성인 마우스 지 루트 신경 절의 Electroporation Vivo에서 조사 포유류 축 삭 재생:

요약

Electroporation 셀에 관심사의 유전자를 전달 하는 효과적인 접근 이다. 적용 하 여이 접근에서 vivo에서 성인 마우스 지 루트 신경 절 (DRG)의 신경에, 축 삭 재생 비보를 공부 하는 모델을 설명 합니다.

초록

Electroporation 세포로 DNA 플라스 미드 또는 작은 RNA 분자를 소개 하는 필수적인 비 바이러스 성 유전자 transfection 접근 이다. 지 루트 신경 절 (Drg)에 감각 신경 두와 단일 축 삭을 확장합니다. 1 개 분 지가 주변 신경 (주변 지점), 그리고 다른 지점 입력 지 루트 (중앙 지점)를 통해 척수. 신경 손상 후 주변 지점 중앙 지점에 다시 생성 하지 않습니다 반면 견고 하 게 재생성 합니다. 높은 재생 능력으로 인해 감각 축 삭 재생 널리 사용 되었습니다 모델 시스템으로 서 말 초 신 경계 (PNS)에 중앙 신경 조직 (CNS) 포유류 축 삭 재생을 공부. 여기, 우리는 성숙한 감각 뉴런에서 vivo에서 electroporation 통해 유전자 발현 조작 하 이전 설립된 접근 프로토콜을 설명 합니다. Transfection 플라스 미드 또는 작은 RNA oligos (siRNAs 또는 microRNAs)을 바탕으로, 접근 방식 모두 손실 및 이득-의-기능 실험 연구 관심사의 유전자 또는 축 삭 재생 비보의 규제 microRNAs의 역할을 수 있습니다. 또한, 유전자 표현에 vivo에서 의 조작 제어할 수 있습니다 공간 및 일시적으로 비교적 짧은 시간 과정 내에서. 이 모델 시스템은 포유류 축 삭 재생 규제 vivo에분자 메커니즘을 조사 하는 독특한 도구를 제공 합니다.

서문

신경 외상으로 인 한 신 경계에서 부상 또는 다양 한 신경 퇴행 성 질환은 보통 모터, 감각 및 인지 기능에 결함에 결과. 최근, 많은 노력 복원 생리 functionsof 부상 신경^1,2,3성인 신경 재생 효능 다시 설립에 헌신 하고있다. DRG에 감각 신경은 통증, 온도, 터치, 또는 몸 자세, 뇌 등 다른 감각 자극을 전달 하는 신경 세포의 클러스터. 이러한 뉴런의 각각 의사 유 니 폴라 이며 주변으로 확장 한 분기와 척수⁴향하고 다른 분기를 분기 하는 단일 축 삭을 포함 합니다. Drg의 성인 감각 신경 세포는 부상 후 적극적으로 그들의 축 삭을 재생성 하기 위해 알려진 몇 가지 성숙한 포유류 뉴런 중입니다. 따라서, 감각 축 삭의 상해는 광범위 하 게 고용 되었다 중요 한 모델로 axonal 재생 비보의 메커니즘을 연구.

Vivo에서 유전자 transfection 기법, 일반적으로 덜 설정 시간과 유전자 변형 동물을 사용 하 여 보다는 유전자의 기능을 공부 하 고 신 경계에 경로 신호에 필수적인 역할을 연주 하고있다. 주요 기술 두 가지 방법으로 분류 될 수 있다: 악기 및 바이러스 기반⁵. 성인 신경 세포에 유전자 배달 vivo에서 바이러스 성 기반 유전자 식⁶의 정확한 spatiotemporal 조작을 제공할 수 있습니다. 그러나, 노동 집약적인 프로세스는 바이러스-기반 방법, 생산 등 원하는 유전자를 포함 하는 바이러스 성 입자의 정화에서에서 포함 된다. 또한, 많은 바이러스 성 벡터 데이터 수집, 데이터 분석을 방해 하 고 실험 결과의 해석 가능성이 오해 수 있습니다 호스트의 면역 시스템을 활성화 수 있습니다. Electroporation, 일반적인 악기에 기초를 둔 transfection 접근 유전자 벡터 또는 세포^{7 외부 공간에서 작은 RNA oligos의 호의 정도, 세포와 핵 막의 침투성을 증가 하는 전기 펄스를 사용 하 여} . 생체 외에서 electroporation 널리 많은 세포 유형에 타겟된 유전자 발현을 조작 하기 위한 과도 하지만 매우 효율적인 전략으로 인식 된다. Vivo에서 electroporation만 일시적인 유전자 발현 바이러스 성 벡터에 비해 낮은 transfecting 효율 리드, 바이러스 접근 다양 한 장점이 있다. 예를 들어, 그것은 거의 모든 조직 및 세포^7,,89에 적용할 수 있습니다. 또한, 특정 성적 증명서에 대 한 관심사의 유전자 또는 작은 RNA oligos (예: siRNAs, microRNAs) 인코딩 중 플라스 미드 대상 조직에 직접 주입 하 고 수 다음 전기적 펄스, 절차 하 게 하는 더 적은 노동-고 시간-소모입니다. 또한, 여러 개의 플라스 미드 및 단일 electroporation와 동시에 RNA oligos transfecting 가능 하다.

