형광 기자 흐름 Cytometry 사용 pH-종속 mt-Keima에 의해 Mitophagy의 중요 한 측정

요약

Mitophagy, 미토 콘 드리 아, 선택적 저하 미토 콘 드 리아 항상성에 연루 되어 고 다양 한 인간 질병에 폐지. 그러나, mitophagy 활동을 측정 하기 위한 편리한 실험적인 방법을 매우 제한 됩니다. 여기, 우리는 cytometry를 사용 하 여 mitophagy 활동을 측정 하기 위한 중요 한 분석 결과 제공 합니다.

초록

Mitophagy 선택적 제거의 autophagy 기계를 사용 하 여 손상 되거나 불필요 한 미토 콘 드리 아의 과정 이다. 결함이 mitophagy 및 신경 퇴행 성 질환, 암, 대사 질환 등 다양 한 인간 질병 사이 가까운 연결이 발견 되었습니다. 또한, 최근 연구는 mitophagy는 차별화 및 개발 등의 정상적인 세포 프로세스에 관여 나타났습니다. 그러나,의 정확한 역할 및 mitophagy 기본 분자 메커니즘 연구를 해야 합니다. 따라서, 그것은 mitophagy 활동에 변화를 측정 하기 위한 강력 하 고 편리한 방법을 개발 하는 중요 한입니다. 여기, 우리는 양적 cytometry 미토 콘 드리 아-타겟 형광 단백질 Keima (mt Keima)를 사용 하 여 통해 mitophagy 활동을 평가 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 더 신속 하 고 민감하게 전통적인 현미경 검사 법 또는 immunoblotting 기반 방법 보다이 흐름 cytometry 분석 결과 mitophagy 활동을 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다양 한 셀 형식에 mitophagy 활동 분석에 적용할 수 있습니다.

서문

미토 콘 드리 아 세포 증식과 생리학에 필수적인 세포는. 미토 콘 드리 아 생성 산화 인 산화를 통해 ATP 공급의 80% 이상 및 그들은 또한 생 합성 및 대사^1,2에 대 한 다양 한 대사 중간체를 제공 합니다. 에너지 공급 및 물질 대사에 그들의 역할 외에도 미토 콘 드리 아 중앙에서 역할 많은 다른 중요 한 프로세스, 반응성 산소 종 (ROS) 생성, 세포 죽음, 그리고 세포내 캘리포니아^{2 +} 역학^{3의 규칙을 포함 하 여} . 미토 콘 드리 아 기능으로 변경 인간의 질병, 암, 당뇨병, 다양 한 신경 질환^4,5등와 연결 되었습니다. 증가 미토 콘 드 리아 기능 장애 및 미토 콘 드리 아 DNA 변이 정상적인 노화 과정^6,,78을 생각 된다 또한. 따라서, 품질 관리 미토 콘 드리 아에서 중요 한 문제입니다. 미토 콘 드리 아에는 지속적으로 늘어나는 네트워크와 짧은, 조각난 형태 사이 그들의 모양을 변경할 수 있는 매우 동적인 세포입니다. 미토 콘 드리 아 역학 mitophagy⁹를 통해 그들의 저하 뿐만 아니라 미토 콘 드리 아의 기능 유지에 중요 한 역할을 한다.

