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요약

여기, 선물이 분리 하 고 특성 구조, 후 각 힘, 및 바다 lampreys의 상 상속 페로몬 화합물의 행동 응답 프로토콜.

초록

검정 안내 분별 분리와 활성 페로몬 화합물의 식별 가이드 생리 및 행동 생물 검정의 결과 사용 하는 반복적인 접근 방식을입니다. 이 방법은 다양 한 동물 종에에서 페로몬으로 그 기능 화학 신호의 성공적인 특성에 결과 있다. 바다 lampreys 행동 또는 생리 적인 응답을 중재 하는 페로몬을 감지 하는 후각이에 의존 합니다. 우리 상 상속 페로몬의 기능을 멋 부리 다 하 고 절연 및 활성 페로몬 구성 요소 식별 가이드 물고기 생물학의이 지식을 사용 합니다. 크로마토그래피는 추출, 집중, 바른된 물에서 화합물을 분리 하는 데 사용 됩니다. 전기-olfactogram (EOG) 녹음 어떤 분수 유도 후 각 응답을 결정 하기 위해 수행 됩니다. 2 선택 미로 행동 분석 다음 경우 향기가 있는 분수의 또한 행동 활성화 되며 특혜를 유도 결정 하는 데 사용 됩니다. Spectrometric 및 광 메서드는 분자량 및 구조 설명 지원 구조 정보를 제공 합니다. 순수한 화합물의 bioactivity EOG 및 행동 분석 실험으로 확인 된다. 미로에서 관찰 된 행동 응답 궁극적으로 자연 스트림 환경에서 그들의 기능을 확인 하는 필드에에서 확인 되어야 합니다. 이러한 생물 검정 1) 분류 과정을 안내 하 고 2) 확인을 이중 역할 추가 격리 된 구성 요소 bioactivity를 정의 하 고. 여기, 우리는 검정 기반 분류 방식의 유틸리티를 예증 해 심고 페로몬 식별의 대표적인 결과 보고 합니다. 식별 해 심고 페로몬의 페로몬 통신 시스템의 변조 침략 바다 심고 Laurentian 오대호에서 제어 하는 것으로 간주 하는 옵션 중 하나입니다 있기 때문에 특히 중요 하다. 이 메서드는 taxa의 광범위 한 배열에서 화학 커뮤니케이션 특성 및 waterborne 화학 생태학에 쉽게 적응 될 수 있다.

서문

페로몬은 특정 화학 신호 음식 소스를 찾는, 포식 자 감지 conspecifics1의 사회적 상호 작용을 중재에 그들을 원조 하는 개인에 의해 발표. 곤충에 페로몬 통신이 되었습니다 잘 공부2; 그러나, 화학 물질 식별 및 수생 척추 동물 페로몬의 생물 학적 기능 하지 되었습니다 공부 했다으로 광범위 하 게. 정체성의 지식과 발표 페로몬의 기능 위협된 종3,4 또는 제어 해충 종5,6의 복구를 촉진 하기 위하여 적용할 수 있습니다. 이러한 기술의 응용 프로그램 격리 및 생리 활성 페로몬 구성 요소 특성화를 필요로합니다.

페로몬 식별 천연 제품 화학의 지점 이다. 페로몬 연구에 진행 부분적으로 페로몬 분자 자체의 특성으로 인해 제한 되었습니다. 페로몬은 종종 불안정 하 고 소량, 출시 그리고 몇 가지 샘플링 기술을 분 양의 휘발성7,8 또는 수용 성 화합물9를 감지 하 존재. 페로몬을 식별 하는 방법 1) 알려진된 화합물, 2) 대사체학, 및 3) 검정 안내 분별의 대상된 심사를 포함 합니다. 알려진된 화합물의 대상된 심사 페로몬 기능을 가상 하는 생리 적 프로세스의 상용 대사 부산물을 테스트 합니다. 연구원은 알려진 및 사용 가능한 화합물 테스트할 수 있기 때문에이 접근은 제한 하 고 있다. 그러나, 그것은 결과가 금붕어에 성 호르몬의 성공적인 식별 기능을 페로몬10,,1112. 대사체학은 생물 학적 시스템13내에서 잠재적인 작은 분자 대사 제품을 구별 하는 두 번째 페로몬 식별 접근 이다. 두 그룹 (즉,는 활성 및 비활성 추출 물)의 신진 대사 프로필의 비교 수는 잠재적인 신진 대사 프로필의 식별 하는 대사 산물은 정화에서 구조는 해명, 그리고 bioactivity는 확인 된14. 특정 혼합물의 복잡 한 공식의 첨가제 또는 시너지 효과 대사체학 metabolites 분수13의 시리즈로이 아닌 함께 간주 됩니다 때문에 발견 될 더 높습니다. 그러나, 대사체학의 구현 결과 데이터 소설 구조의 설명을 촉진 하지 않습니다 때문에 합성 참조의 가용성에 의존 합니다.