우리 성인 마우스 감각 신경 세포에 유전자 발현 조작 하 비보에 electroporation 접근 설립 및 성공적으로 적용 하 고 수많은 개척자 연구^{1,2,3 같은 접근 검증 ,8,10}. 여기, 우리 포유류 축 삭 재생의 미래 연구를 위한이 방법의 사용을 촉진 하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시.

프로토콜

모든 동물 실험 동물 프로토콜 존스 홉킨스 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인에 따라 수행 했다.

1. 재료 및 시 약

1. 동물
   1. 6 주 된 여성 CF1 쥐 실험에 대 한 30-35 g의 무게를 사용 합니다.
      참고: 쥐 그룹 보관 (5 쥐 감 금 소 당) 1/4"옥수수 옥수수 속 침구와 2" 광장 nestlets 중첩에 대 한 개별적으로 통풍이 소독 장에 있었다. 감 금 소 제어 12 h 빛 어두운 주기의 유지 되었다 그리고 실내 온도 19.4 ° C와 25 ° C 사이 생쥐는 글로벌 설치류 다이어트와 시스템을 공급 하는 자동 물 먹이 했다.
2. 악기
   1. 다음과 같은 수술 도구를 사용 하 여 효율적으로 수술을 실시: 일회용 주사기 (27 G, 1.0 mL) 복 주입, 클리퍼, 스테레오 해 부 현미경, 마이크로 수술 집게, 마이크로 수술이 위, 그리고 작은 뼈 rongeurs 모피 그리고 소독된 직 스폰지입니다.
      참고: 모든 악기와 자료는 수술 전에 압력가 또는 생산자에 의해 전 멸 균. 수술 동안 악기 75% 알코올 살 균을 유지 하기 위해 뿌리는.
3. 마 취 솔루션
   1. 마 취 솔루션 # 1을 사용 하 여 마 취 유도 및 DRG 주입 하기 전에 마 취 솔루션 # 2를 사용 하 여 마 취를 유지.
      1. 마 취 솔루션 # 1을 하려면 마 취 제 및 xylazine 10 mg/mL 및 1.2 mg/mL의 최종 농도에 멸 균 식 염 수에 희석.
      2. 마 취 솔루션 # 2을 하려면 avertin 20 mg/mL의 최종 농도에 멸 균 식 염 수에 희석.
4. 플라스 미드 DNA 및 RNA Oligos
   1. 따라 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 키트를 사용 하 여 플라스 미드를 준비 합니다. 플라스 미드 DNAs 2.0 µ g / µ L의 농도에 살 균 이온된 수에 희석.
   2. 0.005-0.01의 최종 농도 도달 빨리 녹색 염료 솔루션 추가 % (v/v) 주입 중 DRG 개요의 더 나은 시각화.
   3. 최종 농도 50 µ M에 도달 하는 제조사에서 제공 하는 해당 버퍼에 siRNA 또는 예측에 관한 oligos을 디졸브.
5. 마이크로 주입 피 펫
   1. 당겨 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 모 세관 유리 하 고 미세가 위는 대략 50 µ m 외부 직경으로 개방을 생성 하기 위해 가져온된 모 세관 유리 피 펫의 끝을 잘라. 다음 약 20-30 분 동안 깨끗 한 벤치에 UV 빛에서 유리 피 펫을 살 균.
   2. 멸 균된 유리 피 펫 피 펫 홀더에 세포내 microinjection에 연결 하는 마운트 시스템을 분배. 30 psi의 압력 및 기간 8 ms에서 microinjection 시스템의 매개 변수를 설정 합니다.
6. Electroporation 시스템
   1. 구형 파 electroporation 시스템에 전극을 연결 하 고 다음 매개 변수를 설정: electroporation 비보에 대 한 950 ms 간격 35 V 15 ms 펄스.
7. 관류 및 솔루션을 해결
   1. 1 x 4% (w/v)의 농도에 PBS에 paraformaldehyde (PFA) 분말을 용 해. 4 ° c.에 PFA 솔루션 저장

