꼬마 선 충의 대규모 재배 플레이트 기반: 당뇨병에서 대사 변경의 연구에 대 한 샘플 준비

요약

이 프로토콜에서는 고체 미디어 꼬마 선 충 의 대규모 재배 하는 방법을 설명합니다. 액체 문화 하는 대신,이 프로토콜 플레이트 기반 재배 아래 다른 비늘의 매개 변수를 얻기 수 있습니다. 액체와 고체 미디어 문화 형태학 및 대사 차이 생략 하 여 결과의 comparability를 늘어납니다.

초록

한 천 배지에서 대규모 방식으로 꼬마 선 충 (C. 선 충)을 배양 시간이 많이 걸리는 및 어려운 수 있습니다. 이 프로토콜에는 서쪽 오 점, 질량 분석, 또는 추가 proteomics 분석으로 진행 하는 단백질의 격리에 대 한 동물의 많은 수를 간단 하 고 저렴 한 방법을 설명 합니다. 또한, immunostainings에 대 한 선 충 수의 증가 동일한 자란 조건 하에서 여러 분석을 통합 하 여 쉽게 구현할 수 있습니다. 또한, 여러 가지 실험 상황 판 사이의 전송을 촉진 된다. 플레이트 문화에서 일반적인 기술 백 금 철사를 사용 하 여 단일 C. 선 충 의 전송을 포함 하 고 채워진된 agar의 전송 청크 메스를 사용 하 여. 그러나, 선 충 숫자 증가 함께 이러한 기술을 지나치게 많은 시간이 소요 된다. 이 프로토콜의 선 충 C. 수많은 단계를 포함 하 여 벌레의 생리학에 샘플 준비의 영향을 최소화 하기 위해 대규모 문화를 설명 합니다. 및 전단 응력의 수명 및 C. 선 충, 따라서 안정적이 고 재현 가능한 결과 검색 하기 위해 중요 한 단계에 대 한 자세한 설명을 요구에서 대사 과정을 변경할 수 있습니다. C. 선 충 은 모델 유기 체 최대 1/3, 신경 세포의 구성 가능성을 전적으로 신경 변경 혈관 컨트롤의 독립적인 조사를 제공 따라서 혈관 부족. 최근, 당뇨병 성 망막 증의 초기 neurodegeneration 혈관 변경 전에 발견 되었다. 따라서, 선 충 C. 공부 하는 당뇨병 합병증의 일반적인 메커니즘에 대 한 특별 한 관심의 이다. 예를 들어의 증가 형성 고급 glycation 엔드 제품 (세) 그리고 반응성 산소 종 (선생님) 관찰 reproducibly C. 선 충에서 발견 되는. 프로토콜 처리 조사의 폭넓은 스펙트럼에 대 한 적절 한 크기의 샘플을 여기, 당뇨병 유발 생 화 확 적인 변경의 연구에 의해 exemplified 표시 됩니다. 일반적으로,이 프로토콜 유용할 수 있습니다 큰 C. 선 충 을 요구 하는 연구에 대 한 숫자와 어떤 액체 문화는 적합 하지 않습니다.

서문

서쪽 오 점 또는 질량 분석, 단백질 분석, 단백질의 밀리 그램을 해야합니다. 이 항복 C. 선 충, 달성 될 수 있다 액체 문화 또는 고체 미디어 전송 선 충에 세척 하 여는의 수백의 대규모 배양이 필요 합니다. 및 전단 응력 유도 상피 나트륨 채널 (ENaC), 나트륨, 잠재적으로 C. 선 충 의 수명을 변경 하 고 신진 대사 분석^{1에 영향을 미치는의 증가 된 통풍 관을 통해 삼 투 스트레스 증가 수의 표현} . 따라서, 플레이트-기반 접근 방식에 대 한이 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계 걸릴 계정에 실험적인 가변성에 영향을 미치는 스트레스의 감소. 액체 문화, 다른 한편으로, 선 충의 표현 형에 영향을 하 고 문화 및 nematodes²의 정확한 수의 컬렉션을 복잡 하 게. 또한, 반응 물질 미디어 구성 요소에 의해 변경 될 수 있습니다 그리고 선 충을 도달 하기 전에 하지 균등 하 게 배포할 수 있습니다. 액체 문화의 제한에 대해이 프로토콜 C. 선 충의 대규모 샘플을 경작 하는 양자 택일 접근을 제공 합니다.