검정 안내 분별은 두 분야에 걸쳐 통합, 반복 접근: 화학 및 생물학. 이 방법은 생리 및 행동 생물 검정의 결과 사용 하 여 격리 및 활성 페로몬 화합물의 식별 가이드. 원유 추출 화학 속성 (즉, 분자 크기, 극성, 등)에 의해 분류 한 이며 전기-olfactogram (EOG) 녹음 및는 생물 검정에 테스트. 생리 활성 구성 요소 분류 및 EOGs 생물 검정의이 단계를 반복 하 여 밖으로 상영 됩니다. 순수한 활성 화합물의 구조는 분자량 및 합성 화합물의 템플릿을 생산 구조 정보 제공 spectrometric 및 분 광 방법으로 해명. 생물 검정 기반 분류 다양 한 대사와 생 합성 경로에서 예측 될 것 하지 않은 독특한 화학 뼈대와 잠재적으로 소설 페로몬을 얻을 수 있습니다.

여기, 우리는 분리 남성 바다 심고 섹스 페로몬 화합물의 bioactivity 특성을 사용 하는 검정 기반 분류 프로토콜을 설명 합니다. 바다 심고 (Petromyzon 리누스)이이 물고기는 그들의 anadromous 생활사는 3 단계로 구성 된 중재 화학 신호의 후 각 탐지에 크게 의존 하기 때문에 페로몬 커뮤니케이션을 공부 하는 이상적인 척추 모델은: 애벌레, 청소년, 그리고 성인입니다. 바다 심고 애벌레 민물 스트림 앙금으로 뚫으, 과감 한 변 태를 받아야 하 고 호수 또는 바다 어디 그들은 큰 호스트 물고기 parasitize 이주 청소년으로 변환. 호스트 물고기에서 분리 후 성인 마이그레이션할 다시 산란 스트림, 스트림 상주 애벌레15,,1617,18,19 발표 철새 페로몬에 의해 유도 . 성숙한 남성 산란 지상에 승천, 동료를 유치, 약 일주일 동안 간헐적으로 산란 다음 죽을15,20을 다 성분 섹스 페로몬을 릴리스 합니다. 식별 해 심고 페로몬의 페로몬 통신 시스템의 변조 Laurentian 오대호21에서 침략 적 바다 lampreys 제어 하는 것으로 간주 하는 옵션 중 하나입니다 있기 때문에 중요 하다.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 미시간 주립 대학교 (안녕히 # 03/14-054-00, 02/17-031-00)에 의해 승인 되었습니다.

1. 수집 및 바다 심고의 추출 물 조절

  1. 성적으로 화난된 휴런 호수 물 16-18 ° c.에 유지의 250 L와 함께 제공 된 탱크에서 남성 바다 lampreys (15-30 동물)을 성숙 하는 장소
  2. 6 월에서 7 월 각 밤 내내 남성 단련 물을 수집 합니다.
    참고: 바다 lampreys 산란 후 자연스럽 게 죽는다. 물고기의 인생에서이 시점에 근접, 신선한 성숙한 남성으로 교체.
  3. 단단한 단계 적 출에 의해 조건된 물을 추출 합니다.
    1. 열에 로드 하기 전에 4 h에 대 한 메탄올에 수 지를 담근 다. 수 지는 열에 로드 한 다음 유기 용 매를 제거 하는 열을 통해 물 10 L 펌프.
    2. 열의 위쪽에 펌핑 시스템을 통해 물고기 잡고 탱크에서 조절된 물을 전달 합니다. 온건 하 게 극 지 고분자 이온 교환 수 지 (예:., Amberlite: XAD 7 HP 수 지), 4의 시리즈에 포함 된 2 kg의 침대를 통과 하는 물 2.5 L 용량 유리 열. 400와 600 mL/6 분 5 l 아세톤의 바로 뒤에 메탄올의 10 l metabolites Elute 사이의 부하 속도 유지 합니다.
      주의:이 단계에서는 메탄올과 아세톤 사용합니다. 둘 다는 가연성 및 독성입니다.
      참고: 풀링된 잔여-80 ° c 더 처리 될 때까지 저장할 수 있습니다.
  4. 물 (약 10l)로 세척 하 여 농축의 1 주 후 열을 다시 활성화.
  5. 유기 용 매 (물과 메탄올의 혼합물)을 제거 하 고 압력 감소 (아래 300 mbar) 40 ° c.에 5 h와 증발에 의해 추출 물 수확 건조까지-20 ° C에서 48 h에 대 한 동결 건조 기 동결은 여 물 찌 꺼 기를 집중.

