말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 T 세포의 시 냅 스 인터페이스의 평가

요약

프로토콜 평면 지질 bilayers를 사용 하 여 시 냅 스 인터페이스를 형성 하는 기본 polyclonal 인간 T 세포의 기능을 연구 하는 기법을 설명 합니다. 우리 림프절과 주변 혈액에서 파생 하는 인간의 기본 T 세포의 차별 시 냅 스 형성 기능을이 기법을 사용 합니다.

초록

역학의 현재 이해 및 T-세포 시 냅 스 인터페이스의 구조 기능 지원 되는 유리 평면 bilayers 및 생체 외에서의 사용을 통해 주로 결정 되었습니다-파생 된 T-세포 복제 또는^{1,2 라인 ,,34}. 이러한 연구 결과 혈액에서 격리 또는 림프 기본 인간 T 세포에 적용 하는 방법 조직은 모른다, 분석⁵셀의 충분 한 수를 취득에 상당한 어려움 때문에 부분적으로. 여기 우리가 구축 활성화 및 접착 분자를 포함 하는 평면 지질 bilayers 멀티 채널 흐름 슬라이드를 이용 하는 기술 개발을 통해이 해결 합니다. 흐름 슬라이드의 낮은 높이 시 냅 스 인터페이스 형성의 동적과 립 방출의 속도 론을 공부 하 고 연구 함으로써 셀: bilayer 첨부 파일을 동기화 하기 위해 빠른 셀 침전을 촉진 합니다. 우리는 10 몇의 시 냅 스 인터페이스를 분석에이 접근을 적용 10⁵ 주 cryopreserved T 세포 림프 노드 (LN) 및 말 초 혈액 (PB)에서 절연 된⁴ . 결과 공개 소설 평면 지질 bilayer 기술 기본 인간 T 세포에서 혈액과 조직 건강과 질병의 맥락에서 파생 된의 생물 속성의 연구를 수 있습니다.

서문

T 세포의 기능 활동에 그들의 링크와 T 세포 면역 시 냅 스의 구조적 기능의 과학적 지식을 셀 라인의 연구에서 주로 생성 되 고 클론 PB에서 파생. 어느 정도 기본 T 세포에 관련 된 이러한 연구 결과에서 얻은에 혈액 또는 인간 림프 조직 남아 있다 불분명, 림프 및 다른 조직에서 T 세포의 시 냅 스 인터페이스는 지금까지 분석 되지. 중요 한 것은, 새로운 데이터 조직 상주와 림프 기관 파생 된 T 세포의 표현 형 및 PB^6,7에 비해 기능 활동에 큰 차이가 있을 수 있습니다 것이 좋습니다. 이 추가 기본 인간 T 세포에서 T 세포 시 냅 스 인터페이스의 기능을 더 잘 이해할 필요가 고형화 했다.

이 위해 악용 하는 멀티 채널 흐름 슬라이드를 T-셀/bilayer 인터페이스의 이미징 10⁵ 주 T 세포와 인간의 PB를 ln. 격리 수행에 내장 된 지질 bilayers 소설 미니 규모 접근 개발 했습니다. 이 새로운 기술은 더 나은 모델 하 고 vivo에서 세포 세포 상호 작용을 이해 하기 위해 기본 인간 T 세포 시 냅 스 인터페이스의 생물 속성의 연구를 수 있습니다.

프로토콜

헬싱키의 선언에 따라 연구 되었다. 모든 참가자에 게 서 얻은 서 면된 동의 하 고 혈액과 림프 노드 샘플 펜실베니아 대학 (IRB #809316, IRB # 815056) 기관 검토 위원회의 승인으로 인수 했다. 모든 인간의 과목 성인 이었다입니다. 코드 혈액 샘플을 친절 하 게 노동과 학과의 산부인과 토마스 제퍼슨 대학에서의 납품에 의해 제공 되었다. 모든 샘플 드 확인 했다입니다.

