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요약

여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

초록

포유류 피 질 흥분 성의 억제 신경, 각각 특정 electrophysiological 및 생 화 확 적인 속성, 시 냅 스 연결의 많은 종류의 구성 그리고 vivo에서 기능, 하지만 그들의 기본 기능과 해 부 조직 세포에서 네트워크 규모를 제대로 이해 하 고 있습니다. 여기 우리는 대뇌 피 질의 세포 조직의 조사에 대 한 두뇌의 큰 영역에 걸쳐 붙일 표시 된 신경 세포의 3 차원 영상에 대 한 메서드를 설명합니다. 특정 유형의 신경 형광 퇴행 성 신경 추적기의 주입 또는 유전자 변형 쥐에 형광 단백질의 식에 의해 표시 됩니다. 블록 뇌 샘플, 예, 반구, 고정 후 준비, 청소 방법, 조직으로 투명 하 게 만들 있으며 형광 immunolabeling는 특정 종류의 세포를 받게. 큰 지역 대형 작업 거리 목표 및 자동화 한 단계 또는 두 광자 공초점 현미경을 사용 하 여 검색 합니다. 이 메서드는 마우스 피 질에는 셀 형식 관련 microcolumn 기능 모듈의 주기적인 조직을 해결할 수 있습니다. 절차는 다른 복잡 한 조직과 다양 한 뇌 영역에 3 차원 세포 구조의 연구에 대 한 유용할 수 있습니다.

서문

포유류 피 질 세포 유형, 각각 특정 유전자 표현 패턴, electrophysiological 및 생 화 확 적인 속성, 시 냅 스 연결의 많은 수의 구성 및 기능을 vivo에서 1,2 3,,45,,67. 이러한 세포 유형 반복 구조로 구성 됩니다 여부 되었습니다 분명. 시각적인 방향 열과 somatosensory 배럴을 포함 하 여 대뇌 피 질의 열 구조, 반복 하지만 그들의 세포 조직 남아 불분명8,9. 이들은 특정 대뇌 피 질의 영역에 존재 하 고 뇌 전체 시스템을 않습니다.

Neocortical 계층 5, 뉴런의 대다수는 4 개의 주요 유형으로 분류 됩니다. 주요 유형의 하위 대뇌 프로젝션 뉴런 흥분 성의 뉴런 프로젝트 폰, 척수, 및 우량한 colliculus 바꾸어 대상에 축 삭 그리고, 따라서,10주요 외피 출력 경로 나타냅니다. 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런 흥분 성의 뉴런의 다른 주요 유형10피 질 자극. 금지 신경 또한 두 개의 주요 클래스를 포함: parvalbumin 표현 및 somatostatin 표현 세포11.

최근 분석 나타냅니다 4 셀 유형 반복된 구조12,,1314로 구성 됩니다. 하위 대뇌 프로젝션 뉴런12,,1314 및 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런14 직경 1-2 셀의 셀 타입 특정 microcolumns로 구성. Parvalbumin 표현 및 somatostatin 표현 셀 정렬 하위 대뇌 프로젝션 뉴런의 microcolumns로 아니라 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런14microcolumns. Microcolumns 스스로 형태는 6 각형 격자 배열14 와 마우스 뇌12,14 와 언어 somatosensory, 시각과 모터 분야를 포함 한 여러 피 질 지역에 있는지를 주기적으로 정렬 인간의 뇌는13의 지역입니다. 개별 microcolumn에 신경 동기화 된 활동을 전시 하 고 비슷한 감각 반응이14. 이러한 관측 레이어 5 셀 유형 반복 기능 모듈의 첫 번째 알려진된 뇌 전체 조직을 나타내는 microcolumn 격자 구조로 구성 나타냅니다.