Mitophagy는 autophagy 기계를 사용 하 여 전체 미토 콘 드리 아의 선택적 저하를 포함 하는 메커니즘입니다. Mitophagy 원리 메커니즘 기본 미토 콘 드 리아 회전율과 손상 또는 역 기능 mitochondria의 제거 이다. 이 과정에서 미토 콘 드리 아 막, autophagosomes, 다음 가수분해 저하⁹리소좀과 융합의 형성의 결과로 처음 둘러싸여 있다. 초파리 에서 유전자 연구 제안 두 파 킨 슨 병 관련 유전자, PTEN 유도 상 상속 키 니 아 제 1 (PINK1) (PARK6) Parkin (PARK2), 동일한 통로^10,11에 기능. 시퀸스 연구 PINK1 Parkin 통로 제거 손상 된 미토 콘 드리 아에 대 한 책임 및 역 기능 mitophagy이 통로에 결함을 인간의 질병^12,13에 기여할 수 있습니다 나타났습니다. 결함 mitophagy 프로세스에 최근 다양 한 인간 질환, 암, 심장 질환, 간 질환과 neurodegenerative 질병 ¹⁴를 포함 하 여 발견 되었습니다. 또한, 최근 연구는 또한 나타났습니다 그 mitophagy는 차별화, 개발, 면역 응답^{15,,1617,18 등 많은 생리 과정에 중요 한 ,19}, 제안 하는 mitophagy 세포 기능을 조절에 더 적극적인 역할을 재생할 수 있습니다.

최근 확인 mitophagy 미토 콘 드리 아에서 두 품질 관리에 중요 한 역할 및 인간의 질병, 밑에 mitophagy 분자 메커니즘 제대로 유지에 불구 하 고 이해. Mitophagy 관련 메커니즘에서 효 모 연구 체계적으로, 비록 포유류 세포에서 mitophagy 관련 메커니즘을 탐구 하기 위한 연구 PINK1 Parkin 통로에 주로 집중 했다. 이전 연구는 PINK1 Parkin 통로 주로 mitophagy^12,20,21을 통해 손상 된 미토 콘 드리 아의 선택적 제거에 대 한 책임을 설립 하 고 있다. 그러나, 최근 연구는 일부 모델에 mitophagy 활성화 될 수 있다 기능 PINK1^22,,2324의 부재에도 보고 있다. 이 결과 PINK1 Parkin 통로, 거기 mitophagy를 활성화할 수 있는 추가 미확인된 통로 이외에 하는 것이 좋습니다.

Mitophagy 활동을 평가 하는 편리한 방법의 부재 탐험 경로 mitophagy 및 병 태 생리 이벤트에서의 역할에 중요 한 장애 이다. 전자 현미경 직접 autophagosome를 가득 채우고 미토 콘 드리 아를 시각화 하는 강력한 도구입니다. 그러나, 전자 현미경 mitophagy 활동 측정에 한계가 있다. 비록 microtubule 관련 단백질 1를 사용 하는 전략 빛 체인 3 (LC3)-GFP LC3, 등 활용된 형광 프로브는 현재 가장 널리 사용 되 접근²⁵, LC3 기반 신호의 과도 특성 및 그것의 높은 속도의 허위-긍정 신호 셀²⁶에서 mitophagy을 탐지 하기 위한 그것의 감도 제한 합니다. 미토 콘 드리 아 단백질 수준, autophagosomes 또는 리소좀 미토 콘 드리 아 colocalize 미토 콘 드리 아 DNA, 형광 현미경 분석의 정량화를 측정 하기 위해 서 부 럽의 조합 평가 하기 위한 좋은 방법이 될 것 이라고 mitophagy입니다. 그러나, 정량화 한계 및 기존 방법론의 부족 새로운 접근에 대 한 호출합니다. 새로운 pH 의존 형광 단백질, 미토 콘 드 리아 대상 Keima (mt Keima)의 소개는 크게 mitophagy²⁷을 감지 하는 능력 향상. 시 토 크롬 c 산화 효소 소 단위 VIII (콕스 VIII) Keima로의 미토 콘 드리 아를 대상으로 순서를 융합 하는 여 산 Keima는 미토 콘 드리 아를 감독 이다. 440에서 여기 Keima 피크에에서 큰 변화 586 nm (해당 pH 7과 pH 4, 각각) 수 nm 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험^{28,29에 민감하게 좋은 mitophagy를 평가 하기 위해 활용} . 더 중요 한 것은, lysosomal 저하 산 Keima의 저항 리소좀, mitophagy 활동의 쉬운 양적 측정에 대 한 허용에 mt Keima 신호 통합을 발생 합니다. Mt-Keima에서 발생 하는 형광 변경 중 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 분석 될 수 있다 또는 흐름 cytometry^28,29. 그러나, mt Keima를 사용 하 여 mitophagy 활동을 측정 하기 위한 교류 cytometry 기반 방법까지 자세히 제공 되어 하지 않았습니다.