1. 절연 CD4의 이미지 분석에 대 한⁺ T 세포

1. 10⁷ 냉동 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 또는 림프 노드 단 세포 (LNMCs) 수집 된 샘플에서 포함 된 1 mL 약 수 동 살 균 후드에서 RPMI 페니실린/스와 글루타민 보충의 9 mL에 해 동된 셀을 추가 합니다.
   1. Centrifugate에서 4 ° C, 300 x g 에서 10 분 동안 셀 상쾌한, 발음 및 10%를 포함 하는 보충된 RPMI의 5 mL에 셀 resuspend FBS (완전 한 매체). 37 ° c.에 CO₂ 배양 기에서 하룻밤 셀을 품 어
2. 다음 날, 정화 CD4 부정적인 immunomagnetic 제조업체의 지시에 따라 상용 키트를 사용 하 여 정렬 하 여⁺ T 세포.
3. 갓 순화 CD4 수를 측정 하기 위해⁺ T 세포, trypan 블루 솔루션의 동등한 볼륨 세포 현 탁 액의 5 µ L를 혼합. 로드 셀 trypan과 hemocytometer 혼합물을 블루와 hemocytometer의 5 섹션 안에 라이브 셀.
4. 휴대폰 번호의 평균을가지고 고 원래 세포 현 탁 액에 있는 셀의 수를 결정: 셀/1 mL의 수 = 2 × 10⁴x 평균 수. 고립 된 세포의 총 수 너무 작은 경우 셀 계산 하지 않고 그대로 사용 합니다.
5. 10 분에 대 한 300 x g 에서 세포를 원심 및 10^{5에 분석 결과 버퍼 (20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2mm 나₂HPO₄, 5 m D-포도 당, 5 m KCl, 1 mM MgCl₂m m, 2 m m CaCl₂및 1% 인간 혈 청 알 부 민)에 그들을 resuspend < /c13 > 셀/50 µ L 이하로 실험에 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 (1-2 h) 세포를 유지 하 고.}
6. 관련 기관 지침에 따라 모든 생물 학적 폐기물의 처분.
7. 원하는 경우 컨트롤 셀 인구로 서, 탯 줄 혈액 PBMC에서에서 CD8 T 세포 활성화를 준비, 10 µ g/mL 및 1 µ g/mL에서 안티-CD3 및 안티 CD28 항 체의 혼합물으로 덮여 T25 문화 플라스 크에 완전 한 매체의 5 mL에 10⁷ 셀 장소 각각.
8. 다음 날, 플라스 크에서 활성화 코드 혈액 세포를 제거 그들을 씻어 1 x 신선한 매체를 완료 하 고 재조합 일리노이-2의 셀 확장 (100 U/mL) 2 주 동안.
9. 코드-혈액 CD8 정화⁺ T 세포의 부정적인 immunomagnetic 제조업체의 지시에 따라 상용 키트를 사용 하 여 정렬. 셀을 계산 하 고 LN 및 PB CD8 1.3-1.6 단계에 설명 된 대로 분석 결과 버퍼에 미디어를 교환⁺ T 세포.

