생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

요약

우리 개 neutrophils 전체 혈액에서 분리 하 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 라이브 호 중구에서 그물 형성을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 네트워크 형성 및 citrullinated 히스톤 H3 계량 하는 설명 (citH3) 식 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여.

초록

병원 균 침입에 대 한 응답, 중 성구 호 중구 extracellular 함정 (그물), 장식 된 히스톤과 항균 단백질 DNA의 세포 외 네트워크를 릴리스 합니다. 과도 한 네트워크 형성 (NETosis) 및 패 혈 증 동안 citH3 자료 여러 기관 역 기능 및 쥐와 인간 사망 관련 된 하지만 개 그 의미를 알 수 있습니다. 여기, 우리가 개 neutrophils 관찰과 NETosis의 정량화에 대 한 전체 혈액에서 분리 하는 기술을 설명 합니다. Dextran 침전에 의해 생성 된 백혈구 풍부한 플라즈마 상용 밀도 그라데이션 분리 미디어로 구분 되 고 granulocytes 수집 세포 수 및 생존 능력 테스트. 관찰 하기 위해 라이브 호 중구에서 실시간으로 NETosis, permeant 셀 및 셀 impermeant 형광 핵 산 얼룩 호 중구 활성화 lipopolysaccharide (LPS) 또는 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)에 추가 됩니다. 핵 형태학 및 NET 형성 변화는 시간이 지남에 형광 현미경 검사 법에 의해 관찰 된다. 생체 외에서 NETosis 공동-colocalization의 세포 없이 DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) 및 citrullinated 히스톤 H3 (citH3) 수정된 더블-immunolabelling 프로토콜을 사용 하 여 추가 특징 이다. 그물 그물 형성 및 citH3 식 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 객관적으로 계량을 하 고 citH3 양성 세포는 사용 가능한 소프트웨어를 사용 하 여 멀게 방식에서 계량. 이 기술은 체 외에서 의 용량 개 호 중구 NETosis을 평가 하는 특정 분석 결과 이다.

서문

호 중구는 짧은 granulocytes 병원 체 침입에 대 한 초기 방어에 대 한 책임. 먹어서, degranulation, 반응성 산소 종 (선생님)¹세대에 의해 미생물을 제거 하는 호 중구, 감염의 사이트에 보충. 세균 또는 독, 있을 때 호 중구 릴리스 호 중구 extracellular 함정 (그물), extracellular chromatin의 구성된 장식 히스톤 elastase myeloperoxidase 같은 세분화 된 단백질 (MPO)². 그물을가지고 있지만 필수적인 항균 속성, 패 혈 증 동안 불타 그물 형성 여러 장기 부전 및 죽음^3,4, 으로 이어질 수 있습니다 제안 실험 및 임상 증거 증가 ^{5 , 6}.

그물 개에 유사한 병 태 생리 역할을 재생할 수 있습니다, 때문에 치료 개입을 방지 하거나 감소 그물 형성 정화 조 동물에 비 발한 치료 전략으로 봉사 할지도 모른다. 이러한 이유로, 평가 하 고 NETosis와 개에 있는 NET 구성 요소를 계량 하는 신뢰할 수 있는 기술에 대 한 필요가 있다. NET 구성 요소 셀 무료 DNA (cfDNA) 등 nucleosomes 개 호 중구 및 임상 개^7,,89에서 플라즈마에 이전 평가 않았습니다. 형광 분석 실험을 사용 하 여, Goggs 및 Letendre 발견 정화 조 개 건강 개⁸보다 cfDNA의 더 높은 수준이 있다. 비록 이러한 기술은 매우 객관적이 고 정량적 인 NETosis의 표식으로 cfDNA 및 nucleosomes의 측정은 NETosing neutrophils 이외의 회 저 성 세포에서 파생 될 수 있기 때문에 일반적인입니다. 여기는 라이브 NETosing 호 중구의 행동 검사에 형광 현미경 검사 법을 활용 하는 기술에 설명 합니다. 우리는 또한 주관적으로 계량 그물과 MPO 등¹⁰개 호 중구에서 citH3 그들의 구성 요소를 더블-immunolabeling를 사용 하 여 수정 된 프로토콜을 선발.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 방법을 기관 동물 관리 및 사용, 데이비스가 주 대학에 위원회에 의해 승인 했다 (번호를 프로토콜: 18338).

1. 혈액 컬렉션

1. 21g 바늘을 사용 하 여 주사기 포부에 의해 두 부 또는 jugular 정 맥에서 혈액 10 mL을 그립니다.
2. 과도 한 전단 응력을 방지 하려면 나트륨 덤플링을 (75 USP)를 포함 하는 tube(s)로 혈액을 전송 하기 전에 주사기에서 바늘을 제거 합니다. 부드럽게 반전 튜브 몇 번 응고 제와 혈액의 적절 한 혼합 되도록. 혈전 또는 얼음에 샘플을 배치 하기 전에 레드 셀 집계를 확인 합니다.