Microcolumns 약 10 µ m의 반지름을가지고 있고 약 40 µ m의 공간 주기. 또한, microcolumns의 방향을 피14에서 그들의 위치에 따라 그들의 변화와 꼭대기 dendrites 평행 하다. 따라서, microcolumn 시스템은 마이크로 미터의 몇 수만의 전형적인 두께가 기존의 대뇌 피 질의 조각을 사용 하 여 분석 하기가 어렵습니다. 또한, 주기 분석 3 차원 데이터는 다양 한 뇌 영역, 그리고, 그러므로, confocal 현미경 검사 법의 일반적인 이미징 영역에서에서 또는 vivo에서 2 광자 영상 너무 좁고입니다.

최근, 기술 두꺼운 조직15,16를 개발 되었습니다. 여기는 microcolumn 시스템을 구성 하는 주요 셀 형식 마우스 neocortical 레이어 5에서에서의 대규모, 3 차원 이미지를 얻기 위해 이러한 방법을 응용 프로그램에 설명 합니다. Subcerebral 프로젝션 뉴런 역행 표시 또는 Crym egfp 유전자 변형 쥐12, 그리고 대뇌 피 질의 프로젝션 뉴런에는 레이블로 역행에 향상 된 녹색 형광 단백질의 식으로 표시 됩니다. 라벨 또는 Tlx3-cre/Ai9 마우스17에 tdTomato 식으로. Parvalbumin 표현 및 somatostatin 표현 셀 immunohistochemistry에 의해 표시 됩니다. (깊은 뇌 참조) SeeDB 방법19 다른 실험 사용 된다 실험, 얼룩이 지는 항 체 (항 체 규모 S) AbScale 방법18 사용 됩니다. 이러한 방법은 기존의 이미징 방법의 위에서 언급 한 어려움을 극복 하 고 레이어 514의 정확한 세포 조직 공개.

프로토콜

모든 실험 절차 RIKEN와 코 동물 실험 위원회 RIKEN 유전자 재조합 실험 안전 위원회에 의해 승인 되었고 RIKEN 뇌 과학의 동물 시설 기관 지침에 따라 수행 연구소입니다.

1입니다. 이미징 챔버의 준비

  1. 영상 실19
    1. 실리콘 고무 시트를 사용 하 여 다양 한 두께의 약 5 m m와 바닥 플레이트의 두께 챔버를 준비 합니다. 또한, 접시와 유리 하단 (그림 1A) 없이 준비 합니다.
  2. 스페이서를 슬라이스
    1. 스페이서 두께 0.5 m m (그림 1C)의 실리콘 고무 시트를 사용 하 여 샘플을 준비 합니다.

2. 추적 프로그램 삽입

참고: 폰 (2.1) 또는 우량한 colliculus (2.2)에 주사를 합니다. 우량한 colliculus에 주입 하는 동안 시각 및 모터 지역 등 다양 한 뇌 영역에 폰 레이블 하위 대뇌 프로젝션 뉴런에 주입 시각적 영역에 하위 대뇌 프로젝션 뉴런 라벨. 붙일 레이블 콜레라 독 소 단위 B. 대신 식 염 수 주입 제어 실험에 대 한 멸 균 상태 유지에 대 한 소독된 장비 및 에탄올으로 청소 플라스틱 장갑을 사용 합니다.