2입니다. 크로마토그래피와 분수 풀의 격리

  1. 유리의 열 용 매 (중지)와 젤 30 분 전송에 대 한 모바일 초기 단계에서 실리 카 젤 (230-400 메쉬)을 담가. 모바일 단계를 통해 갈 수 있도록 열의 밸브를 엽니다. 침전 실리 카 젤 침대를 형성을 실리 카 젤 허용.
  2. 철저 하 게 실리 카 젤 (70-230 메쉬) 추출 물을 혼합 하 고 실리 카 젤 침대 위에 액체 착 색 인쇄기 열에 그들을 로드. 95% CHCl3 (클로 프롬)에서 그라데이션으로 elute / MeOH (메탄올) 100 %MeOH, 전체 볼륨에서 2.5 L. Eluent 개별 튜브 (각 10 ml)에 수집 합니다.
    주의:이 단계에서 사용 하는 클로 프롬은 유독한 시 약.
  3. 합동은 eluents의 20 조각으로 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) 분석에 의해 안내.
    1. 출발선에 샘플을 적용 하 고 봉인 된 유리에서 개발 용 (선택 극성 CHCl3 의 비율에 의해 메탄올 100-0%에서)에 접시의 출발선을 immersing 하 여 미리 코팅된 실리 카 젤 접시에 TLC 실험을 수행 탱크입니다.
    2. 확인 모든 TLC 명소 보존 인자 (Rf) 0.3에서 배열 하는 용 매 개발의 비율 선택-0.8.
    3. 개발 용 매에는 줄 끝에 도달 하면, 탱크, 접시를 꺼내 고 증발 하는 용 매에 대 일 분을 기다립니다.
    4. 254 nm와 다음 얼룩에 자외선 아래 관광 명소를 먼저 시각화 크로마토그래피 분무기에 의해 5 %anisaldehyde (20 μ)의 산 성 메탄올 솔루션으로 그들을 살포 하 고 3 분 85 ° C에서 난방에 의해 그들.
      참고: TLC 판에 다채로운 관광 명소는 분수에서 주요 구성 요소를 나타냅니다.
    5. 별색 및 주요 부품의 Rf 유사성에 따라 20 분수 eluent 결합.
  4. 약 30 분 동안 40 ° C에서 감압 (300 mbar의 속성에 따르면)에서 회전 증발 하 여 잔류물에 분수를 집중.