2. 호 중구 절연

1. 얼음 처럼 차가운 Dubecco 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) (pH 7.4, divalent 양이온 없이)의 동등한 양으로 anticoagulated 혈액 희석. 8 mL 희석된 혈액의 포함 ( Leuconostoc 종 0.9% 염화 나트륨 용액에 녹아 있는)에서 3 %dextran 25 mL 50 mL 폴 리 프로필 렌 원뿔 관으로 전송 합니다. 튜브를 집계 및 적혈구의 침 강 30 분 동안 실내 온도에 똑바로 놓습니다.
2. 신중 하 게 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 튜브에 밀도 그라데이션 미디어의 5 mL 위에 백혈구 풍부한 혈장 (그림 1)의 5 mL를 계층. 2 솔루션¹¹혼합에 아닙니다 조심 하십시오.
3. 400 x g 가속/감속을 실 온에서 30 분 동안 0 (브레이크) (A/D) 설정에서 튜브 원심
4. 5 mL를 사용 하 여 혈 청 학적인 피펫으로 플라즈마 및 주변 혈액 단 세포 (PBMC) 층 (그림 1)를 우회 하 여 granulocyte 셀 레이어를 수집 합니다. 오염을 최소화 하기 위해 새로운 피펫으로 각 시간을 사용 합니다.
5. 폴 리 프로필 렌 50 mL 원뿔 튜브에 polymorphnuclear (PMN) 세포 층의 4 ~ 6 mL를 배치 합니다. 적은 양의 적혈구 집계 PMN 레이어와 함께 발음 될 수 있습니다, 이후 1 mL 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 부드럽게 제거 적혈구 집계는 튜브의 하단에 정착.
6. 차가운 초순 물 20 mL와 나머지 적혈구 lyse 부드럽게 여러 번 30 ~ 60 대 한 튜브를 반전 차가운 1.8% 염화 나트륨 해결책의 동일한 볼륨을 추가 하기 전에 적절 한 lysing 되도록 s.
7. 4 ° C에서 10 분, 0 A/D 설정에 대 한 112 x g 에서 원심.
8. 이 펠 릿 나타나는 붉은 경우 적혈구 세포 단계를 반복 합니다. 혈 청 학적인 피펫으로와 신중 하 게 상쾌한 삭제 하 고 부드럽게 DPBS (5 mM 포도 당, 0.9 m m MgCl₂, 1.9 m m CaCl₂ 와 1% 소 혈 청 알 부 민, pH 7.3)의 100 µ L에 펠 릿을 resuspend. 모든 resuspended 셀을 결합 하 고 얼음에.
9. 자동된 세포 분석기를 사용 하 여 셀 수를 수행 하 고는 hemocytometer에 의해 카운트를 확인. 필요한 경우, cytocentrifuge (1000 rpm, 5 분)를 사용 하 여 유리 슬라이드에 PMNs 집중 하 고 셀의 총 수에서 호 중구의 수를 계산 하 여 호 중구의 비율을 결정.
10. Strober 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 trypan 블루 제외 테스트를 수행 하 여는 호 중구의 생존 능력을 결정 ¹² 성공적인 격리 95에서 100%는 생존을 산출 해야 한다 고 호 중구 95% 이상 이어야 한다.
11. 백분율 생존 및 호 중구 백분율 총 세포 수로 호 중구의 농도 결정 합니다. 성공적인 격리 6 x 10⁶/mL을 1.5에서 호 중구의 농도 양보 한다.
12. 7.3으로 조정 하는 ph 5 mM 포도 당, 0.9 m m MgCl₂, 1.9 m m CaCl₂, 및 1% 소 혈 청 알 부 민을 포함 하는 DPBS와 호 중구 1 x 10⁶/mL의 최종 농도에 희석.

3. 라이브 호 중구의 형광 현미경

1. 폴 리-L-리 신의 각 음에 호 중구 (1 x 10⁶/mL)의 400 μ 장소 200 12-잘 문화 플레이트 코팅. 30 분 동안 37 ° C에서 세포를 배양 하 여 우물의 바닥에 준수 호 중구 수 있습니다.
2. 두 핵 산 염료 중 하나, 하나는 그대로 막 셀에 얼룩 및 투과성 멤브레인과 ( 재료의 표참조), 실 온에서 10 분에 대 한 셀에 얼룩 하나 1 μ M으로 핵 산을 라벨.
3. 100 μ g/mL lipopolysaccharide (LPS) (E. 콜라이 O55와 호 중구 활성화. B5), 100 nM phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 긍정적인 통제, 또는 DPBS 180 분 37 ° c.에 대해 부정적인 컨트롤의 해당 볼륨
4. 이미지는 GFP를 사용 하 여 (여기: 470/22 nm, 방출: 525/50 nm) 및 텍사스 레드 채널 (여기: 585/29 nm, 방출: 628/32 nm) 다음 시간 지점에서 40 배 확대에 형광 현미경 검사 법에: 30, 90, 120, 및 180 분.

