꼬마 체: 낮은 악기와 작은 Multicellular 유기 체를 정렬에 대 한 방법론

요약

정렬 및의 인구 나이 일치의 청소에 대 한 방법론을 포함 하는 현재 프로토콜 꼬마 선 충. 그것은 연구에 대 한 선 충의 큰 실험적인 인구를 간단 하 고, 저렴 한, 그리고 효율적인 맞춤 도구를 사용 합니다.

초록

꼬마 선 충 (C. 선 충)은 기본 및 생물 의학 연구의 범위에 걸쳐 사용 되는 기초가 튼튼한 모델 유기 체. 선 충 연구 커뮤니티 내에서 C. 선 충의 큰, 나이 일치 하는 인구를 유지 하는 저렴 하 고 효과적인 방법에 대 한 필요가 있다. 여기, 우리 기계적으로 정렬 및 청소 C. 선 충에 대 한 방법론을 제시. 우리의 목표는 동물의 균일 한 크기와 실험에 그들의 사용에 대 한 생활 단계를 비용 효과적, 효율적, 빠르고 간단한 프로세스입니다. 이 도구, 꼬마 체 사용 사용자 뚜껑 시스템을 일반적인 원뿔 실험실 튜브에 스레드 및 선 충 C. 신체 크기에 따라 정렬 합니다. 우리 또한 그 꼬마 체 효과적으로 동물에서에서 전송 하나의 문화 접시는 빠른 정렬, 동기화, 및 건강의 표시를 영향을 주지 않고 청소에 대 한 다른 허용 보여 운동 성 포함 하 고 스트레스를 유도할 수 있는 진 기자입니다. 이 접근 가능 하 고 혁신적인 도구 C. 선 충 인구를 유지 하기 위한 빠르고, 효율, 비-스트레스 옵션입니다.

서문

선 충 벌레, 꼬마 선 충, 최고의 모델 생물 이다. 실험실에 있는 그들의 경작의 간단 하 고 제어 특성, 뿐만 아니라 그들의 전체 게놈 시퀀스¹ 이며 각 셀의 개발 운명²알려져 있다. 이러한 기능을 구현, C. 선 충 유전자 연구에 대 한 널리 사용 되는 모델 생물 이다. 그러나, 이러한 유익한 특성 함께 연구자에 대 한 몇 가지 과제를 올. 그들의 빠른 생성 시간 때문에 C. 선 충 인구 음식에서 신속 하 게 실행할 수 있습니다 또는 여러 세대와 인구 혼합 되 고 발달 단계를 한 번에 제시. 따라서, 고체 선 충 성장 매체 (NGM)에서 수행 하는 실험 연구자 세균 식량 고갈 시키고 새로운 애벌레 개발 하기 전에 물리적으로 신선한 번호판 동물 이동에 필요 합니다. 이 자식 세대와 혼합 되 고에서 실험적인 인구를 방지 하는 데 필요한 동물의 빈번한 전송 지루한 될 수 있습니다. 아직도, 실험 동물 및 확장된 시간 포인트 (예, 성인 기에 DNA 또는 RNA 추출)의 둘 다 다 수 필요합니다. 이 정확 하 게 동기화 된 인구를 유지 하 고 전송 하는 동물의 많은 수의 문제 화합물.

