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Method Article
여기, 선물이 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM) site-specifically 수정된 λ DNA 기판 및 양자 점 단백질 분류를 사용 하 여 DNA 단백질 상호 작용을 공부 하는 프로토콜.
형광 현미경 검사 법 단일 분자 수준에서 복잡 한 생물 학적 과정의 메커니즘을 해 부에 큰 기여를 했다. 단일 분자 DNA 단백질 상호 작용을 공부에 대 한 분석에서 고려에 대 한 두 가지 중요 한 요소는: 쉽게 관찰 하 고 적합 한 형광 프로브는 단백질을 라벨에 대 한 충분 한 길이와 DNA 기질. 48.5 kb λ DNA DNA 기판에 대 한 좋은 후보입니다. 양자 점 (Qdots), 형광 프로브 클래스로 장기간 관찰 (시간 분)와 높은 품질 이미지 수집 수 있습니다. 이 논문에서는, site-specifically 수정된 λ DNA를 준비 하 고 라벨 streptavidin 입히는 Qdots와 대상 단백질을 포함 하는 단일 분자 수준에서 DNA 단백질 상호 작용을 공부 하는 프로토콜 선물이. 개념 증명에 대 한 우리 오크 (복잡 한 원산지 인정) 신진 효 모에 관심사의 단백질으로 선택한 TIRFM 사용 하는 ARS (자동으로 복제 시퀀스)와 상호 작용을 시각화 합니다. 다른 형광 프로브에 비해, Qdots photobleaching에 대 한 그것의 높은 안정성 때문에 단일 분자 연구에 분명 한 이점이 있다 하지만이 속성 양적 분석에 응용 프로그램 제한에 주목 한다.
단백질 및 DNA 사이 상호 작용, DNA 복제, DNA 수리, 전사 등 많은 복잡 한 생물 학적 과정에 필수적입니다. 기존의 접근 이러한 프로세스의 속성에 빛을 발산가, 비록 많은 키 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 최근, 급속 하 게 발전 한 분자 기술로 메커니즘의 일부 해결된1,2,3되었습니다.
주로 단백질 DNA 상호 작용을 실시간으로 시각화에 단일 분자 형광 현미경 검사 법의 응용 프로그램의 형광 탐지 및 형광 프로브 개발에 따라 달라 집니다. 단일 분자 연구를 위해 그것은 형광 탐지 시스템은 주로 상업적으로 사용할 수 있기 때문에 적합 한 형광 프로브 관심사의 단백질을 분류 하는 것이 중요.
형광 단백질 분자 생물학에 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, 낮은 형광 밝기 및 photobleaching에 대 한 안정성 많은 단일 분자 분석에 응용 프로그램을 제한합니다. 양자 점 (Qdots)는 작은 발광 나노 입자4. 그들의 독특한 광 속성으로 인해 Qdots은 10-20 배 더 밝다 고 몇 천 배 더 많은 안정 보다 널리 사용 되는 유기 염료5. 또한, Qdots 있다 큰 Stokes shift (여기 및 방출 봉우리의 위치 사이의 차이)5. 따라서, Qdots 동안 양적 분석에서 이용 될 수 없습니다 오랜 관찰 (시간 분) 및 높은 신호 대 잡음 비율, 이미지의 수집에 대 한 사용할 수 있습니다.
날짜 하려면, site-specifically Qdots와 대상 단백질을 분류 하는 방법은 두 가지: Qdot 활용 된 주 또는 보조 항 체6,,78;의 원조로 또는 대상 단백질 Qdots와 직접, biotin와 streptavidin9,10,11,,1213사이 강한 상호 작용을 기반으로 라벨. Qdots Streptavidin 입히는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 우리의 최근 연구에서 site-specifically biotinylated 단백질을 높은 효율으로 신진 효 모에 BirA Avi 태그 단백질의 공동 overexpression에 의해 정화 되었다 vivo에서10. 다음 하 고 단일 분자 분석 실험14,15,,1617최적화, 단일 분자 수준의 사용에 Qdot 표시 된 단백질 및 DNA 사이 상호 작용 관찰 TIRFM10.
여기, 우리가 선택한 신진 관심사의 우리의 단백질으로 원래 인식 복잡 한 (오크)을 구체적으로 인식 하 고 자율적으로 복제 시퀀스 (ARS)에 바인딩할 수, 효 모. 다음 프로토콜 TIRFM를 사용 하 여 Qdot 표시 된 오크 ARS와의 상호 작용을 시각화 하는 단계별 절차를 제공 합니다. Site-specifically 수정된 DNA 기판, DNA biotinylation, coverslip 청소 및 기능화, 흐름 셀 어셈블리 및 단일 분자 이미징의 준비는 설명 합니다.
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1. λ-ARS317 DNA 기판의 준비
2. λ-ARS317 DNA Biotinylation
3. Coverslip 청소 및 기능화
4. 흐름 셀 조립
5. 단일 분자 시각화
6. 데이터 분석
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Qdot 표시 된 오크는 ARS의 상호작용을 시각화 하려면 우리가 먼저 λ-ARS317 DNA 기판 건설. ARS317를 포함 하는 DNA 조각 통합 되었다 Xho에 내가 사이트 (33.5 kb) 네이티브 λ DNA의 동종 재결합 (그림 1A). 재결합 제품 추출 물을 사용 하 여 패키지 된 고 포장된 살 균 소 입자 파운드 플레이트 (그림 1B)에 경작 되었다. 긍정적인 살 균 ...
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여기, 선물이 Qdot 표시 된 단백질 및 흐름 셀에서 TIRFM는을 사용 하 여 site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 관찰 하는 프로토콜. 필요한 단계는 DNA 기판, DNA biotinylation, coverslip 청소 및 기능화, 흐름-세포 준비, 및 단일 분자 이미징 사이트 수정 포함 됩니다. 주목 해야 한다 두 가지 요점을 확인 하 고 있습니다. 첫째, λ DNA와 관련 된 단계, 예를 들어, 어떤 가능한 손상 감소를 부드럽게 ...
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저자는 공개 없다.
우리 닥터 하 산 Yardimci 감사 하 고 종류의 프랜시스 크릭 연구소의 Dr.Sevim Yardimci 도움이 단일 분자 실험에의 컬럼비아 대학, 박사 에릭 C. 그린의 연구소에서 박사 다니엘 Duzdevich 박사 유지 북경 대학교의 태양과의 Chunlai 첸 박사 칭화 대학 유용한 토론에 대 한입니다. 이 연구는 국립 자연 과학 재단의 중국 31371264, 31401059, CAS 혁신 팀과 뉴턴 고급 친교 (NA140085)에서 왕 사회에 의해 지원 되었다.
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
MaxPlax Lambda Packaging Extracts | Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
Tris | Amresco | 0497-5KG | |
NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
mPEG (methoxy-polyethylene glycol) | Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) | Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
Infusion/withdrawal programmable pump | Harvard apparatus | 70-4504 | |
532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
W-View Gemini Imaging splitting optics | Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
Quad-edge laser dichroic beamsplitter | Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 | |
Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 | |
Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
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