  1. 성인 쥐의 주사는 폰으로 확인 합니다.
    1. 붙일 레이블 콜레라 독 소 단위 B의 1 µ L를 그리기 (25 µ g / µ L PBS에) 26 G 해밀턴 주사기로.
    2. 주사기에는 인젝터 펌프를 배치 합니다.
    3. Stereotaxic 악기에 퓰 레이 터의 도구 홀더에 주사기와 펌프를 배치 합니다. 조작자 12 ° 수직 축에서 뒤로 기울입니다.
    4. Intraperitoneally 나트륨 pentobarbital을 주입 하 여 남성 또는 여성 성인 마우스 (C57BL/6J 또는 Tlx3-cre/Ai9) anesthetize (60 밀리 그램/kg 체중) 또는 isoflurane (2-3%)을 투여 하 여. 마우스 마우스 완전히 취 나타내는 집게와 꼬리 슬쩍가 때 응답 하 게 될 때까지 기다립니다.
    5. Stereotaxic 악기에 마우스를 놓습니다.
    6. 감염 방지 및 bregma 및 람다 표시 되도록 두 피의 10 m m를 잘라 면도날을 사용 하 여 머리를 조심 스럽게 제거. 1 %lidocaine 피 펫을 사용 하 여 0.1 mL를 관리 합니다. 있도록 bregma 및 람다 동일한 z 레벨 stereotaxic 악기에 떠 벌이의 수직 위치를 조정 하 여 머리의 각도 설정 합니다.
    7. 주사기의 팁은 bregma 가까이 stereotaxic 악기에 슬라이딩 하 여 조작자의 위치를 조정 하 고 조작자의 위치를 기록 합니다. 조작자에 도구 홀더를 이동 하 여 주사기를 철회.
    8. 조작자 이동 5.4 m m 뒤로 및 0.4 m m 옆. 팁은 두개골에 진입점 가까이 있도록 주사기를 사전. 주사기를 철회 하 고 진입점을 표시 합니다.
    9. 표시 된 위치에서 약 1 m m의 직경을 가진 구멍을 드릴 합니다.
    10. 팁 깊이 6.9 m m 보다는 bregma에 측정 하는 구멍을 통해 주사기 끝을 삽입.
    11. 추적기는 펌프를 사용 하 여 0.2 µ L/분의 1 µ L을 주입.
    12. 두뇌에서 주사기를 제거 합니다.
    13. 필요한 경우 microfibrillar hemostat 및 인스턴트 접착제의 작은 파편으로 노출 된 뇌를 커버.
    14. 감염을 방지 하 고 두 피를 봉합 하는 피 펫 제공 하는 염 분을 사용 하 여 노출 된 뇌를 씻어.
    15. Stereotaxic 악기에서 마우스를 제거 합니다. 일반적으로 1 시간에 30 ˚C에 인큐베이터에 마 취에서 회복 하기 위해 마우스를 허용 합니다. 두지 마십시오 마우스 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지. 완전히 복구 되었습니다 후에 다른 동물의 회사를 마우스를 반환 합니다.
    16. 3-7 일에 대 한 마우스를 유지.
  2. 성인 쥐의 우량한 colliculus에 주사를 확인 합니다.
    1. 팁 직경 30-50 µ m의 유리 피 펫을 준비 합니다.
    2. 플라스틱 튜브 (그림 2A)를 통해 해밀턴 주사기를 유리 피 펫을 연결 합니다.
    3. 파라핀 액체 유리 피 펫, 플라스틱 튜브, 그리고 해밀턴 주사기를 채우십시오.
    4. 주사기에는 인젝터 펌프를 배치 합니다.
    5. 조작자에 유리 피 펫을 놓고 조작 수직 축 (그림 2B)에서 뒤로 60 ° 기울기.
    6. 2.1.4–2.1.9을 수행 합니다. 조작자의 위치는 1.4 m m 후부, 람다를 0.5 m m 옆.
    7. 두개골에 작은 플라스틱 파라핀 영화 장소 다음 그것에 추적 솔루션의 약 1 µ L를 넣어. 신속 하 게 사전 유리 피 펫 및 추적 솔루션의 적어도 0.5 µ L로 그것을 채우십시오.
    8. 팁 깊이 뇌 표면에서 3.0 m m 유리 피 펫을 삽입 합니다.
    9. 추적기는 펌프를 사용 하 여 0.2 µ L/분의 0.5 µ L을 주입.
    10. 두뇌에서 유리 피 펫을 제거 합니다.
    11. 2.1.13–2.1.16을 수행 합니다.