2. 평면 지질 Bilayers의 준비에 대 한 구성 요소

1. ⁵설명 되어 있는 대로 리의 3 종류 준비: (a) 0.4 m m DOPC (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 리, (b) 0.4 m m DOPC 리 33 mol % 개 NTA를 포함 (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5- 아미노-1-carboxypentyl) iminodiacetic 산) succinyl] (염화 소금)) 지질, 4 mol %Biotinyl-모자-PE를 포함 하는 (c) 0.4 m m DOPC 리 (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(모자 biotinyl) (나트륨 소금)).
2. 앞에서 설명한⁵5% 카 세 인 솔루션을 준비 합니다.
   1. 초순의 100 mL에 카 세 인 분말의 5 g을 녹이 고 수산화 나트륨 10 M의 350 µ L을 추가. 2 시간, 실 온에서 사용할 수 있는 규모에 따라 느린 속도로 일반 자력에 모든 것을 저 어 하 고 4 ° c.에서 하룻밤 7.3 및 ultracentrifuge에서 4 ° c.에 100000 x g 2 h에 대 한 솔루션에 pH를 조정 0.22 μ m 살 균 필터는 상쾌한 필터링 및 솔루션-80 ° c.에 aliquots에 저장
      주의: 수산화 나트륨 용액 화학 화상을 일으킬 수 있습니다 하 고 눈과의 접촉에 따라 영구적인 실명을 일으킬 수 있습니다. 이 화학 제품 또는 그것의 솔루션을 다룰 때 고무 장갑, 안전 복과 눈 보호를 사용 합니다.
3. 앞에서 설명한 방법은⁸모노-bionylated 항 체 분자를 생산 하기 위해 biotin과 레이블 안티-CD3 항 체.
   1. 0.1 mg/mL에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 Biotin PEO4 NHS의 솔루션을 준비 합니다. 0.5 ml의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 100 mM 탄산수 소 나트륨을 포함 하는 항 체의 1 밀리 그램 Biotin PEO4 NHS 솔루션의 3.7 µ L를 추가 합니다.
   2. 실 온에서 2 h에 대 한 혼합물을 품 어. 알 렉 사 Fluor 488 NHS 에스테 르 DMSO에 10 mg/mL에서의 솔루션을 준비 합니다. 10 어 금 니 과잉에 Biotin PEO4 보 건국에 의해 표시 된 항 체에 알 렉 사 Fluor 488 NHS 에스테 르 솔루션을 추가 합니다.
   3. 정기적으로 자력에 느린 교 반으로 실 온에서 1 h에 대 한 혼합물을 품 어. 크기 배제 크로마토그래피를 사용 하 여 언바운드 염료를 구분 합니다.
   4. 280에서 항 체 용액의 광학 밀도 측정 하 여 항 체 농도 결정 nm (₂₈₀). 577에서 레이블이 지정 된 항 체의 광학 밀도 측정 nm (₅₇₇).
   5. 다음 수식을 사용 하 여 염료를 항 체 비율을 확인 합니다.
      
      참고: 제조업체의 프로토콜에서 추가 세부 정보를 찾을.
4. 앞에서 설명한^3,4,,910 초파리 식 시스템에서 재조합 형 수용 성 ICAM-1 단백질을 표현 한다.
   1. 복제, cDNA 인코딩으로 초파리 식으로 ICAM-1의 ectodomain pMT/V5-그는 그의 추가 재조합 단백질을 생산 하는 유도할 수 있는 metallothionein 모터와 벡터 C 터미널 끝에₆ 태그.
   2. 공동 transfect S2 셀 결과 ICAM-1 포함 플라스 미드와 G418 식 벡터. 안정적인 transfectants 슈나이더의 초파리 미디어 3 주 동안 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 및 0.5 mg/mL G418의 보충을 사용 하 여 선택 합니다. 혈 청 무료 곤충 매체에 셀을 확장 하 고 0.5 m m CuSO₄ 3 d와 단백질 발현을 유도.
   3. 문화 표면에 뜨는 배를 집중 하 고 앞에서 설명한¹¹로 접선 흐름 집중 장치를 통해 PBS에 대 한 dialyze.
   4. Covalently 고정된 안티-ICAM-1 단일 클론 항 체와 Sepharose를 포함 하는 열을 표면에 뜨는 집중된 문화를 적용 하 고 50mm 글리신 버퍼, pH 3.0으로 바인딩된 ICAM-1을 elute. 즉시 2 M Tris 버퍼, pH 8.0 eluted ICAM-1 단백질을 무력화.
   5. PBS, pH 8.0에 대하여 eluted 물자 dialyze 고 열 포함 Ni NTA agarose를 dialyzed 자료를 추가 합니다. 녹는 ICAM-1 200 mM 이미, pH 8.0 elute PBS 버퍼, pH 8.0에 eluted 소재 dialyze
   6. 레이블을 Cy5 NHS 에스테 르 제조 업체의 지시에 따라 정화 ICAM-1.
      참고: 최고의 마지막 염료 단백질 비율은 1:1입니다.
5. 팹 생산 papain 소화에 의해 안티-CD107a 항 체에서 조각 하 고 팹 정화 이온 교환 크로마토그래피³위에서 설명한 대로 의해 조각. 레이블 제조업체의 지시에 따라 알 렉 사 Fluor 568 NHS 에스테 르는 팹 조각.

