삭의 나노 역학 공부에 대 한 새로운 길을 제공할...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass cutter	-	-	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
Nail polish	-	-	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
Apochromat objective 40×, NA 1.1	Leica Microsystems	15506357	Water-immersion type
Fluoromyelin Green	Thermo Fisher	F34651	Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used.
Leica SP8 TCS microscope	Leica Microsystems	SP8	Refer to the "Configuration of microscope" in Introduction Section for details.
Imaging software	Leica Microsystems	LAS-X	-
Matlab	MathWorks	-	-
Mirror	Thorlabs	PF10-03-P01	Coated with protected silver.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Life technologies	14190-136	-
Paraformaldehyde	Biosolution	BP031a	4% v/v in PBS
Cover slip	Thermo Fisher	3306	Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm)
Slide glass	Muto Pure Chemicals	5116-20F	Thickness: ~1 mm
Super glue	Henkel	Loctite 406	Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact.
Syringe pump	Brainetree Scientific	BS-8000 DUAL	-
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200S	-
White-light laser	NKT photonics	EXB-6	EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6.