C. 선 충 의 3 분 1의 모든 셀³의 만드는 302 신경 세포의 고유한 네트워크 모델 생물 이다. 많은 동종 과학에 그것의 소개부터 orthologous 유전자 기술, 의료 연구를 위한 모형으로 그것의 가치를 증폭 되었습니다. 최근, 당뇨병 성 망막 증, 혈관 손상, 앞에서 신경 장애에 대 한 증거^4를발표 되었습니다. C. 선 충 혈관, 부족 하지만 뚜렷한 신경 네트워크 포함 한다 혈관 그들 떨어져 신경 변경 조사를 적합 한 모델을 만드는. 따라서, 선 충 C. 공부 하는 당뇨병 합병증의 일반적인 메커니즘에 대 한 특별 한 관심의 이다. 당뇨병 합병증에 생 화 확 적인 변경 추가 혈당⁵응답에서 선생님의 형성에 영향을 미치는 나가의 형성을 포함 한다. 연령대와 신경 손상⁶을 C. 선 충 에서 발견 된다. 만성 질환은 당뇨병 합병증의 평가 함께 여기 exemplified 종종 그들의 근본적인 메커니즘의 평가 대 한 multiparametric 접근을 요구 하는 복잡 한, polygenic 프로세스 발생 합니다. 이 프로토콜 이후에 뿐만 아니라 동시에 여러 개의 매개 변수를 얻기 위해 사용 될 수 있습니다. 액체와 고체 미디어 문화 형태학 및 대사 차이 생략 하 여 증가 comparability 및 multiparametric 접근의 재현성을 얻을 수 있습니다.

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프로토콜

참고:이 프로토콜 5 개의 섹션으로 나누어져 있습니다. 섹션 1-3, C. 선 충 에 대규모 문화 주요 프로토콜 제공 됩니다. 섹션 4와 5 exemplified metabolites 당뇨병 대사 산물에서 발생의 평가 대 한 추가 프로토콜을 제공 합니다. 자세히 섹션 1 접시에는 일반적인 대규모 문화를 설명합니다. 섹션 2 섹션 3 대규모 샘플의 수확을 설명 하는 반면 C. 선 충, 대용량의 전송에 중점을 둡니다. 제 4 샘플에서 단백질 격리를 설명 하 고 섹션 5 후속 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 분석을 위해 견본 준비에 설명 합니다.