C. 선 충 NGM에서 양식 전송의 현재 방법 따기 또는 세척 동물 격판덮개; 화학적 치료 동물 (예를들면, DNA 복제 억제 물 fluorodeoxyuridine 또는 FUDR); 또는 cytometry 정렬 다 잘 판에 동물을 사용 하 여. 따기 개인 또는 여러 동물^3,4를 수동으로 전송 하는 얇은 백 금 철사 또는 속눈썹로 만든 손 도구를 사용 하 여를 포함 한다. 이 방법은 정확한 하지만 기술 그리고 시간 요구 이며 동물의 많은 수를 포함 하는 연구에 대 한 제한. 또한 5 월을 따기 되며 물리적으로 손상 동물에 스트레스 잠재적으로 힘의 부 자연스럽 고 일관성 없는 금액에 개인을 쓰는 하 여. 세척 포함 버퍼 솔루션 문화 접시를 헹 구 고 새로운 문화 접시에는 동물 들과 함께 솔루션 유리 파스퇴르 피 펫을 통해 전송 됩니다. 이 방법은 신속 하 고 효율적인 하지만 여러 세대와 동물의 발달 단계는 대량에서 전송에 정확 하지 않다. FUDR, 같은 화학 치료는 차단 어떤 DNA 복제 그리고 이렇게, 생식 체 생산 및 계란 개발 통해 자손의 생산을 방지 하기 위해 자란 미디어에 녹아 수 있습니다. 동안 효과, 즉, 자사의 관리³이전 동물을 전송 하는 요구는 여전히 그리고 정상적인 발달 과정을 방해 하지로 발달 성숙 후이 메서드를 적용 해야 합니다. 이 메서드는 또한 여러 개의 셀룰러 신호 경로, 결과 동물에 눈에 띄는 효과 (예를 들어, 수명 연장 또는 변경 된 proteostasis) C. 선 충 사용^{5의 변형에 따라 영향 6,,78,,910}. 교류 cytometry 방법을 자동으로 정렬 하 고 다른¹¹한 멀티 잘 플레이트에서 개별 C. 선 충 을 전송. 이 방법은 매우 효과적이 고 효율적인 동안 흐름 cytometry 장비는 엄청나게 비싼 많은 연구원에 액세스할 수 있습니다. 동물을 전송 하는 대신 온도 등 그다지 15 fem-1, 온도 조정¹²살 균 되는 민감한 돌연변이 모델을 사용 하는 것입니다. 돌연변이 동물을 사용 하 여 하는 것이 어떤 상황에 유용 하지만 이러한 특정 변종 야생-타입 동물 보다 느리게 성장 하 고 그들은 에이징 또는 건강 한 벌레에 대 한 불 쌍 한 대표자로 봉사 하는 변경 된 게놈에 의존. 또한, 무 균을 유도 하기 위해 온도 변화에 대 한 의존도 또한 정적 환경의 부재에 발생 하 고 온도 변화 유전자 식^13,14, 에 영향을 쉽게 표시 되었습니다 ¹⁵. 연구 그룹 이전 크기¹⁶ C. 선 충 을 필터링 하는 메시의 사용을 설명 하는 기술을 출판. 그러나, 우리가 이전 작품 어떤 변화 같은 필터의 사용과 관련 된 전반적인 건강 결과에 대 한 테스트를 찾을 수 없었습니다.

따라서, 문화 판 사이의 동물의 많은 수를 전송 하기 위한 저렴 한 가격, 신속, 효율적이 고 정확한 방법에 대 한 C. 선 충 연구 커뮤니티 내에서 필요 하다. 향상 된, 액세스할 수 (라는 이름의 꼬마 체) 장비 및 그것의 제조 및 C. 선 충 연구 커뮤니티의 요구를 충족 하는 작업에 대 한 연결된 프로토콜의 조각을 개발 했습니다. 여기, 우리 꼬마 체 및 그 사용 방법의 디자인을 공유 하 고 우리는 그것의 사용 영향을 주지 않는 일반적인 건강 또는 표준 수동 채집 및 치료는 일반적으로 사용 되에 비교 될 때 어떤 스트레스 마커 입증 다 산 제한 화학 FUDR