3. 고정 및 트리밍

  1. Sodium pentobarbital (60 밀리 그램/kg 체중) 마우스 (C57BL/6J 또는 Tlx3-cre/Ai9, 또는 2 단계에서 설명한 대로 추적 프로그램 주입 없이 intraperitoneally 주입. 마우스 마우스 완전히 취 나타내는 집게와 꼬리 슬쩍가 때 응답 하 게 될 때까지 기다립니다.
  2. 0.9% 식 염 수와 마우스 transcardially20 perfusing에 의해 마우스를 고통 없이 안락사.
  3. Perfusing 여 마우스20 수정 4 %paraformaldehyde (PFA) 0.1 M 인산 버퍼 (pH 7.5).
  4. 설명된20으로 두개골 폭로 위를 사용 하 여 두 피를 잘라.
    1. 가 위를 사용 하 여 노출 된 두개골의 중간을 잘라. 집게를 사용 하 여 두개골을 제거 합니다.
    2. 람다와 bregma의 위치를 표시 하는 것이 필요한 경우 먼저 두개골의 한 반구를 제거 합니다. 뇌에 남아 있는 두개골에 람다와 bregma의 위치에 두뇌에 얇은 텅스텐 바늘을 삽입 한 다음 나머지 해골을 제거.
      참고: 뇌 수에 저장 PBS 4 ˚C에서.
  5. 항 체 억제 뉴런의 얼룩을 수행 하려면 두뇌 샘플 조각으로 잘라.
    1. 장소는 vibratome에 뇌 샘플입니다.
    2. 실 온에서 PBS에 두께가 500 µ m까지 조각을 삭감 하 고 단계 5 (AbScale 방법)를 진행.
  6. 항 체 얼룩이 필요 하지 않은 경우, 트림 뇌 샘플을 차단 (최대 3 밀리미터 두꺼운) 면도날 (그림 3)를 사용 하 여 및 단계 4 (SeeDB 메서드)를 수행 하십시오.
    참고: 두뇌 저장할 수 있습니다 PBS에 4 ° C에서 절단 또는 트리밍 후. SeeDB 메서드를 사용 하면 항 체 염색 법은 불필요 한 때 AbScale 방법 보다 적은 시간을 요구 하기 때문에 하는 것이 좋습니다.

4. 항 체 (SeeDB 메서드)를 얼룩 없이 지우기

  1. 포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 20% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 4 h에 품 어.
  2. 포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 40% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 4 h에 품 어.
  3. 포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 60% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 4 h에 품 어.
  4. 포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 80% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 12 h에 품 어.
  5. 포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 100% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 12 h에 품 어.
  6. 포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 80.2% (w/w)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 24 h에 대 한 그것을 품 어.
    참고: 샘플 변형 가능한 작게 유지을 신중 하 게 처리 합니다. 샘플 신속 하 게 불투명 될 수 있는 이상, 샘플을 품 어 하지 마십시오.
  7. 80.2%과 당 솔루션 (그림 1B)으로 가득 이미징 약 실에 샘플을 포함 합니다. 필요한 경우 주변 고무 접착제의 작은 조각을 넣어 샘플을 수정. 챔버 너무 깊은 경우 샘플을 배치 하기 전에 챔버에는 바닥에 접시를 넣어.
  8. 이미징 챔버에 유리 커버와 함께 페 트리 접시를 놓고 접시, 물 침수 긴 작동 거리 목표와 또는 2 광자 공초점 현미경을 사용 하 여 이미지에 물을 넣어. 여기 파장 및 방출 필터 표 1에서 설명 합니다. 필요한 경우, 전동된 스테이지를 사용 합니다.