3. 지원 되는 유리 평면 지질 Bilayers의 대형

1. 집중된 한 황산과 과산화 수소 30%의 60 mL 140 mL를 혼합 하 여 신선한 산 성 피 솔루션을 준비 합니다. 몸을 담글 하 여 그들 30 분 대기에 대 한 산 성 피 솔루션에 유리 coverslip 폴 리 프로필 렌가 위 형 집게와 흐름 슬라이드 유리 coverslips 세척.
   주의: 피 솔루션은 매우 강한 산화 제. 솔루션을 처리 하는 동안 항상 착용 안전 유리 또는 고글 또는 두꺼운 고무 장갑 함께 들고 방패를 기억 하십시오. 증기 두건에서 피 솔루션 에서만 작동 합니다. 폭발 수 있습니다으로 난방, 수송, 또는 언제 든 지 사용 하는 동안 그것을 동요 하는 하지 마십시오. 포함 하는 리드 구멍 유리 병에 고생 폐기물을 수집 합니다. 문의 적절 한 폐기물 활용에 대 한 제도적 인 안전 위원회.
2. 린스 세척된 coverslips 7 초순 순차적으로 신선한 물을 포함 하는 비 커에 그들을 전송 하 여 x. 설정 옆으로 물이 남아 있도록 젖은 coverslips 롤 건조 유리를 남겨두고 깨끗 한 유리 합니다.
   1. 또는, 진공 펌프에 연결 된 피 펫 팁을 사용 하 여 신중 하 게는 coverslips에서 나머지 물방울을 제거.
3. 살 균 후드에서 희석 다양 한 지질 bilayers 만들기 위한 liposome 믹스를 생산 하기 위해 수행 합니다. 첫째, DOPC 리의 37 µ L 3 µ L Biotinyl-모자-PE 리의 결합. 둘째, DOPC 리의 14 µ L 고 개-NTA 리의 15 µ L를 혼합. 셋째, 결승전 liposome 혼합물을 조작 하는 두 번째의 29 µ L를 첫 번째 믹스 1 µ L를 추가 합니다.
4. 살 균 후드 작업 공간 가까이 의해 건조 coverslips로 설정 합니다. 결승전 liposome 혼합물의 aliquot 2 µ L (단계 3.3 참조) 접착 슬라이드 채널의 중심에 정확 하 게. 즉시 고 매우 정확 하 게 정렬 깨끗 하 고 건조 coverslip 슬라이드 및 슬라이드의 끈 적 한 면에 coverslip 부드럽게.
   1. 하나 이상의 슬라이드를 준비 하는 경우 한 슬라이드에 한 번에 이후 작동 liposome 혼합물 빠르게 증발. 슬라이드를 뒤집어 놓고 형 폴 리 프로필 렌가 위 집게의 외부 반지를 사용 하 여 슬라이드, 슬립 누설을 방해 하기 위해 슬라이드에 단단히 연결 되어 있는지 확인 하는 coverslip의 주변 접촉에 부드러운 압력을 적용 합니다.
      참고: 깨고 나는 coverslip 크래킹을 피하기 위해 슬라이드의 채널에 대 한 누르지 마십시오.
   2. 다시 슬라이드를 설정 하 고 어셈블리의 외부 슬라이드에 bilayer 주위 영구 표시와 함께 그리기 4 점으로 coverslip 사이의 채널 슬라이드 드롭 처럼 보이는 형성된 된 bilayer의 위치를 표시 합니다.
5. 채널에는 액체의 첫 번째 주입, 전에 엔트리 포트와 출구 포트 다른 채널의 한 포트를 지정 하 고 실험을 통해이 지정을 유지 합니다.
6. 거품 형성을 방지 하려면 채널의 엔트리 포트에 직접 피펫으로 팁의 끝을 삽입 합니다. 천천히 따뜻한의 50 µ L를 채울 슬라이드의 채널 (적어도 룸 온도) 분석 결과 버퍼 (버퍼 구성에 대 한 1.5 단계 참조).
7. 0.5 M nickel(II) 염화 물 솔루션을 준비 합니다. 30 분 동안 37 ° C에서 물 욕조에 카 세 인 솔루션의 2 mL 약 수를 녹여 하 고 그것 200 µ M의 최종 농도에 니켈 염화 물 솔루션을 보완.
8. 먼저 채널의 엔트리 포트에서 카 세 인 솔루션의 100 µ L를 주입 하 고 즉시 pipetting으로 슬라이드에 출구 포트에서 100 µ L을 제거 하 여 있는 bilayers 워시. 각 채널의 입력 포트에 카 세 인 솔루션의 100 µ L를 주입 하 고 실 온에서 45 분에 대 한 슬라이드 배양 하 여 동일한 솔루션 bilayers 차단.
9. Aliquots Cy5-ICAM-1-그의₆ 와 streptavidin 단백질의 해빙 각 2 µ g/m l의 최종 농도에 분석 결과 버퍼에 단백질을 결합 한다. 20000 x g 및 모든 집계 제거 하 4 ° C에서 30 분 동안 솔루션 원심
10. Pipetting으로 슬라이드 채널의 출구 포트에서 차단 솔루션의 나머지 부분을 제거 합니다. ICAM-1와 streptavidin 엔트리 포트에 포함 된 솔루션의 100 µ L를 주사.
11. 실 온에서 45 분에 대 한 슬라이드를 품 어. 출구 포트에서 단백질 해결책의 어떤 과잉을 제거 합니다. 씻어 bilayer 2 채널의 입력 포트에 분석 결과 버퍼의 100 µ L를 먼저 주입 하 고 출구 포트에서 100 µ L를 즉시 제거 하 여 x.
12. 2 µ g/mL의 최종 농도에 분석 결과 버퍼와 알 렉 사-형 석-488-셔 서 반대로 CD3 항 체 희석. 슬라이드의 엔트리 포트에 항 체 솔루션의 100 µ L를 주사 하 고 실 온에서 45 분 동안 품 어. 출구 포트에서 단백질 해결책의 어떤 과잉을 제거 합니다. Bilayer 2 세척 단계 3.11에서와 같이 분석 결과 버퍼의 100 µ L x.