프로토콜

1. 꼬마 체 건설 및 사용

1. 건설 프로토콜
   1. 50 mL 원뿔 튜브 (그림 1A)에서 2 뚜껑을 얻을.
   2. (하단, 그림 1B에서 볼) 때 뚜껑의 안쪽 입술 안쪽 중심 영역을 제거 분 젠 버너와 뜨거운 금속 프로브 또는 납땜을 사용 하 여 또는 드릴 비트를 강화.
      참고: 상해의 위험이 있기 때문에 블레이드 보다는 플라스틱 뚜껑을 열을 사용 하 여입니다.
   3. 청소 하 고 잘라 가장자리를 모래 톱 곡선된 파일 또는 로타리 연마 도구 (예를 들어, Dremel) 표면. 그림 1C참조.
   4. 적절 한 지름 (그림 1D) monofilament 메시의 동그라미를 잘라. 이 위해, monofilament 나일론 메쉬 시트에 뚜껑을 추적 하 고 그려진 라인 안에 그냥 잘라.
   5. 접착제 (그림 1E) 플라스틱에 적용 되 면 두 개의 뚜껑의 접착을 강화 하는 뚜껑의 위쪽 표면에 홈/슬래시 잘라.
   6. 에탄올과 뚜껑을 깨끗 하 고 건조 그들을 보자.
   7. 외부 가장자리를 유지 하는 두 뚜껑의 위쪽 표면에 cyanoacrylate 접착제를 적용 합니다.
      참고: 접착제 조금 먼 길을 간다.
   8. 하나 붙어 뚜껑 (그림 1 층)에 표 1에 따라 monofilament 메쉬를 하다. 메쉬; 위에 거꾸로 두 번째 뚜껑을 배치 두 뚜껑 함께 그들의 꼭대기를가지고 있어야 합니다. 단단히 함께 (그림 1G)을 누릅니다. 메쉬 긴장 된 인지 확인 합니다.
      참고: 안전 조치로, 뚜껑에는 메쉬를 사용 하 여 족집게.
   9. 접착제의 초기 레이어는 건조 되 면 뚜껑 사이의 외부 간격 주위 cyanoacrylate 접착제의 링을 적용 합니다. 이 무결성을 추가 하 고 떨어져 또는 새 어떤 필 링 방지 관대 한 수 있습니다.
   10. 필터 monofilament 메시의 메시 기 공 크기와 레이블을 지정 합니다.
       참고: 여기, 우리가 사용 하 여 두 개의 메시 기 공 크기-20 µ m, 50 µ m.
2. 프로토콜을 사용 하 여
   1. 미리 체 젖은.
      1. 염 분 해결책, M9 등 플라스틱 [5 g의 NaCl, 나₂HPO₄6 g, KH₂포₄, 1 초순 H₂O, L 그리고 MgSO₄ (1 M)의 1 mL의 3 세대]¹⁷, 방울 양식까지 체의 센터를 통해 압축, 및 필터 아래쪽 (그림 2A)의 중심에서 drips. 필요에 따라 모양 아래쪽에 보풀 지우기 (예, Kimwipe)을 적용 하거나 메시에 수 분 물방울을 확산.
      2. 50 mL 원뿔 튜브 위에 체를 놓습니다. '폐 튜브' 튜브 라벨 (그림 2B).
   2. 한 천 배지에서 C. 선 충 의 인구를 씻어.
      1. M9 버퍼와 접시 세척 하 고 한 번 (그림 2C)에 웜 포함 된 매체 monofilament 메쉬 1 mL의 위쪽에 배치. 메시의 중심에서 작동 해야 합니다. 모든 벌레는 접시에서 씻는 다.
         참고: 일반적으로, 60 m m 플레이트 m 9의 3 mL 충분 하다.
      2. Pipetting에 벌레의 수를 최소화 하기 위해 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 접시에서와 메쉬 센터 (필요에 따라 반복)에 벌레를 이동.
      3. 상단에서 M9 버퍼와 필터를 씻어. 다시, 메시의 센터에서 운영 하 고 그 지역에서 모든 벌레를 헹 굴에 있는지 확인 하십시오. 모든 박테리아와 작은 벌레는 메시를 통해 전달 되도록 필요한 만큼 여러 번 씻는 다.
   3. 체에서 크기 일치 하는 동물을 수확.
      1. 단계의 새 컬렉션 튜브 (그림 2D)의 내부를 직면 하는 1.2.2.3 어른 벌레와 체의 상단에 새로운 50 mL 원뿔 튜브를 연결 합니다.
      2. 첫 번째 관 (폐기물 관)을 제거 하 고 신속 하 게 체 고을 드롭릿에 마이그레이션 하는 것을 막기 위해 새로운 튜브를 뒤집어 (그림 2E).
         참고: 무 균 필요 하지 않은 경우 사용 하 여 보풀 지우기 (예, Kimwipe) 윅 유체를 튀기기 전에 메시의 하단에서.
      3. 새로운 위쪽 (그림 2F)에서 새로운 50 mL 튜브에 M9와 메쉬 린스. 다시, 메쉬 센터에서 운영 하 고 메시의 밑면에 작은 물방울을 유지 합니다.
      4. 정착 하거나 부드럽게 아래로 회전 웜 허용 (예를 들어, < 16 x g) 약 1 분 (그림 2G).
      5. 에 벌레, 펠 릿에서 버퍼 솔루션을 이상적으로 발음 > 0.5 mL, 또는 펠 릿을 방해 하지 않고 최대한 많은 액체를 제거.
      6. 플라스틱 유리 NGM 접시에 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 웜 하 고 그들을 건조. 공간 여러 방울 밖으로 새로운 접시에 그래서 그들은 더 빠른 (그림 2 H)를 건조.
   4. 체를 청소.
      1. 에탄올과 역방향 삼 투 물으로 체를 부드럽게 하 고 철저 하 게 린스. 건조 하자.
      2. 무기한 미래의 사용에 대 한 깨끗 한 용기에 그것을 저장 합니다.
      3. 메시 "sag" 외관을 개발 했을 때 그것을 폐기.