3. 전기-olfactogram (EOG) 녹음 향기가 있는 분수/화합물을 식별 하

  1. 붕 규 산 유리 모 세관을 당겨 (외경: 1.5 m m, 내경: 0.86 m m, 길이: 100 m m)는 micropipette 히터 수준으로 끌어당기는 65로 설정.
  2. 다이아몬드로 만들어진 유리 커터와 모 세관의 끝에 개통 점수 잘라내어 0.9% 식 염 수에 녹은 0.4 %agar 그것을 채우십시오. 모 세관의 끝에 여는 직경에서 약 10 µ m 이어야 한다.
  3. 채우기 단계 3.1-3.2 및 고체 전극 홀더에서 가져온된 모 세관 전극 중 3 m KCl는 micropipette를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) Ag/AgCl 펠 릿으로 조작.
    참고: 모든 공기 방울이 모 세관 또는 전극 홀더를 분리 하십시오.
  4. 가져온된 전극 전극 홀더에 삽입 합니다.
  5. 준비 하는 10-5 M의 100 mL 부피 플라스 크에 이온된 수 (4 ° C에 저장)에서 10-2 M L-아르기닌 재고 솔루션에서 숯 필터링 물에서 L-아르기닌. 10-5 M의 20 mL 전송 유리 유리병에 L-아르기닌.
  6. 농도-응답 곡선에 대 한 유리 튜브에 2.3 단계에서 분수 수영장의 10 희석의 10 mL를 준비 합니다. 매일 실험 전에 신선한 희석을 준비 하 고 하루에 내에서 그들을 사용 하 여. 온도 8 ° c.에 equilibrate를 수 있도록 반복 물 욕조에 L-아르기닌과 분수 풀 희석 작업 솔루션의 유리 튜브를 넣어
  7. Anesthetize 3 aminobenzoic 산 에틸 에스테 르 (MS222; 100 mg/L)을 심고 하 고 멸 균 주사기와 gallamine triethiodide (0.9% 식 염 수에 몸 무게의 3 mg/kg)의 근육 주사로 무력화.
    참고: 마 취의 충분 한 깊이 아니 길 모션, 직 립 자세를 유지 하는 무 능력 및 그것의 구두 디스크를 사용 하 여 탱크의 측면에 없는 흡입을 관찰 하 여 결정 됩니다. 전에, 수술 중 어떤 미생물 오염을 최소화 하기 위해 멸 균 장갑을 착용 하 고 사용 하기 전에 적어도 10 분 동안 이온된 수에 70% 에탄올 (v:)에서 해 부 도구를 만끽해 보세요.
  8. V 자형 스탠드에 마 취 심고 동양을 건조를 방지 하기 위해 젖은 종이 수건으로 그것을 포장.
    참고: 아가미 구멍을 방해 하지 않습니다.
  9. 볼 강에 MS222의 50 mg/L를 포함 하는 화난된 물 재순환의 튜브를 삽입 하 고 흐름 속도 조정할 물을 통해 지속적으로 관개 아가미 아가미 구멍 종료 됩니다 확인 합니다.
  10. 살 균 메스와 집게를 사용 하 여 [1.25 X 확대 입체 현미경 ( 재료의 표참조)]의 후 각 상피 폭로 후 각 캡슐의 표면에 피부 5mm2 섹션을 제거.
  11. 필터링 된 물 odorant 배달 튜브를 플러시 고는 micromanipulator에 탑재 하는 밸브에 연결 합니다. 하지 odorants를 관리 하는 경우 건조를 방지 하기 위해 후 각 상피에 필터링 된 물을 제공 하는 micromanipulator를 사용 하 여 후 각 상피 캐비티에 odorant 배달 모 세관 튜브를 놓습니다.
  12. 녹음 및 참조 전극은 micromanipulators에 탑재 합니다. 낮은 외부 피부는 스킨 근처에 참조 전극. 사용 하 여 입체 현미경 (1.25 X), 낮은 기록 전극 간신히 터치 후 각 상피의 표면에.
  13. 필터링 배경 물에서 10-5 M L-아르기닌 솔루션 odorant 배달 튜브의 통풍 관을 전송.
  14. 컴퓨터, 증폭기 (DC 모드로 설정), 필터, 그리고 디지타이저를 켭니다. 4 s 단일 펄스 odorant의 T1, T 4 설정 상자를 선택 하 여 관리 하는 절차를 프로그램 밸브 드라이버 소프트웨어를 사용 하 여 s 및 t 2의 상자에 확인.
  15. 데이터 수집 소프트웨어에서 (참조 테이블의 자료), 고속 오실로스코프 획득 모드 설정, 플레이 아이콘을 클릭 한 다음 트리거 odorant 펄스 밸브 드라이버에서 시작 을 클릭 합니다.
    참고: 데이터 수집 소프트웨어 자동으로 20 차동 EOG 응답 진폭을 기록 s (3 4 전에 s odorant 펄스와 13 동안 s s 이후). micromanipulator 기동 기록 전극, 기준 전극, 또는 L-아르기닌 표준에 대 한 최대 응답와 빈 제어 (최소한의 응답 신호 대 잡음 비율을 증가 odorant 배달 튜브의 위치를 사용 하 여 필터링 된 물)입니다. 접지 전극 이동 하면서 GND로 AC-DC 앰프 스위치를 전환 하 여 증폭기.
  16. 빈 컨트롤, L-아르기닌, 그리고 단계에서 3.6 낮은에서 높은 농도의 필터링 된 물 2 분 플 러쉬를 응용 프로그램 간에 준비 odorants 녹음 시작 합니다.
  17. 테스트할 모든 odorants에 대 한 응답을 녹음 후 앰프 접지 하 고 신중 하 게 전극 및 odorant 배달 모 세관 튜브를 철회. MS222의 과다와 함께 마 취 심고 안락사는 승인된 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 방법, EOG 실험의 종료에 따라 (1 g/L).
    참고: 길 운동 및 적어도 5 분 뒤에 두뇌 pithing 하트 비트의 부족을 지적 함으로써 성공적인 안락사를 확인 합니다.
  18. 분석 및 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여. 빈 물 제어 보다 큰 응답을 이끌어내는 향기가 있는 분수를 식별 하기 위해 odorants22 의 탐지의 임계값을 결정 합니다. 빈 물 제어 보다 다른 농도 의존 후 각 응답을 이끌어내는 분수 풀 다음 행동 분석 결과 (4 단계)에서 테스트 합니다.