4. 평면 Bilayer와 T 세포 상호 작용의 이미징

1. 무대와 confocal 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경의 목표 온도 37 ° c.에 equilibrated 때까지 예 열 열띤된 무대에는 bilayer(s)와 함께 슬라이드를 설정 합니다. 잉크 자국에 따라 적절 한 위치에 무대를 이동 하 고 사 셔 서 ICAM-1 분자의 형광을 채용 하는 bilayer에 초점.
   1. Confocal 현미경에 대 한 61 X 목표 또는 100 X 목표를 사용 하 여 적절 한 필터 설정으로 TIRF 현미경에 대 한.
2. 과 립에 대 한 이미징 TIRF 현미경 분리, 알 렉 사 Fluor-568-표시 된 안티-CD107a를 추가 엔트리 포트에 세포를 주입 하기 전에 4 µ g/mL의 최종 농도에 세포 현 탁 액에 항 체 Fab 조각.
   1. 준비 된 CD4 resuspend⁺ T 세포 선 또는 PB 또는 코드에서 격리 혈액 및 슬라이드 채널을 포함 하는 bilayer의 엔트리 포트에 세포 현 탁 액의 50 µ L를 주입.
3. 주사 후 필드의 원하는 숫자와 30 분 동안 2 분 마다 x 각 필드 1의 이미지를 기록을 선택 합니다.
4. 밝은 분야, 반사 빛, 및 형광 채널 (알 렉 사 488와 Cy5)는 이미지 공초점 현미경의 이용. TIRF 모드를 사용 하 여 알 렉 사-형 석-488와 알 렉 사-형 석-568 형광와 Cy5 형광, 뿐만 아니라 밝은 필드 이미징, TIRF 현미경에 widefield.