5. 항 체 (AbScale 방법) 얼룩을 지우기

  1. 표 2에 설명 된 대로 시 약을 준비 합니다.
  2. Sca/eS0 솔루션의 4 mL를 포함 하는 5 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 분할 영역을 전송 하 고 37 ° C (그림 4B)에서 부드러운 떨고와 12 h에 대 한 그들을 품 어.
  3. 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 Sca/eA2 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 36 h에 대 한 슬라이스를 품 어
  4. 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 및 Sca/eB4 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 24 h에 대 한 슬라이스를 품 어
  5. 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 Sca/eA2 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 12 h에 대 한 슬라이스를 품 어
  6. 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 추가 4 mL PBS의 실 온에서 부드러운 떨고와 6 h에 대 한 슬라이스를 품 어.
  7. 조심 스럽게 제거 주걱을 사용 하 여 2 mL 플라스틱 튜브에 조각.
  8. AbScale 솔루션 부드러운 떨고와 37 ° C (그림 4C)에서 48-72 시간의 1 mL에 1 차 항 체 (표 3)와 품 어.
  9. 조심 스럽게 제거 주걱을 사용 하 여 5 mL 플라스틱 튜브에 조각.
  10. AbScale 솔루션 2 번 부드러운 진동으로 실 온에서 2 h 4 mL에 품 어.
  11. 조심 스럽게 제거 주걱을 사용 하 여 2 mL 플라스틱 튜브에 조각.
  12. 붙일 표시 2 차 항 체 (테이블의 자료, 1: 100) AbScale 솔루션 부드러운 떨고와 37 ° C에서 48 h의 1 mL에 함께 품 어.
  13. 조심 스럽게 AbScale 솔루션의 4 mL를 포함 하는 5 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 분할 영역을 제거 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 6 h에 대 한 슬라이스를 품 어.
  14. 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 AbScale 솔루션의 4 개 mL를 추가 2 h 2 시간 실 온에서 부드러운 흔들어 대 한 슬라이스를 품 어.
  15. 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 4%의 4 개 mL를 추가 PFA 고 실 온에서 부드러운 동요와 1 시간에 대 한 슬라이스를 품 어.
  16. 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 추가 4 mL PBS의 실 온에서 부드러운 동요와 1 시간에 대 한 슬라이스를 품 어.
  17. 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 Sca/e s 4 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 12 h에 대 한 슬라이스를 품 어
  18. 유리 슬라이드에는 스페이서를 배치 하 고 슬라이스는 공백에 놓고 Sca/e s 4 솔루션 분할 영역을 담가. 커버 유리 (그림 1D)와 공백 인감.
  19. 커버 글라스와 물 침수 긴 작동 거리 목표와 또는 2 광자 공초점 현미경을 사용 하 여 이미지에 물을 넣어. 필요한 경우, 전동된 스테이지를 사용 합니다.
    참고: 중요 한 라벨 바이어스의 부재를 확인 표면 부분에는 샘플의 깊은 부분 마찬가지로 표시 여부를 확인 하십시오.
    참고: 테스트 항 체의 침투는 표 3에 설명 되어 있습니다.

6. 셀 위치 결정

  1. 스캔된 된 이미지에서 각 위치에 대 한 3 차원 이미지 필터14 (그림 5A-5D)를 사용 하 여 상관 관계 값을 계산 합니다.
  2. 상관 관계 값 (그림 5D)의 봉우리의 위치를 결정 합니다.
  3. 찾을 셀 (그림 5E) 봉우리 이미지 조사.

결과

우리 /Ai9 유전자 변형 마우스 Tlx3-cre에 tdTomato의 식으로 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런을 표시 하 고 하위 대뇌 프로젝션 뉴런은 폰으로 역행 추적 프로그램 CTB488를 주입 하 여 시각. 두뇌의 왼쪽된 반구 SeeDB 메서드를 복종 되었다 및 물 침수 긴 작동 거리 목표를 갖춘 2 광자 현미경을 사용 하 여 스캔 (25 X, N.A. 1.1 작동 거리 2 m m)와 전동된 스테이지. 401 이미지의 ?...

토론

우리는 마우스 neocortical 레이어 5에에서 주요 세포 유형의 셀 형식 관련 조직의 대규모 3 차원 이미지를 얻기 위해 절차를 제시. 기존의 조각 얼룩에 비해, 메서드는 결정 하는 피 질의 3 차원 조직에 더 유용 합니다. 메서드를 사용 하는 더 넓은에서 이미지 수집 그리고 깊은 두뇌 지구 2 광자 현미경 전형적인 vivo에서 또는 전통적인 confocal 현미경 검사 법에 비해, 따라서 neocortical 휴대의 포괄...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