2. 꼬마 체 정렬 방법의 유효성 검사

1. 일반 유지 보수
   1. 모든 실험에 대 한 문화 표준 선 충 류 성장 미디어¹⁷ 에 벌레 (NGM의 1 L 펩, 한 천, 3 g의 NaCl, 이중 증 류 물, 5 mg/mL 콜레스테롤, 1 M CaCl₂ 의 1 mL의 1 mL의 975 mL의 17 g의 2.5 g의 구성 1 mL의 1 M MgSO₄, 1m KHPO₄, 25 mL 및 100 mg/mL 스의 0.5 mL) 25 ° c.에
2. 실험 치료 관리
   1. 3 치료 그룹을 비교: 선택, fluorodeoxyuridine (FUDR), 그리고 꼬마 체.
      1. FUDR 치료 그룹에 대 한 NGM 미디어 어떤 자손 생산을 방지 하기 위해 100 μ M의 최종 농도를 100mg/mL FUDR을 추가 하 고 매일 음식 소모를 피하기 위해 신선한 NGM 접시에 벌레를 전송.
      2. 선택 그룹에 대 한 선택 하 고 웜 백 금 루프를 사용 하 여 수동으로 전송 합니다.
      3. 꼬마 체 치료 그룹에 대 한 1.2 단계를 수행 하 고 플라스틱 NGM 접시에 벌레.
3. 꼬마 체 백분율 수확량
   1. C. 선 충분류에 얼마나 효과적인 체는 계량, 25 ° C (즉, 달걀 누워 후 48 h)에서 성년의 날 1 세 동기 N2 동물을 성장 하 고 신선한 NGM 접시에 그들을 수확 하 여 그들을 전송 (총 N = 50 또는 N = 트 레 당 100 동물 atment 그룹)입니다.
   2. 24 시간 복구의 새로운 NGM 번호판 인구 전송 후 다음 위의 꼬마 체와 프로토콜 (단계 1.2 참조) 하 고 성공적으로 전송 된 동물의 수를 계산.
   3. 100 (%)을 곱한 전송의 시작 부분에 시작 번호에 비해 전송 하는 동물의 수의 비로 백분율 수확량을 계산 합니다.
4. Healthspan 분석 실험
   참고: 일 2, 4, 6, 및 8 나이 동기화 N2 동물 25 ° c.에 유지에 대 한 성인 기의 운동 성 클래스, 인 두 펌프 속도 및 모두는 앞쪽 및 후부 부드러운 터치 응답의 healthspan 매개 변수를 점수
   1. 추적 운동
      1. 클래스를 기반으로 시스템 (A, B 및 C 클래스)에 따라 운동 성 점수를 할당 Herndon 외 의 방법에 따라 ¹⁸. 통계 분석 소프트웨어에는 서 수 물류 통계 모델을 사용 하 여 세 가지 실험 그룹의 효과 비교.
         참고: 클래스 A 개인 일반, 정현파 패턴에서 자연스럽 게 이동합니다. 클래스 B 개인 현저 하 게 비 정현파 움직임에 이동 하 고 장려 운동 괴롭히는 필요할 수 있습니다. 클래스 C 개인 괴롭히는에 그들의 머리 또는 꼬리를 이동 하지만 agar 가로질러 이동할 수 없습니다.
   2. 인 두 펌프 속도
      1. 1 분에 대 한 최종 배율 X 600 stereomicroscope에서 시각적으로 동물의 터미널 인 두 전구의 분쇄기 움직임을 계산 합니다.
      2. Α와 일방통행 ANOVA와 통계 분석 = 0.05, Bonferroni 후 테스트 α = 0.05.
   3. 터치 응답
      1. 부드러운 터치 응답을 기록 하 고 3 개의 치료 그룹 사이 비교. Calixto 연구진이 설명 하는 방법에 따라 분석 실험을 수행 ¹⁹.
      2. 레코드는 앞쪽 및 후부 부드럽게 쓰 다듬어 속눈썹 선택 수직 꼬리 또는 동물의 머리 (5 x, 번갈아가 며 머리와 꼬리) 하 여 응답을 터치 합니다.
      3. 앞쪽 및 후부 응답에 대 한 0 ~ 5의 규모에 1 점으로 선의 반대 방향으로 움직임을 점수.
      4. Α와 일방통행 ANOVA와 통계 분석 = 0.05, Bonferroni 후 테스트 α = 0.05.