1. 대규모 문화 접시에

1. 일반적으로, 메 마른 후드 또는 오염 방지 하려면 화로 옆 작동 합니다.
2. 문화에 웜 젊은 성인 단계를 도달할 때까지 따라 다음 적응이 이전에 게시 프로토콜⁷ .
   1. 생활 OP50 대장균 박테리아를 사용 하 여 선 충을 먹이 400 µ M fluorodeoxyuridine agar (안 암 피 실린/FUdR) 실험에 대 한 준비.
   2. 동기 인구의 준비를 위해 unconcentrated OP50, 사용 하 고 성인과 실험 성공에 대 한 사용 하 여 3.3 집중된 OP50 x는 상쾌한의 70%를 제거 하 여.
   3. 매일 먹이 간격으로 것이 좋습니다. 산화 스트레스를 평가할 때는 다른 간격 및 먹이 대 한 볼륨 방해할 수 있습니다 결과.
   4. 접종, 여러 선 충과 접시를 받아 고 약 0.5 x 1 cm² 메스의 조각으로 잘라. 전송 unconcentrated OP50를 포함 하는 직경이 60 mm의 선 충 성장 미디어 (NGM) 접시에 2 ~ 3 조각.
   5. (야생-타입 N2 20 ° C에서 경작 한다) 변형에 대 한 적당 한 온도에 번호판을 품 어 계란은 접시에 표시 될 때까지.
   6. M9 버퍼의 2 mL와 함께 계란과 성인 동물의 대부분 떨어져 세척 하 고 15 mL 튜브에 수집. 2 분 동안 800 x g 에서 정지 원심 한편, 표백 솔루션을 준비 시작 합니다.
   7. Centrifuged 튜브를 꺼내와 10ml 피펫으로와 M9 버퍼를 제거. 성인 nematodes lysed 때까지 소용돌이에 표백 솔루션 및 믹스의 10 mL를 추가 합니다. 이 일반적으로 약 5-7 분, 하지만 15 분 이상 걸리지 않을 또는 계란 실험에 나중에 완벽 하 게 개발 하지 않습니다.
   8. 800 x g 2 분 세척 표백 솔루션에서 계란을 취소 10 mL M9 버퍼와 3 번에서 정지 원심
   9. 이제 OP50 접시에 달걀 서 스 펜 션의 150 µ L를 추가 합니다. 각 접시에 200-300 계란의 밀도 도달 한다. 선 충에 성숙한 단계를 도달할 때까지 기다립니다.
      참고: M9 버퍼 (pH 7.0) 묘사 된 실험에 사용 되는 다음 물질의 구성: 22 mM KH₂포₄, 42 m m 나₂HPO₄, 86 mM NaCl. 압력가 마로 소독 혼합물, 1mm MgSO4 추가 합니다. 표백 솔루션 0.5 M NaOH, 2.3 m m NaOCl 증류수에 해결을 포함 합니다.
   10. 준비 살 균 M9 버퍼, 상처로 살 균 피 펫 팁 팁 15 mL 튜브에 그들을 수집 하 고 웜, 씻어.
   11. 접시에 약 1 mL의 M9 버퍼를 적용, 부드럽게 버퍼 nematodes 접시에서 스윙 하 고 부드럽게 피펫으로 여 배포.
   12. 이제, 튜브에서 선 충을 수집 합니다. 잘라 피 펫 팁, (OP50와 시드) 접시에 직접 현 탁 액의 150 µ L을 적용 하 고 현미경으로 선 충의 밀도 평가 (권장: 60 m m 당 50-100 nematodes).
   13. 그들은 너무 조밀한 경우에, M9 버퍼와 현 탁 액을 희석 하 고 원하는 밀도이 때까지 현미경 평가. 수확량은 너무 작은 경우에, 정착 또는 액체를 제거 하려면 800 x g 에서 서 스 펜 션 10 s 원심 벌레를 하자.
       참고: 충분 한 밀도의 예 (거시적인) 그림 1A 및 1B (현미경) 20 X 확대에에서 주어진 다. 경험적으로 설명 된 대로 진행 합니다.
   14. 벌레는 신속 하 게 정착 하는 유의 하십시오. 판 사이 동등 하 게 분배 되도록 튜브 번호판 (번호판 4-5)의 모든 스택 후 반전.
       참고: 컷 뿐 아니라 부드러운 스윙 팁, 플라스틱 및 전단 응력을 감소, 플레이트의 세척.

2. 전송의 대용량의 꼬마 선 충

1. M9 버퍼, 나이 및 플레이트의 건조에 따라의 약 500 µ L와 선 충을 씻어. 동일한 버퍼를 사용 하 여 선 충을 분리 하는 동물의 대부분은에 수집 될 때까지 반복 합니다.
2. 천천히 잘라 피 펫 팁 nematodes을 차지 하 고 OP50와 함께 준비 된 접시에 그들을 전송. 접시 건조 하자.
   참고: 수 권장된 볼륨 보다는 훨씬 더 적용 하지 않도록 주의 하십시오. 특히 장기 실험 판 그것을 용납 하지 않을 수 있습니다 고 균열에 크롤 링 하는 선 충 수는 agar 끊을 수 있다.