여기, 우리 산 Keima를 사용 하 여 셀에 mitophagy 활동을 측정 하기 위한 흐름 cytometry 기반 기술에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 여기에 표시 된 Parkin 표현 하는 HeLa 세포에서 성공적으로 감지 CCCP 유도 mitophagy을 교류 cytometry 분석을, 비록이 기술은 다양 한 셀 형식에 적용할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 미토-Keima (mt Keima) 표현 HeLa 세포의 생성

1. Mt Keima lentivirus의 준비
   1. 0.001% 폴 리-L-리 신/인산 염-버퍼링 식 염 수 (PBS)의 2 개 mL를 추가 하 여 100 mm 문화 접시 코트 고 실 온에서 5 분 동안 서 서 있습니다.
   2. 진공에 연결 하는 유리 피 펫을 사용 하 여 폴 리-L-리 신 솔루션을 제거 하 고 1 x PBS의 2 개 mL를 추가 하 여 문화 접시를 세척.
   3. 플레이트 1.5 x 10⁶ HEK293T 셀 코팅된 문화 10 %FBS 1% 페니실린/스, 포함 된 DMEM의 10 mL와 함께 요리 하 고 CO₂ 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 셀 1 일 문화.
   4. DNAs (psPAX 2 µ g과 pVSVG 0.25 µ g) 포장 함께 mt Keima lentiviral 플라스 미드²⁹ DNA의 2 µ g transfect transfection 시 약을 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 8 h에 대 한.
   5. Transfection 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어의 8 mL를 추가 합니다.
   6. 48 h 후 바이러스 성 입자를 포함 하는 미디어를 수집 합니다. 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리 하 여 수집 된 미디어에서 세포질 파편을 제거 하 고 0.45 μ m 주사기 필터와 필터링.
      참고: 장기간 사용에 대 한 aliquots lentiviral 입자의 만들고-80 ° c.에 샘플 저장 바이러스 샘플을 동결-해 동 주기 효율적인 바이러스 감염에 대 한 복종 하지 마십시오.
2. Mt Keima lentivirus 감염 헬러 Parkin 셀
   1. 플레이트 5 x 10⁴ HeLa 세포 DMEM 포함 10 %FBS 1% 페니실린/스 37 ° C에서 마운트 Keima lentivirus 수확 전에 하루 4 mL와 60 mm 문화 접시에 Parkin (헬러-Parkin)를 표현.
      참고: 헬러 세포³⁰, 더 명확 하 게 쇼 CCCP 유도 mitophagy 여기 익숙해 헬러 Parkin 셀에에서 생 Parkin 식의 부재 때문에. 이 절차는 또한 다른 주 또는 불멸 하 게 셀 라인에 적용할 수 있습니다.
   2. 다음 날 성장 매체를 제거 하 고 산 Keima lentiviral 미디어의 1 mL을 추가. Polybrene 재고 솔루션 (증류수에 8 mg/mL)의 3 µ L을 포함 하는 성장 매체의 추가적인 2 mL를 추가 합니다. CO₂ 조직 문화 인큐베이터에서 1 일 동안 품 어.
   3. 다음 날 mt Keima lentiviral 혼합물을 제거 하 고 씻어 1 x PBS로 두 번 셀. 성장 매체의 4 mL를 추가 하 고 이틀 동안 2 µ g/mL puromycin 셀 치료.
   4. Puromycin 선택의 2 일 후에 성장 매체를 제거 하 고 두 번 1 x PBS로 세포 세척. 성장 매체를 추가 하 고 사용까지 CO₂ 배양 기에서 세포 문화.
      참고: 이 메서드는 안정적으로 mt-Keima, 다른 세포 선 및 1 차 셀을 포함 하 여 표현 하는 셀을 생성 하 적용할 수 있습니다.