4. 2-선택 미로 행동 생물 행동 활성 분수/화합물을 식별 하

  1. 성적으로 성숙한 여성 바다 심고 미로에서 릴리스 장에 적응 ( 보충 그림 1참조) 5 분에 대 한 미로에서 강 수의 유량 유지
    참고: 미로 미로 업스트림 끝에 두 개의 채널로 분리 하는 길이 2.7 m를 측정 하는 분배기와 위험 스런된 바다 급료 나무와 측정 길이 6.5 m, 폭에서 1.2 m에서 건설 된다. 물 미로에 일시적으로 우회입니다. 0.19 m 물 깊이 유지 한다 고 0.07 m/s ± 0.01에서 속도 유지 해야 합니다.
  2. 바다 심고 놓고는 심고 실험에 지출 시간 및 각 포함 강 10 분 물 제어 채널의 누적 금액을 기록.
    참고: 바다 심고 실험에 들어가고 적어도 10에 대 한 채널을 제어 하지 못할 경우이 분 동안 s 끝 재판, 비활성 또는 강한 편견의 표시입니다.
  3. 적용 시험 자극 (즉, 10-12 M에 상 상속 페로몬에 50% 메탄올/이온된 수에 녹아 있는) 무작위로 할당 된 실험적인 채널을 차량 (50% 메탄올/이온된 수) 사용 하 여 제어 채널에 연동 5 분 동안 200 mL/min의 일정 한 속도로 펌프.
    참고: 전기 olfactogram 녹음 결정 테스트 자극의 감지 임계값 집중 해야 사용 초기 농도 행동 테스트에 대 한.
  4. 테스트 자극 및 추가 10 분에 대 한 차량 적용 하 고 실험에 심고 지출 시간의 누적 금액을 기록 및 제어 채널.
  5. 다음 재판의 시작 하기 전에 10 분 동안 물으로 미로 플러시. 충분 한 테스트 자극 사용할 수 있는 경우 최소 7 lampreys와 4.1-4.4 단계를 반복 합니다.
  6. 각 시험에 대 한 기본 설정22 의 인덱스를 계산 하 고 Wilcoxon 서명 순위 테스트를 사용 하 여 의미를 평가.
    참고: 인덱스 중 양수 또는 음수가 될 수 있는 단일 번호를 발생 합니다. 기본 설정의 인덱스의 양수 값 나타냅니다 매력, 반면 기본 설정 표시 반발의 지의 음수 값. 기본 설정의 인덱스는 0에서 크게 다른, 분수 활성으로 간주 됩니다.
    figure-protocol-6399
    여기,
    Bc = 테스트 심고 odorant 응용 프로그램 전에 제어 채널에 의해 소비 하는 시간
    Be = odorant 응용 프로그램 전에 실험 채널에서 보낸 시간
    C = odorant 신청 후 제어 채널에 소요 된 시간 및
    E = odorant 응용 프로그램 후 실험 채널에서 보낸 시간.

5. 컬럼에 절연 활성 분수에서 순수한 화합물의

  1. 유도 후 각 응답 (3 단계) 분수 풀 2.1-2.4 단계를 반복 하 고 행동 응답 (4 단계)를 유도.
  2. 더 크기 배제 크로마토그래피는 Sephadex LH-20 열을 사용 하 여 함께 화합물에 활성 분수를 정화.
    1. 초기 모바일 단계에 0.5 mL에 샘플 준비 [CHCl3-MeOH (1:1) 또는 MeOH 100%], CHCl3-MeOH (1:1) 열과 후 MeOH (100%)의 열, 해당 열에 로드 및 화합물을 얻을 수 그들을 elute.