3. 수확 한 대형의 꼬마 선 충 샘플

1. 선택한 방법에 따라 C. 선 충의 충분 한 양의 실험을 시작 합니다. LC-MS/MS 분석에 대 한 샘플 당 단백질의 적어도 200 µ g의 수익률을 보장 하기 위해 접시 당 약 100 nematodes 그룹 당 20 접시 (60 m m x 15 m m)를 준비 합니다.
   참고: 프로토콜의이 부분은 요구 하지 않습니다 작업 무 균 조건 하에서 더 이상, 선 충을 수집 하 고 고정 됩니다.
2. 샘플 컬렉션의 날, 스냅-동결 수집한 샘플을 액체 질소를 준비 합니다. 선 충 류의 신진 대사를 느리게 얼음에 비 살 균 M9 버퍼를 유지 합니다.
3. M9 버퍼의 1 mL를 적용 하 고 부드럽게 판 소용돌이 격판덮개에서 C. 선 충 을 씻어. 이 고 인된 선 충 및 대부분의 계란을 수집 하는 경우 어떤 존재, 그들은 박테리아와 agar에 충실 하기 때문에 피 한다.
4. 볼륨을 고 15 mL 튜브에 그것을 전송.
5. 전체 샘플 수집 후 정착 또는 800 x g 에서 짧게 튜브 원심 M9 버퍼의 대부분을 제거 하는 선 충에 대 한 기다립니다. 워시 샘플 3 m 9의 약 10 mL x (샘플 볼륨 x 10) 모든 박테리아를 제거 하.
   참고: 모든 고 인된 선 충 제거는 되도록 자당 부양 다른 옵션입니다. 그러나, 이것은 표시 된 실험¹⁵적합 이었다. 자당은 포도 당 및과 당을 분해. 묘사 실험에서 포도의 역할 만성 당뇨병에 생 화 확 적인 변화를 촉진에 평가 했다. 따라서, 자당 부양 잠재적으로 결과 혼동 수 있습니다.
6. 모든 샘플에 대 한 M9 버퍼의 1 mL와 함께 한 1.5 mL 튜브와 하나의 빈 1.5 mL 튜브를 준비 합니다. 15 mL 튜브에서 빈 1.5 mL 튜브 유리 피펫으로와 펠 릿을 전송. 이 단계는 양적 전송을 보장 하기 위해 중요 한.
   참고: 달리 이전 단계, 여기는 선 충은 더 집중. 플라스틱 피펫으로 팁을 가능한 준수 때문에 샘플의 큰 부분의 손실 예상 된다. 따라서 유리 펫 대신 사용 합니다.
7. 송금 후 유리 피 펫을 사용 하 여 두 번째 1.5 mL 튜브에서 M9 버퍼의 1 mL를 피펫으로 벽에서 선 충을 씻어 하 려. 또한, 15 mL 튜브에서 나머지 nematodes을 세척 하 고 샘플 튜브를 그들을 전송.
8. 1 분 동안 19000 x g 에서 샘플 튜브를 원심 하 고 가능한 많은 상쾌한 제거.
9. 튜브 Parafilm으로 밀봉 하 고 즉시 스냅-동결 그것은 액체 질소. Lysate 준비까지-80 ° C에서 튜브를 저장 합니다.

4. 단백질 질량 분석에 대 한 절연

참고: 여기에 설명 된 단백질 격리 또한 다른 분석 실험 (예를 들면, 서쪽 오 점)에 대 한 사용할 수 있습니다.