5. 통치 분석 결과
   1. 25 ° c.에 성년의 날 2에 나이 동기 N2 동물 복제에 꼬마 체의 영향의 사용을 확인 하려면 성장
   2. 달걀 누워 후 60 h 플래티넘 선택 또는 꼬마 체 새로운 NGM 번호판 동물을 전송 하 고 그들 복구에 4 h (20-30 분에 대 한 체질된 접시 건조).
   3. 복구, 개별적으로 접시 속눈썹 통해 동물 NGM 번호판 선택 후 그들에 게 산란, 24 h 하 고 동물을 제거 합니다. 또 다른 24 h에 대 한 25 ° C에서 표준 상태 하에서 개발을 각 접시에 자손을 허용 합니다.
      참고: 속눈썹 선택은 인간의 속눈썹 매니큐어와 파스퇴르 피 펫의 끝을 확보 하 고 에탄올으로 소독.
   4. 실행 가능한 F1 세대 개인의 수를 계산 합니다. Α와 T-검정을 사용 하 여 통계 분석을 수행 = 0.05.
      참고: 가능한 자손 계란 성공적으로 해치 고 일반 애벌레 사이클을 통해 그들의 개발을 시작 하는 것으로 간주 됩니다.
6. 형광 기자 스트레스 응답 분석 실험
   1. 스트레스의 잠재적인 마커를 감지 하 세 가지 일반적으로 사용 되는 형광 기자 분석 수행: 스트레인 [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]²⁰; 세포의 핵에 DAF 16::GFP 전 hsp-16.2 식 [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]²¹; 그리고 잔디-3 식 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]²².
   2. 각 분석 결과 대 한 문화 20 ° C에서 3 개의 치료 그룹에서 나이 동기 동물 및 성년의 날 3에 그들을 검토: 부정적인 제어를 사용 하 여 (매일, 수동으로 백 금 선택과 동물의 그룹 전송), (매일에 긍정적인 통제 백 금 선택 플러스 설립된 스트레스와 수동으로 동물의 그룹 전송), 그리고 꼬마 체 (체 동물을 통과 하 고 이미징 직전 NGM에 30 분 동안 복구 하도록 허용).
   3. DAF 16::GFP 분석 결과에서 열 충격을 30 분 동안 37 ° C에서 긍정적인 제어 동물²⁰이미징 하기 전에. Hsp-16.2 분석 결과 대 한 열 충격 90 분,²¹이미징 하기 전에 20 h 긍정적인 제어 동물. Sod-3 분석 결과 대 한 이미징²²전에 4 h 100 m m 파라콰트와 긍정적인 제어 동물을 취급 합니다.
   4. 속눈썹 선택으로 즉시 벌레를 수확 하 고 벌레를 무력화 하는 36% poloxamer 407 계면 활성 솔루션의 1 μ와 coverslip에 탑재.
   5. 다른 coverslip로 탑재 된 웜 샌드위치 표준 유리 현미경 슬라이드 및 이미지를 두 개의 coverslips 벌레는 거꾸로 형광 현미경 (80 X의 전반적인 확대)에 8 배 확대와 지속적인 노출 FITC 필터를 사용 하 여 탑재 합니다.
   6. DAF 16::GFP 분석 결과에서 세 그룹 간의 차이 감지, DAF 16::GFP 기자 (핵 기자 기자 cytosol, 그리고 중간에 있는 cytosolic 핵을 translocated 경우의 위치에 따라 동물 분류 기자 핵 그리고 cytosol에 위치한).
   7. 통계 분석 소프트웨어에는 서 수 물류 통계 모델을 사용 하 여 결과 비교 합니다. Hsp-16.2 및 잔디-3 식 분석 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 α와 = 0.05와 Tukey의 임시 게시물 테스트 α = 0.05 머리 영역의 총 형광 비교 하.