6. 구조 해명 질량 분석 (MS)와 핵 자기 공명 (NMR) 순수한 화합물의

  1. 녹이 고 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 약 1 μ g/mL의 10 μ 솔루션의 초기 모바일 단계 (보통, 메탄올 물, 1:1, v: v)에서 순화 된 화합물을 희석.
    1. HPLC 튜브 샘플 솔루션 전송 고 HPLC의 autosampler에 그들을 설정 합니다. 분무 이온화 질량 분석 (ESIMS)에 샘플 (10 μ)을 주사 하십시오와 착 색 인쇄기 질량 분 서 계23을 사용 하 여 고해상도 분무 이온화 질량 분석 (HRESIMS) 스펙트럼 기록.
  2. 분자 공식 질량 분석기 소프트웨어에서 데이터베이스에 따르면 예측 (참조 테이블의 재료)24.
    1. 삽입 된 샘플의 크로마 열고 컬럼에 피크를 선택 하 여 그것의 질량 스펙트럼을 얻을.
    2. 이온 (m/z) 값 (4 소수)에 원소 구성 도구 모듈에서 측정 된 질량을 입력 합니다. 허용 오차 매개 변수 PPM를 설정 < 5.
    3. 측정된 분자의 요소 구성에 맞게 기호 매개 변수를 조정 합니다. 소프트웨어는 단일 질량 분석 기반 분자 공식의 예측을 생성 합니다.
  3. 샘플을 해산 하기 위해 프로토콜25 에 따르면 deuterated 용 (600 μ, CH3오-d4 또는 DMSO-d6)를 선택 합니다.
    1. 완전히 샘플 0.1에서 약 10 mg/mL 까지의 농도 가진 해결책을 형성을 선택한 deuterated 용 매에 용 해. 1 D (1H, 13C)를 기록 하는 NMR 튜브에 샘플 솔루션을 전송 및 2D NMR [1H-1H 상호 관계 분광학 (아늑한) heteronuclear 단일 양자 일관성 (HSQC) heteronuclear 여러 본드 상관 관계 (HMBC)] 900 MHz NMR 분 광 계26에 스펙트럼.
  4. NMR 튜브 회전자 터빈 내부 샘플을 놓습니다. 깊이 게이지를 사용 하 여 되도록 샘플 높이 측정 윈도우 중앙. NMR 소프트웨어를 열고 ( 재료의 표참조) 자석에 샘플을 변경 하려면 해제 단추를 클릭 하십시오.
    참고: 가스는 자석의 상단에서 오는 느낌을 자석 위에 손을 잡으십시오. 같은 시간에 휘파람 소리 청취 해야 합니다.
  5. 부드럽게 샘플 자석 위에 공기 쿠션에 놓고 NMR 자석으로 강하 하는 샘플을 다시 해제 버튼을 눌러.
    참고: 샘플 올바른 위치에 표시를 "클릭" 소리를 들어봅니다.
  6. 새 데이터 집합을 만들고 NMR 악기에서 권장 하는 기본 매개 변수를 로드 ( 재료의 표참조).
    1. 자동 잠금 프로시저를 호출 하 고 음성 안내 페이지에서 용 매 선택에 "잠금"을 입력 합니다.
    2. 튜닝에 대 한 조작 패널조정 잠금 해제 모델에 버튼, 조작 패널에 커서를 조정 하 고 다시 자석 자물쇠.
    3. 프롬프트 Atma 페이지에 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다 튜닝 절차를 조작 패널에서 매개 변수를 조정 합니다. 진행 하는 튜닝 완료 되 면 때까지 기다립니다.
    4. 프롬프트에서 "topshim"를 입력 하 여 자동 메우는 루틴을 시작 합니다. 메우는 진행 완료 될 때까지 기다립니다.
    5. 유형 "rga" 설정 자동 이득 조정, 다음 유형 "d1" 펄스, 다음 유형 "zg" 시작 하는 인수, 고 인수 완료 될 때까지 기다립니다의 간격을 설정 하려면 받고.
    6. "Ef" 또는 "efp" 데이터를 처리 하 고 자동 단계적으로 조정 "apk" 입력을 입력 합니다. NMR 프로세싱 소프트웨어에 데이터를 처리 합니다.
  7. 화학 구조를 명료 하 게 NMR 데이터 분석의 해석에 의해.
  8. 13C NMR 스펙트럼에서 탄소 신호를 계산 합니다. 고해상도 질량 분석 (HR-MS)에서 예측된 결과에서 일치 분자 수식을 선택 합니다.
  9. 1H NMR 스펙트럼에서 양성자 신호를 통합 하 고의 탄소와 양성자-기반 HSQC 스펙트럼에서 신호에 연결을 할당 합니다.
  10. 1H-1H 아늑한 상관 관계 및 HMBC 스펙트럼에 따라 탄소 골격의 연결을 지정 합니다.
  11. 가칭 구조 근거27에 따라 화학 구조를 할당 합니다. 화학 구조 데이터베이스에서 임시 구조를 검색 합니다. 참조에서 아날로그와 임시 구조를 비교 합니다.
  12. 핵 Overhauser 효과 분광학 (NOESY) 스펙트럼과 상대 구성을 할당 합니다.
    참고: 분석 및 분 광 방법에 표시 하는 상체의 id 속성은 동일, 2'-알코올 및 2'-NH2, 특히 그 어떤 화합물의 절대 구성은 해야로 결정 한 derivatization 반응입니다. Derivatization 반응 후 스펙트럼에 표시 된 차이 대부분 화합물28의 절대 구성의 명확한 임무를 촉진 한다.