1. 냉동된 샘플에 0.5 m m 지르코늄 구슬과 lysate 버퍼를 포함 하는 성분을 억제 물 칵테일의 볼륨 x 적어도 2의 동일한 볼륨을 추가 합니다.
   참고: 선 충-단백질에 대 한 상관 관계를 묘사 분석 버퍼의 100 µ L를 사용 하 여 수행 했다. LC-MS/MS 샘플 버퍼의 200 µ L로 lysed 했다.
2. 속도 9에 1 분 동안 균질 화기를 시작 합니다. 샘플은 완전히 lysed 확인 합니다. 완전히 lysed 하지 경우이 단계를 반복 합니다.
3. 19000 x g에서 4 ° C에서 30 분 동안 샘플 원심 얼음에는 상쾌한 새로운 튜브를 전송 고 추가 측정 이동 하려고 때까지-80 ° C에서 그것을 저장 합니다.
   참고: 묘사 실험을 위해 사용 하는 비 변성 시키기 버퍼 다음 물질의 구성: 20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 1% 트라이 톤-X와 2 mM EDTA.
   참고:이 프로토콜을 제안된 규모를 적용 하는 데의 단계를 따라는 데, 약 1, 000 선 충에서 단백질 펠 릿의 수익률 약 500 µ g 이어야 한다. 더 많은 비교, 그림 2 및 대표 결과참조 하십시오.

5. 샘플 준비 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 측정

참고: 관심의 매개 변수에 따라 샘플 준비 달라질 것 이다. 이 프로토콜은 methylglyoxal 및 나이 결정에 초점을 맞추고.

1. 앞에서 설명한⁹로 1, 2-diaminobenzene (DB)와 derivatization에 의해 세포내 methylglyoxal를 측정 합니다.
   1. 얼음 처럼 차가운 20% (wt/vol) trichloroacetic 산 염화 나트륨 0.9% (wt/집)에서 20 µ L와 1.5 mL 튜브에 물 80 µ L 샘플 균질
   2. 내부 표준 5 µ L의 샘플을 스파이크 (¹³C₃MG, 400 nM), vortexing에 의해 그들을 혼합 하 고 다음 4 ° c.에서 5 분에 대 한 21000 x g 에서 원심
   3. HPLC 샘플 유리병 200 µ L 유리 삽입을 포함 하는 상쾌한의 35 µ L를 전송 합니다.
   4. 각 샘플 뒤에 0.5 m m 200 m m HCl 포함 된 0.5 m m diethylenetriaminepentaacetic (DETAPAC) 물에 있는 산에서에서 DB의 10 µ L를 3% 나트륨 아 지 드 (wt/vol)의 5 µ L를 추가 합니다.
   5. 빛 으로부터 보호, 실내 온도에 4 h에 대 한 샘플을 품 어.
   6. 앞에서 설명한⁹LC-MS/MS에 의해 샘플을 분석 합니다.
      참고: 나가의 측정을 위해 분리 단백질 프로토콜의 섹션 4에에서 설명 된 대로.
2. Bradford 분석 결과¹⁰를 사용 하 여 (해 동된) lysates의 단백질 농도 측정 합니다.
   1. 30 µ L의 aliquots 표준 곡선 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 다음과 같은 농도의 인산 염 버퍼 염 (PBS)에서 해결 된 아군에 대 한 준비: 0; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.6. 0.8; 그리고 1.0 mg/dL입니다.
      참고: 샘플은 제안 된 크기에서 준비 하는 경우 (버퍼의 200 µ L lysate의 준비에 대 한 단계 4.1 참조), 예상된 농도 약 2-7 mg/mL의 범위에 있어야 한다. 이 경우에 샘플 1: 10와 함께 PBS는 측정 전에 희석.
      참고:이 메서드를 사용 하 여 첫 번째 실험에 대 한 것이 좋습니다 다른 희석에 샘플을 측정 (1, 1:10, 그리고 1: 100). 선 충의 수의 아무 정확한 결심으로 수익률은 개별 연구자 사이 달라질 수 있습니다.
   2. 투명 한 96 잘 접시 (폴리스 티 렌)를 사용 하 고 각 표준 농도 우물에 중복에 선택한 희석에 샘플 10 µ L 플라스틱.
   3. 단백질 분석 결과 염료 시 약 집중 1:5 (aq증류수로 희석. dest.) 그리고 접시에 모든 샘플을 희석의 200 µ L를 추가. 실 온에서 10 분 동안 접시를 품 어.
   4. 595에서 30 분 이내 흡 광도 측정 플레이트 리더 nm. 예제 계산 된 표준 곡선에서 보간됩니다 될 수 있습니다. 방법의 자세한 내용은 문학¹⁰에 광범위 하 게 설명 했습니다.
3. 앞에서 설명한^11,12세포내 연령대를 측정 합니다.
   1. 총 단백질 추출 물 (약 200 µ g)을 씻어 10 kDa 원심 필터 단위에 ultracentrifugation에 의해 물으로 3 배.
   2. 복구 된 단백질 (약 100 µ L) 100 mM HCl의 10 µ L, 10 µ L의 펩 신 (2 mg/mL 20 m m HCl에에서), 그리고 티 (20 m m HCl 2 mg/mL)의 10 µ L을 추가 하 고 24 h에 대 한 37 ° C에서 샘플을 품 어.
   3. 중화 하 고 pH 7.4에 0.5 M 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)의 12.5 µ L을 추가 하 여 버퍼링 하는 샘플 및 5 µ L 260 m m 코의.
   4. 나 전자 [2 mg/mL 10 mM 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)]의 10 µ L을 추가 및 페니실린 스 솔루션의 10 µ L 24 h에 대 한 37 ° C에서 샘플을 품 어 고.
   5. Aminopeptidase [2 mg/mL 10 mM 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)]의 10 µ L을 추가 및 10 µ L의 prolidase [2 mg/mL 10 mM 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)에], 및 48 h 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.
   6. 앞에서 설명한¹²LC-MS/MS에 의해 결과 분석.