결과

꼬마 체 이루어져 있다 2 나사 모자, 짠된 나일론 monofilament 메쉬 간단한 세척 기술을 사용 하 여 생물의 라이브 인구를 추출 하는 데 사용, 원하는 개발 시대의 몸 직경 보다 작은 영역을 확보. 그것은 표준 원뿔 관에 부착 하 고 메쉬 스크린을 사용 하 여 기계적으로 동물 몸 직경, 튜브에 추가 유지 관리 및 실험 (예를 들어, 전송 또는 유전 수확)에 대 한 준비?...

토론

여기, 우리 디자인 및 정렬 및 선 충 C.유지를 위한 도구로 서, 효과적인 꼬마 체의 사용을 소개 했다. 이 도구는 수동으로 개별 동물, 인구, 화학 치료 (예를 들어, FUDR), 그리고 더 비싼 방법 분리 동물의 세척을 따기 위해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 꼬마 체 효율적이 고 신속 하 게 (20 분 미만) 동물 (표 2)의 큰 혼합된 인구에서 자손을 정렬. 또한, 도구를 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Safety glasses	Uline	S-21076
Protective heat resistant glove	Grainger	Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703
50 mL conical tube	Falcon	14-432-22
Synthetic Nylon mesh	Dynamic Aqua-Supply Ltd	NTX20 and NTX50
Cyanoacrylate glue	Scotch Super Glue Liquid	SAD114
Pliers	Vampliers	VMPVT-001-8
Dremmel tool with circular file	Lowe's	Item # 525945 Model # 100-LG
FUDR	Sigma	F0503
M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)	Sigma	S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506
NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)	BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)	BD bioscience 211677, Lab Express 1001,  Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Paraquat dichloride hydrate	Sigma	36541
Inverted fluorescence microscope	Olympus	FSX100