7. EOG 검정 순수 화합물을 확인 하는 향기가 있는 행동 활성화

  1. 3.1-3.5 단계를 반복 합니다.
  2. 농도-응답 곡선에 대 한 준비에서 10-6 M-10-13 M 50% 메탄올/물-20 ° c에 결정 하는 분자량에 따라 저장에서 10-3 M 페로몬 재고 솔루션의 순수한 화합물의 10 희석의 10 mL 6.2 단계입니다. 온도 8 ° c.에 equilibrate를 수 있도록 반복 물 욕조에 L-아르기닌과 순수한 화합물의 작업 솔루션 유리 튜브를 넣어
  3. 3.7-3.18 단계를 반복 합니다.
  4. 4.1-4.2 단계를 반복 합니다.
  5. 임의로 할당 된 실험적인 채널을 5 분 동안 200 mL/min의 일정 비율로 연동 펌프를 사용 하 여 제어 채널에 차량 (50% 메탄올/이온된 수) EOG 감지 임계값 농도에서 순수한 화합물을 적용 합니다.
  6. 4.4-4.6 단계를 반복 합니다.

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결과

검정 안내 분별의 프로토콜에서 설명 하는 단계를 요약 하는 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다. 프로토콜 분리 구조, 후 각 힘 및 5 putative 바다 심고 페로몬 (그림 2)의 행동 활동을 특성화 하는 단계를 포함 한다. 대량 spectrometric 및 NMR 데이터 (그림 3 및 그림 4)를 사용 하 여 petromyzen...

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토론

물고기는 화합물의 아직 식별 전체 화학 세계에 살고 있습니다. 생물 검정 기반 분류 특징 masu 연어31,32, 아시아 코끼리 바다 lampreys33, 관찰 등 많은 화학적 상호 작용을 중재 하는 생리 활성 분자를 식별 하는 필수 입증 34,35. 검정 안내 분별 정확 하 게 추적 및 pinpoint 시작에서 생리 활성 화?...

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공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