2. 실험 절차

1. L4 그리고 L5 Drg의 외과 노출
   1. 마 취 솔루션 #1 이전 (와 케 타 민 100 mg/kg 몸 무게 xylazine 12 mg/kg 체중) 준비의 복 주사를 사용 하 여 마우스 anesthetize
   2. 털 깎기로 외과 영역을 면도.
      참고: 왼쪽된 좌 골 신경 호감에 대 한 다른 수술 될 것입니다, 이후 왼쪽된 후부 허벅지의 모피 수 있습니다 수 면도 동시에.
   3. 열띤된 담요 (35.0 ° C)에 마우스를 놓고 온도 프로브와 직장 온도 모니터링 합니다.
   4. 마 취를 테스트 하려면 발가락과 마우스의 꼬리를 꼬 집 고 행동 반응 관찰.
   5. 코르크 판에서 마우스의 4 개의 사지를 테이프.
   6. 외과 영역을 iodophor 솔루션 그리고 피부를 절단 하기 전에 iodophor 제거 하려면 75% 알코올로 닦아냅니다.
   7. 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.
   8. 절 개를 하기 전에 좋은 마커 펜으로 장 골 볏의 양쪽 모두를 표시 합니다. L5 Drg의 위치 식별 용이 하 장 골 볏의 두 점을 연결 하는 선을 그립니다.
   9. 마이크로-가 위 낮은 뒤로의 중간 선 따라 3cm 절 개를 확인 합니다. 또한, paraspinous 근육 생쥐 multifidus 등 생쥐 longissimus lumborum S1 spinous 프로세스, L3에서 분리 하 고 L4-5와 L5-6의 패싯 관절을 노출.
   10. L4-5와 L5-6의 패싯 관절을 제거 하는 마이크로-rongeur를 사용 합니다. 또한, L4 및 L5는 Drg의 등 쪽 노출의 왼쪽된 신경 아치를 제거 합니다.
2. DRG 주입
   1. 주입 마 취 솔루션 #2 (200 mg/kg 몸 무게 avertin) DRG 주입 하기 전에 마 취를 유지 하는 것을 intraperitoneally.
   2. 유리 모 세관 피 펫에 플라스 미드 DNA 또는 RNA oligos (DRG 당 1 µ L)를 로드 합니다.
   3. 신중 하 게는 DRG에 모 세관 유리 피 펫의 끝을 삽입 합니다.
   4. 점차적으로 삽입 DNA 플라스 미드의 1.0 µ L 솔루션 또는 세포내 microinjection를 사용 하 여 DRG에 RNA oligos 분배 시스템 (30 psi, 8 ms).
      참고: 주사의 지속 시간 5 분 이상 지 속해야 한다.
3. Electroporation
   1. 전극의 팁에 PBS를 드롭.
   2. 멸 균된 평방 면 거 즈와 출혈 정리.
   3. 부드럽게 전극과 대상 DRG를 꼬 집으 십시오 고 electroporation 시스템 5 사각 전기 펄스를 적용 합니다.
   4. 근육과 피부 레이어 각각 5-0 나일론 봉합을 닫습니다.
   5. 그것은 완전히 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 세심 한 관심 아래 온수 담요 (35.0 ° C)에 마우스를 놓습니다. 후 마 취에서 완전히 복구는 홈 케이지를 마우스를 반환 합니다.
      참고: 마우스를 37 ° C 담요에 마 취에서 완전히 복구에 대 한 약 60 분 소요 됩니다. 수술 후 통증 완화를 매일 먹이 대 한 1000 ml 물 (0.2 mg/ml)로 1 알 (200mg)이 부 프로펜을 디졸브.
4. 좌 골 신경 호감
   1. (실험 설계)에 따라 2 ~ 3 일 후에 DRG electroporation 마우스 마 취 솔루션 #2 (400 mg/kg 몸 무게 avertin)와 intraperitoneally anesthetize.
   2. 코르크 판에서 마우스의 4 개의 사지를 테이프.
   3. 중간 선 따라 왼쪽에 1cm 절 개를 0.5 c m를 확인 합니다. 경도 대 둔 근 근육과 piriformis 근육, 등 근육을 잘라. 큰 좌 골 구멍 및 좌 골 노치 사이 좌 골 신경의 세그먼트를 표시 합니다.
   4. 호감 12 s와 마크는 10-0 나일론 epineural 봉합으로 호감 사이트에 대 한 미세 집게와 신경. 호감 사이트를 표시 하는 경 막 막에 매듭을 만듭니다.
   5. 5-0 나일론 봉합 근육과 피부 레이어를 닫습니다.
   6. 그것은 완전히 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 세심 한 주의와 온수 담요 (35.0 ° C)에 마우스를 놓습니다. 후 마 취에서 완전히 복구는 홈 케이지를 마우스를 반환 합니다.
      참고: 마우스를 37 ° C 담요에 마 취에서 완전히 복구에 대 한 약 60 분 소요 됩니다. 수술 후 통증 완화를 매일 먹이 대 한 1000 ml 물 (0.2 mg/ml)로 1 알 (200mg)이 부 프로펜을 디졸브.
5. 마우스 관류, DRG와 좌 골 신경 수확
   1. 좌 골 신경 후 2 ~ 3 일 (실험 설계)에 따라 호감, 마 취 솔루션 # 2와 intraperitoneally 마우스를 anesthetize.
   2. 뒤에 PBS에 얼음 4 %paraformaldehyde (PFA) (pH 7.5) PBS (pH 7.4)와 마우스 transcardially perfuse
   3. 관류, 후 마이크로 위 및 해 부 현미경 아래 마이크로 포 셉으로 신경 뿌리 및 좌 골 신경 무릎 앞 Drg을 신중 하 게 구분 합니다. 좌 골 신경 4% PFA 4 ° c.에서 하룻밤에 직접 배치
6. 이미징 및 측정 형광 표시 감각 축 삭
   1. 연결 된 조직 및 마이크로 위 및 해 부 현미경 아래 신중 하 게 마이크로 포 셉 고정된 좌 골 신경에 막 떨어져 스트립. 다음, 4% 교환 PBS와 세척 PFA 신경 3 번.
   2. 좌 골 신경을 슬라이드에 놓고 그것을 똑바로 유지 합니다. 그것에 coverslip 누워 다음 신경 주위 antifade 솔루션의 80 µ L를 추가 합니다. 압력을 가진 전체 탑재 된 조직에 평평 하 게.
   3. flattened 조직 모자이크 수집 및 이미지 처리에 대 한 액세서리를 갖춘 거꾸로 epifluorescent 현미경에 놓습니다.
      참고: 여기 및 방출 길이 488 nm와 509 nm. 그것은 또한 여러 개의 이미지를 겹치는 수동으로 플러그인 모자이크와 함께 ImageJ를 사용 하 여 이미지를 꿰 매 고 수입니다.
   4. 재생성 된 축 삭의 길이 측정 하면 모든 identifiable fluorescently 표시 된 축 삭 원심 축 삭 끝에 호감 사이트 (10-0 epineural 봉합으로 표시)에서 좌 골 신경에 추적.