5. 이미지 분석

1. 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 인수 이미지 분석. 전송 된 가벼운 이미지와 제외 클러스터와 눈에 띄게 손상 또는 apoptotic 세포 분석에서 셀 형태를 관찰 합니다. 생산적 bilayer 표면 (즉, 인터페이스에 알 렉 사-형 석-488 형광 (안티-CD3 항 체)를 축적 하는 세포)와 상호 작용 하는 셀에만 분석에 포함 됩니다.
2. 셀 bilayer 상호 작용의 개시 후 20 분에 셀 접착 영역의 크기를 결정 합니다.
   참고: 접착 지역 방해 반사 현미경 (IRM) 이미지에 셀 bilayer 인터페이스에서 개발 된 어두운 영역이입니다.
3. 셀 bilayer 인터페이스에서 차별 Cy-ICAM-1 분자 Cy5-ICAM-1 형광의 어떤 축적과 링 접합의 형성을 관찰 합니다. 누적된 ICAM-1 분자 두 개 이상의 연속 이미지에 접착 링 접합 형성, 세포는 주변 supramolecular 활성화 클러스터 (pSMAC)¹²개발로 같은 셀을 지정 합니다.
4. 셀에 가까운 근접에서 연락처 영역 밖에 배경 형광에 T 세포 bilayer 인터페이스에 알 렉 사-형 석-568 형광 강도 측정 하 여과 립 자료를 평가 합니다. Degranulating 셀 셀 배경의 알 렉 사-형 석-568 신호-를-적어도 1.3의 비율을 지정 합니다.

결과

첫째, 우리는 활성화 코드 혈액 파생 CD8에 의해 형성 된 시 냅 스 인터페이스의 구조를 비교⁺ T 세포 지질 bilayers에 노출 내장 중에서 전통적인 대규모 흐름 전지 시스템 (대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조)^{1 ,2,,34} 또는 멀티 채널 흐름 슬라이드. bi...

토론

여기에 설명 된 소설 기법 기존의 흐름 셀⁵ 평면 bilayers 구축 하는 데 필요한 유사한 시 약을 활용 하 고 수행 기본 인간 T 세포-bilayer 인터페이스^{3,4의 이미징에 성공적으로 적용 될 수 있습니다. ,15}. 기술은 형광 분자 사용법에 있는 뜻깊은 감소를 제공 하며 10-20는 흐름 셀 시스템⁵, 혈액 및 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD4 T cell isolation kit, human	Miltenyl Biotec	130-096-533
CD8 T cells Isolation Kit, human	Miltenyl Biotec	130-096-495
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375C
DOGS NTA	Avanti Polar Lipids	790528C
Biotinyl Cap PE	Avanti Polar Lipids	870273C
Human Serum Albumin	Octapharma USA	NDC 68982-643-01
sticky-Slide VI 0.4	ibidi	80608
Coverslips for sticky-Slides	ibidi	10812
Bioptech FCS2 Chamber	Bioptech	060319-2-03
anti-CD3 antibody	Thermo Fisher Scientific	16-0037-81	OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC
anti- CD28 antibody	Genetex	GTX14664	9.3 clone
Casein	Sigma	C5890
Biotin-PEO4-NHS	Thermo Fisher Scientific	21329
DMSO	Sigma	D2650-5
Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification	Thermo Fisher Scientific	A10235
Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification	Thermo Fisher Scientific	A10238
Amersham Cy5 NHS Ester	GE Life Science	PA15101
pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors	Thermo Fisher Scientific	V412020
pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection	ATCC	37409
Serum free Drosophial media Insect-XPRESS	Lonza	12-730Q
Hybridoma YN1/1.7.4	ATCC	CRL1878	The hybridoma secrets antibody against ICAM-1.
Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B	Sigma-Aldrich	C9142	Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody.
MasterFlex tangential flow concentrator	Cole-Parmer	77601-60 7592-40	Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Centramate Lab Tangential Flow Systems	Pall Laboratory	FS002K10 OS010T12 FS005K10	Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Ni-NTA Agarose	QIAGEN	30210
Dialysis tubing	Spectra/Por	131384
Papain from papaya latex	Sigma	P3125
mouse anti-human antibody against CD107a	BD Bioscences	555798	Clone H4A3
Ansell Natural Blue Gloves	Fisher Scientific	19-014-539
Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps	Thermo Fisher Scientific	6320-0010
Streptavidin	ProZyme	SA10
Confocal microscope	Nikon		Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60X oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table
TIRF microscope	Andor		Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS)
MetaMorph Premier Image Analysis Software	Molecular devices