우리는 미국 지질 조사 하 몬 드 베이 생물학 역 그들의 연구 시설 사용 및 미국 어류 및 야생 동물 서비스 및 수 산업의 직원 및 바다 캐나다 바다 lampreys 제공 하기 위한 감사 합니다. 이 연구는 웨이 밍 리와 애 리 대 호 어업 위원회에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Premium standard wall borosilicate capillaries with filament Warner InstrumentsG150F-4recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm)
Pipette puller instrumentNarishigePC-10pulls electrodes for EOGs
Diamond-tipped glass cutterGenericcut tip of electrodes for EOG
Borosilicate glass capillariesWorld Precision Instruments1B150-4odorant delivery tube for EOG
Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mmWarner InstrumentsESP-M15Nrecording electrode holder
Reference electrode holder E Series with handle with  Ag/AgCl pellet  for glass capillary OD 1.5 mmWarner InstrumentsE45P-F15NHreference electrode holder
1 mm pinWarner InstrumentsWC1-10to bridge reference and recording electrode holders
2 mm pinWarner InstrumentsWC2-5to bridge reference and recording electrode holders
AgarSigmaA1296molten agar to fill electrodes
Potassium chloride (KCl)SigmaP93333M KCl to fill electrodes and electrode holders
Micropipette microfilWorld Precision InstrumentsMF28G-5to fill electrodes and electrode holders
L-ArginineSigmaA5006positive control odorant for EOG
MethanolSigma34860
Water bathCustom madeN/Aholds odorants for EOG
3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222)Syndel USATricaine1GEOG anesthetic
Gallamine triethiodideSigmaG8134-5GEOG paralytic
1 mL syringeBD Biosciences301025to administer paralytic
Subcutaneous needle 26G 5/8BD Biosciences305115to administer paralytic
Roller clampWorld Precision Instruments14043-20adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth
Sodium chloride (NaCl)J.T. Baker3624-05for preparation of 0.9% saline
V-shaped plastic stand as specimen stageCustom madeN/Aholds lamprey during EOG
Plastic troughCustom madeN/Aholds V-shaped plastic stand during EOG
Scalpel Blades - #11Fine Science Tools10011-00for EOG dissection
Scalpel Handle - #3Fine Science Tools10003-12for EOG dissection
Straight ultra fine forcepsFine Science Tools11252-00for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps
Curved ultra fine forcepsFine Science Tools11370-42for EOG dissection, Moria MC40B
Straight pring ScissorsFine Science Tools15003-08for EOG dissection
StereomicroscopeZeissDiscovery V8for EOG dissection
Illuminator lightZeissCL 1500 ECOfor EOG dissection
Plastic tubingGenericto connect re-circulating EOG setup and water baths
Odorant delivery tubingCustom madeN/A
In line filter and gasket setLee CompanyTCFA1201035A
MicromanipulatorsNarishigeMM-3to position electrodes and odorant delivery capillary tube
Magnetic holding devicesKanetecMB-K
Valve driverArduinocustom madeto control the opening of the valve for odor stimulation
Electromagnetic valveLee CompanyLFAA1201618Hvalve for odor stimulation
NeuroLog AC/DC amplifierDigitimer Ltd.NL106to increase the amplitude of the elictrical signal
NeuroLog DC pre-amplifier with headstageDigitimer Ltd.NL102Gto increase the amplitude of the elictrical signal
Low-pass 60 Hz filterDigitimer Ltd.NL125
DigitizerMolecular Devices LLCAxon Digidata 1440A
Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion softwareMolecular Devices LLCAxoScope version 10.4
Faraday cageCustom madeN/AElectromagnetic noise shielding
Two-choice mazeCustom madeN/Awaterproofed marine grade plywood covered with plastic liner
Trash pumpHondaWT30XK4Afills maze with water from nearby river
Peristaltic pump with tubingCole ParmerMasterflex 07557-00to adminster odorants in maze
Inverter GeneratorHondaEU1000ipowers perstaltic pump
Release cageCustom madeN/Aused to acclimate lamprey in the maze
MeshGenericused to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers
Buckets (5 gallon)Genericto mix odorants
Flow meterMarsh-McBirneyFlo-Mate 2000to measure discharge
XAD 7 HP resinDow chemical37380-43-1for extraction of conditioned water 
MethanolSigma34860for extraction of conditioned water 
Water bathYamatoBM 200for extraction of conditioned water 
Freeze dryerLabconcoCentriVap Concentratorfor extraction of conditioned water
chloroformSigmaCX1050for isolation of fraction pools
Silica gel 70-230 meshSigma112926-00-8for isolation of fraction pools
Silica gel 230-400 meshSigma112926-00-8for isolation of fraction pools
Pre-coated silica gel TLC platesSigma99571for isolation of fraction pools
anisaldehydeSigmaA88107for isolation of fraction pools
Sephadex LH-20GE Healthcare17-0090-01for isolation of fraction pools
Amberlite XAD 7 HP resinSigmaXAD7HPfor extraction of conditioned water 
4, 2.5L capacity glass columnsAce Glass Inc.5820for extraction of conditioned water 
AcetoneSigma650501for extraction of conditioned water 
TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent)Waters Co.N/Afor structure elucidation
Binary HPLC pumpWaters Co.1525for isolation of fraction pools/compounds
Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent)AgilentN/Afor structure elucidation
Rotovap drying systemBuchiRIIfor extraction of conditioned water 
UV lamp (254 nm)Spectronics Co.ENF-240Cfor thin layer chromatography 

참고문헌

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