4. NET 정량화 및 NET 구성 요소를 사용 하 여 면역 형광의 탐지

1. 신중 하 게 12-잘 문화 접시의 우물에 18 m m 직경 폴 리-D-리 코팅 커버 전표를 놓습니다. 우물을 적절 하 게 레이블을 지정 합니다.
2. 씨앗 100 ~ 200 μ는 coverslips에 직접 neutrophils (1 x 10⁶/mL) 절연 고 30 분 동안 37 ° C에서 세포를 배양 하 여 커버 전표를 준수 호 중구.
3. 3.3에 설명 된 대로 호 중구 활성화 합니다. 200 µΜ와 호 중구 pretreating 여 그물 형성 억제 Cl-amidine (15 분, 37 ° C) 리 외. 여 앞에서 설명한 활성화 이전 ¹³ 확인 적절 한 차량 제어 (DMSO)는 실험에 포함 됩니다.
4. 조심 스럽게 잘 집게와 커버 슬립을 제거. 4%의 2 ~ 3 방울을 얕은 웰 스를 만드는 테스트 튜브 스탠드 위에 파라핀 필름 시트를 레이어 PFA 각 잘¹⁰. 우물을 적절 하 게 분류 하 고 부드럽게 PFA 가득 우물에 거꾸로 커버 슬립을 하다. 20 분 동안 실내 온도에 고정 수를 셀 수 있습니다.
5. 한 음에서 다음 이동 하 여 3 회에서 5 분 동안 DPBS 셀을 씻어.
6. Immunolabelling 호 중구 활성화 및 고정 후 수행할 수 없습니다, 경우 커버 전표 덮개 미 끄 러 짐 얼굴-최대 흡 광도 종이의 조각에 배치 하 여 건조 공기를 되도록 허용 합니다. 커버 슬립 추가 분석까지 4 ° C에서 이라는 12 잘 문화 접시에 최대 1 주 얼굴-최대 저장할 수 있습니다. 워시 DPBS 4.4 다음 단계로 진행 하기 전에에서 설명 된 대로 동일한 기술을 사용 하 여 1 분 동안에 3 번 셀.
7. 세포를 permeabilize를 부드럽게 커버 슬립 거꾸로에 하다 NP-40는 기술을 사용 하 여 1 분 동안 4.4에서 설명 하는 1%의 드롭. DPBS 로커에 1 분 동안 3 번을 씻어.
8. 임의로 숫자를 할당 하는 각 샘플 하 고는 coverslips를 따라 다이아몬드 포인트 마커를 사용 하 여.
9. 준비 고 레이블 개별 접시 파라핀 영화 늘어서 (버퍼 차단) 필름에 5% 염소 혈 청의 100 ~ 200 μ를 배치 합니다. 블로킹 버퍼에는 coverslips를 거꾸로 누워. 로커에 놓고 1 시간 37 ° c.에 대 한 품 어
10. DPBS 로커에 5 분 동안 3 번을 씻어.
11. 1 차적인 항 체 희석 (1:400 토끼 polyclonal 안티-citrullinated 히스톤 H3 (citH3) 5% 염소 혈 청에서). 셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 거꾸로 희석된 항 체 솔루션의 50 ~ 100 μ에 각 커버 슬립을 하다. 로커에 놓고 1 시간 37 ° c.에 대 한 품 어
12. DPBS 로커에 5 분 동안 3 번을 씻어.
13. 희석 이차 항 체는 5% 염소 혈 청에 fluorophore (1: 200)을 활용. 셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 거꾸로 희석된 항 체 솔루션의 50 ~ 100 μ에 각 커버 슬립을 하다. 로커에 놓고 어둠 속에서 37 ° C에서 1 시간을 품 어.
14. 어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.
15. Myeloperoxidase (MPO)의 동시 검출에 대 한 리 외. 에 설명 된 대로 수정된 더블 immunolabeling 프로토콜에 대 한 다음 단계에 따라 ¹³
16. 셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 각 커버 슬립 거꾸로에 누워 10% 토끼의 100 ~ 200 μ 부드러운 락 (하룻밤, 4 ° C, 어둠 속에서)에서 혈 청.
17. 어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.
18. 셀 50 μ g/mL 결합형된 염소 안티 토끼 팹 어둠 속에서 로커에 실 온에서 2 h에 대 한 조각에 품 어.
19. 어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.
20. 1 차적인 항 체 (1: 200 토끼 polyclonal 항 인간의 MPO 항 체)에 5% 염소 혈 청을 희석. 셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 거꾸로 희석된 항 체 솔루션의 50 ~ 100 μ에 각 커버 슬립을 하다. 로커에 놓고 어둠 속에서 37 ° C에서 1 시간을 품 어.
21. 5% 염소 혈 청에 fluorophore를 활용 된 이차 항 체를 희석 하 고 품 어 4.8에 설명 된 대로
22. 어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.
23. 간섭 제어 두 번째 면역 라벨 단계에서 어느 주 항 체를 가진 외피를 제외 하 여 준비 되어야 한다.
24. 300 DNA를 얼룩 nM의 4' 6-Diamidion-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) 실 온에서 어둠 속에서 5 분.
25. 어둠 속에서 로커에 1 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.
26. 유리 슬라이드에 antifade mountant의 드롭 (~ 50 μ)을 적용 합니다. 부드럽게 거꾸로 셀으로 coverslip를 탑재 하기 전에 초과 버퍼를 제거 하는 흡수 성 종이에 coverslip의 가장자리를 누릅니다. 장착 매체는 coverslip와 유리 슬라이드 사이 얇은 층을 형성 한다. 공기 방울을 제거, 매우 부드럽게 누릅니다는 coverslip에 좋은 집게와.
27. 4 ° c.에 어둠 속에서 하룻밤 치료 샘플 허용 장착 매체 집중 렌즈와 현미경 분석에 대 한 강화 해야 합니다. 어둠 속에서 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.