우리 감사 미 야와 키 아츠 시와 히로시 하 마 원고, 편집에 대 한 찰스 요코야마 AbScale 실험에 그들의 조언을 에리코 Ohshima 및 그들의 기술 지원에 대 한 미유키 Kishino. 이 작품은 과학적 연구에서 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 (MEXT) 일본의 남에 대 한 남 및 연구비 RIKEN에서 연구 자금에 의해 지원 되었다 (혁신적인 지역 "생체 Neurocircuitry"; 22115004)와 S.S. (25890023)입니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Crym-egfp transgenic miceMMRRC012003-UCD
Tlx3-cre transgenic miceMMRRC36547-UCD
ROSA-CAG-flox-tdTomato miceJackson LaboratoryJAX #7909
Silicone rubber sheetAS ONE6-611-010.5 mm thickness
Silicone rubber sheetAS ONE6-611-021.0 mm thickness
Silicone rubber sheetAS ONE6-611-053.0 mm thickness
Petri dishesFalcon351008
Cover glassMatsunamiC022241
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugateInvitrogenC22841
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugateInvitrogenC22843
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugateInvitrogenC22842
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugateInvitrogenC34778
26 G Hamilton syringeHamilton701N
Injector pumpKD ScientificKDS 310Pons injection
Injector pumpKD ScientificKDS 100Superior colliculus injection
ManipulatorNarishigeSM-15
Sodium pentobarbitalKyoritsu SeiyakuSomnopentyl
IsofluranePfizer
LidocaineAstraZenecaXylocaine injection 1% with epinephrine
DrillToyo AssociatesHP-200
Avitene microfibrillar hemostatDavol Inc1010090
AlonalfaDaiichi-SankyoAlonalpha A
Surgical silkEthiconK881H
IncubatorUVPHB-1000 Hybridizer
Glass pipetteDrummond Scientific Company2-000-075
Electrode pullerSutter Instrument CompanyP-97
Paraffin Liquid, lightNacalai tesque26132-35
SalineOtsuka1326
ParaformaldehydeNacalai tesque26126-54
Tungsten needleInter medicalΦ0.1 *L200 mm
VibratomeLeicaVT1000S
50 mL plastic tubeFalcon352070
α-thioglycerolNacalai tesque33709-62
D(-) FructoseNacalai tesque16315-55
BluTackBostikCKBT-450000
Two-photon microscopeNikonA1RMP
Water-immersion long working distance objectivesNikonCFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm
Water-immersion long working distance objectivesNikonCFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm
Motorized stageCOMSPT100C-50XY
FilterSemrockFF01-492/SP-25
FilterSemrockFF03-525/50-25
FilterSemrockFF03-575/25-25
FilterSemrockFF01-629/56
FilterChromaD605/55m
5 mL plastic tubeAS ONEVIO-5B
2 mL plastic tubeEppendorf 0030120094
UreaNacalai tesque35905-35
Triton X-100Nacalai tesque35501-15
GlyserolSigma-aldrich191612
D(-)-sorbitolWako191-14735
Methyl-β-cyclodextrinTokyo chemical industryM1356
γ-CyclodextrinWako037-10643
N-acetyl-L-hydroxyprolineSkin Essential Actives33996-33-7
DMSONacalai tesque13445-45
Bovine Serum AlbuminSigma-aldrichA7906
Tween-20 (1.1 g/mL)Nacalai tesque35624-15
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555InvitrogenA21422
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555InvitrogenA21428
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA21235
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA11029
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA21206
Confocal microscopeOlympusFV1000
Water-immersion long working distance objectivesOlympusXLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm
Anti-NeuNMilliporeMAB377
Anti-NeuNMilliporeABN78
Anti-CTIP2Abcamab18465
Anti-Statb2Abcamab51502
Anti-GAD67MilliporeMAB5406
Anti-GABASigmaA2052
Anti-ParvalbuminSwant235
Anti-ParvalbuminFrontier InstitutePV-Go-Af460
Anti-ParvalbuminSigmaP3088
Anti-ParvalbuminAbcamab11427
Anti-SomatostatinPeninsula LaboratoriesT-4103
Anti-c-FosCalbioChemPC38

참고문헌

  1. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  2. Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
  3. Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), aac9462 (2015).
  4. Sorensen, S. A., et al. Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity. Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).
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