2. 유도 mitophagy CCCP 치료를 사용 하 여 및 FACS 샘플 준비

1. 플레이트 5 x 10⁴ 헬러 Parkin 세포 mt-Keima-60mm 문화 표현 10 %FBS 1% 페니실린/스 포함 된 DMEM의 4 mL와 함께 요리 하 고 CO₂ 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 일 문화.
2. 다음 날 성장 매체를 제거 하 고 신선한 DMEM 포함 10 µ M 카보닐기 시안 m-chlorophenylhydrazone (CCCP)의 4 개 mL를 추가. 헬러-Parkin-mt-Keima 셀 6 h에 대 한 CO₂ 조직 배양 기에 품 어.
3. 나중에 6 h 성장 매체를 제거 하 고 1x PBS의 2 mL로 세포 세척. 트립 신/EDTA 솔루션으로 그들을 치료 하 여 세포를 분리 하 고 10%를 포함 하는 성장 매체를 추가 하 여는 트립 신을 비활성화 FBS. 15 mL 원뿔 튜브로 셀을 전송 합니다.
4. 5 분 동안 500 x g에서 셀 원심
5. 조심 스럽게 포부에 의해 성장 매체를 제거 하 고 차가운 1 x PBS의 1 mL로 세포를 resuspend.
6. 적합 한 FACS 튜브에 세포를 전송 하 고 얼음에 그것을 배치.
   참고: 부정적인 통제로 감염 되지 않은 HeLa 세포를 준비 합니다.
   참고: 세포, 몇 시간 동안 얼음에 가능한가 그리고 mt Keima 형광 신호 또한 안정적으로 유지.

3. FACS 분석 mitophagy

참고:이 연구에 셀 흐름 cytometer 405 nm 및 561-nm 레이저 장착으로 분석 되었다. 바이올렛 레이저로 세포 흥분 했다 (405 nm) 방출 BV605 검출기와 노란색-녹색 레이저 610 ± 10 nm에서 감지와 (561 nm) 방출 동시에 610 ± 10 nm에서 PE CF594 검출기에 의해 감지 (그림 1)와 함께.