5. 호 중구 Extracellular 함정 정량화

1. 수집 하 고 분석 하는 실험 조건에 현미경 이미지 operator(s) 장 님.
2. 40 X 확대에 형광 현미경을 사용 하 여, 걸릴 10 이미지 임의로 해당 채널에서 실험에서 각 coverslip의 다른 지구에서. 노출 시간, 밝기 및 대비 각 채널의 이미지의 인수에 걸쳐 일관성이 유지 됩니다 확인 하십시오.
3. 사용 가능한 소프트웨어 ImageJ (NIH) 등을 사용 하 여 이미지를 분석 합니다. CfDNA, citH3, MPO (그림 3A, B)의 공동 지역화에 따라 그물을 식별 합니다. 계량 그물과 각 실험 조건에 대 한 10 임의의 필드에서 호 중구의 수 있습니다. 그물의 숫자 발표 비율로 표현 될 수 있습니다 (그물의 번호: 호 중구의 총 수) 각 실험 조건에 대 한.
4. 세포내 citH3 식에 치료 효과 평가 하려면 계산 세포내 citH3와 호 중구의 수와 각 채널 ( 에서 40 배 확대에 10 임의의 필드에서 세포내 citH3 없이 호 중구 수가 그림 3, 빨간색 화살표). 세포내 citH3 식 세포내 citH3 세포내 citH3 없이 호 중구의 수와 호 중구 수의 비로 나타낼 수 있습니다.

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결과

라이브 셀 이미징의이 프로토콜을 사용 하 여, 조사 핵 형태학, 원형질 막 무결성과 생활 호 중구에서 cfDNA의 존재를 확인할 수 있습니다. 손상 된 세포 막에 포함 된 셀에 셀 impermeant 핵 염색 얼룩 핵 산 레드. 다른 셀 permeant 염료, 라벨 그대로 플라즈마 멤브레인과 살아있는 세포에서 세포내 핵 산. 그들의 치료에 모든 그대로 neutrophils 녹색 표시 되 고 자극 (...

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토론

선물이 여기 생활 개 neutrophils 셀 permeant 염료와 셀 impermeant 염료를 사용 하 여에 핵 구조 및 cfDNA 출시를 프로토콜. 이 분석 결과의 주요 장점은 수 있다는 그물 형성의 실시간 탐지에 대 한 고해상도 현미경 셀 고정 없이 라이브 호 중구에 의해 따라서 관찰 하는 그물 형성 체 외에 는 간단 하 고 유용한 도구를 제공. 이 분석 결과 NET 구성 요소 검색에 대 한 항 체를 필요로 하지 않습니다, 때?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran from Leuconostoc spp.	Sigma	31392	Molecular weight 450,000 – 650,000
Ficoll-Paque PLUS	GE Life Sciences	17144002
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	A1285801	With divalent cations
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190136	Without divalent cations
E. coli O55:B5	InvivoGen
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S11368	5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S7578	1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes
Surface-Amps NP-40	Pierce	28324
Poly-D-Lysine coated coverslips	neuVitro	H-12-pdl	12 mm diameter
Anti-citrullinated histone H3 antibody	Abcam	Ab5103
Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments	Jackson ImmunoResearch	111-007-003	Specificity: IgG (H+L)
Anti- Myeloperoxidase antibody	Dako	A0398
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)	Life Technologies Corporation	D1306