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결과

여기 대규모 C. 선 충 을 만드는 예제 문화 대 당뇨병 연구에 응용 되 게 됩니다. 그것은 관심 총 단백질 농도를 정상화 하기 보다 단일 동물 매개 변수 관련 된 될 수 있습니다. 선 충 수가 적은 요구 분석 결과에이 수행할 수 있습니다 쉽게 선 충을 계산 하 여. 대규모 C. 선 충 에 대 한 문화 관련 된 수백 개의 실험적인 그룹 당 선 충,이 방식은 편리.

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토론

이 프로토콜 양적 결과 얻기 위해 C. 선 충 의 대규모 경작에 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 제공 합니다. 문학에서 발견 대표 결과같이 복제 될 수 있습니다. C. 선 충 의 대규모 샘플의 컬렉션에 대 한이 정서의 똑 바른 앞으로 방법 같이 보인다, 비록 특정 함정을 계정에 걸릴 있다. 선 충 인구의 동기화에 대해이 프로토콜 선 충을 파괴 하 고 전적으로 계란을 수확 하는 염?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli OP50	CGC	n/a
C. elegans N2	CGC	n/a
C. elegans CL2166	CGC	n/a
Petri dish, 60 mm x 15 mm	Greiner One	628161
Volumetric pipet, glas, 10 mL	Neolab	E-0413
Proteinase inhibitor cocktail tablets	Roche	04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8	Sigma	T3253
Sodiumchloride (NaCl)	Sigma	S7653
Triton X-100	Sigma	X-100
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E5391
96-well plates, transparent bottom	Brand	781611
Infinite M200, plate reader	Tecan	30017581
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm	Next advance	ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogenizer	Next advance	BBX24
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P6887
Thymol	Sigma	T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus	Sigma	P6911
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P43339
Prolidase from Porcine Kidney	Sigma	P6675
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica	Sigma	A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merckmillipore	UFC501096
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.