1. 라이브 셀 게이팅
   1. 교류 cytometer와 컴퓨터 그리고 분석 소프트웨어에 로그인.
   2. 새로운 실험을 생성 하거나 기존 실험을 복제 합니다. 보라색으로 세포를 자극 (405 nm)와 노란색-녹색 (561 nm) 레이저 및 방출 610 ± 10 nm 검출기에서 검출, 앞으로 분산형 (FSC) 및 측면 살포 (SSC) 필요한 fluorophores로 매개 변수 창에서 BV605와 PE-CF594을 선택.
      참고: 모든 fluorophores 선형 모드에 추가 되어야 합니다.
   3. 와 동 각 셀 샘플 짧게 분산 셀을 집계 합니다.
   4. Mt Keima lentivirus 샘플 주입 포트와 감염 되지 않은 컨트롤 헬러 Parkin 셀 샘플을 포함 하는 튜브 놓고는 cytometer에서 "실행된" 버튼을 누릅니다.
   5. SSC 대 FSC의 도트 줄거리에서 점 작의의 중앙에 세포를 FSC 그리고 SSC 전압을 조정 합니다.
   6. P1 게이트 라이브 셀 주위 다각형 아이콘을 사용 하 여 그리고 죽은 세포 및 세포 잔해 (그림 2A).
2. 보라색과 녹색 레이저에 대 한 전압 조정
   1. 튜브 샘플 주입에 mt Keima lentivirus 감염 포함 헬러 Parkin 셀 포트와 cytometer에서 "실행된" 버튼을 눌러 놓습니다.
   2. BV605의 도트 음모에서 (405 nm) 헬러 Parkin 셀 mt Keima 표현이 mt-Keima (그림 2B)를 표현 하지 않는 제어 셀에서 명확 하 게 구별 되도록 BV605 전압을 조정 SSC, 대.
   3. PE-CF594의 점 플롯에 (561 nm)는 헬러 Parkin 셀 mt Keima 표현 명확 하 게 고유 컨트롤 셀 (그림 2B)에서 PE CF594 전압을 조정 SSC, 대.
3. Mitophagy 셀의 비율을 평가
   1. 선형 눈금을 사용 하 여 PE CF594 점 플롯 대 BV605를 취득 합니다. 셀 마운트-Keima, 표현 주위 다각형 아이콘을 사용 하 여 게이트 그리고 하지 mt-Keima (그림 3A)를 표현 하는 세포를 제거. Mt Keima 형광 양성 세포 인구 "산 Keima" 문 이라고 합니다.
   2. PE-CF594 유일한 "산 Keima"를 보여주는 대 BV605의 다른 점 플롯 만들기-셀 문이. 이 점 플롯에서 치료 mt-Keima-긍정적인 세포 주위 게이트를 그립니다. 기저 mitophagy 활동 제어 헬러의 셀 낮습니다, 그리고 PE-CF594/BV605에서 방출의 비율은 1 보다 작은. 따라서,이 문 이라고 하는 "낮은" 게이트.
   3. "낮은" 게이트의 위의 영역을 포함 하는 다른 게이트를 그립니다. 이 게이트는 그것은 높은 mitophagy 활동, 즉, 셀 셀 PE-CF594/BV605 (그림 3B)에서 방출의 높은 비율을 포함 하기 때문에 "높은" 게이트 라고 합니다.
   4. "높은" 문 셀의 비율을 계산 하려면 "인구 계층 보기" 메뉴를 선택 합니다. 상위의 "%" (% 부모) 값 산-Keima-긍정적인 인구 중 "높은" 문 셀의 비율을 나타냅니다.
   5. "산 Keima" 중지 게이트에 기록 하 고 각 샘플을 실행 하려면 적어도 10000 이벤트를 설정 합니다.

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결과

헬러 Parkin 셀에 mitophagy CCCP 유도의 흐름 cytometry 분석의 예는 그림 4에 표시 됩니다. 위에서 설명한 흐름 cytometry 분석 방법을 사용 하 여, 우리는 "높은" 게이트 mitophagic 셀에 극적인 증가 검색할 수 있습니다. "높은" 문 셀의 백분율은 치료 제어 셀 (그림 4A)에 비해 10 배 이상 증가 했다. Mitophagy 활동에 있는이 증가 bafilomycin A (BFA) (<...

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토론

여기, 우리는 mt Keima을 표현 하는 세포에 세포 mitophagy 활동을 측정 하 cytometry 사용 하기 위한 신속 하 고 중요 한 방법을 제시. Mitophagy의 높은 수준을 겪고 셀 전시 PE CF594의 증가 비율 (561 nm) / BV605 (405 nm) 여기. 따라서, mitophagy 활동 높은 561/405 비율을 전시 하는 셀의 백분율로 나타낼 수 있습니다. 우리 PE CF594의 도트에 "높은" 게이트 영역에서 셀의 비율을 계산 (561 nm) BV605 대 (405 nm), 그리고 결과 CCCP ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
FBS	GIBCO	16000-044
penicillin/streptomycin	wellgene	LS202-02
PBS	Hyclone	SH30013.02
HEK293T	ATCC	CRL-3216
DMEM	GIBCO	12800-082
OPTI-MEM	GIBCO	31985-070
Turbofect	Thermos scientific	R0531
0.45 μm syringe filter	sartorius	16555
HeLa	ATCC	CCL-2
polybrene	Sigma-Aldrich	H9268	8 mg/ml
puromycin	Sigma-Aldrich	P8833	2 mg/ml
Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP)	Sigma-Aldrich	C2759	10 mM
trypsin-EDTA	wellgene	LS015-01
EQUIPMENTS
BD LSRFortessa	BD Bioscience	LSRFortessa
FACSDIVA	BD Bioscience	FACSDIVA (v8.0.1)