결과

세포 독성 transfection DRG electroporation vivo에서 의 속도가 높은 만큼, 우리 주입의 유효성을 검사 하 고 현재 프로토콜 및 electroporated 붙일 태그가 예측에 관한 siRNA L4 및 L5 Drg로 계량 하기. 분리 된 Drg cryo 단면화 및 immunohistochemistry (그림 1A-B)를 통해 처리 되었습니다. 주입 및 electroporation 후 세포 생존 율을 추정, L4와 L5에서 그대로 Drg ?...

토론

여러 수술 단계 특히 주의 필요합니다. L4 그리고 L5 Drg (somas의 위치), 좌 골 신경 지배, 올바르게 식별 하 고 유전자 구조와 주입을 해야 합니다. 그렇지 않으면, GFP 레이블링 됩니다 결 석 좌 골 신경 축 삭에. 장 골 볏 L4 및 L5 Drg를 정확 하 게 유용한 해부학 적 랜드마크로 서 볼 수 있습니다. 대부분의 마우스에 L5, L6 척추 사이 관절 면은 장 골 볏¹²인접. 또는, L3 DRG 선택할 수 있습?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECM 830 Square wave electroporation system	BTX Harvard Apparatus	45-0052	For in vivo electroporation
Tweezertrodes electrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0524	For in vivo electroporation, 1 mm flat
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Glass Capillary Puller	NARISHIGE	PC-10
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	1902328
Stereo Dissection Microscope	Leica	M80
Microsurgery Rongeur	F.S.T	16221-14
Microsurgery Forceps	FST by DUMONT, Switzerland	11255-20	Only for sciatic nerve crush
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm, standard wall
Tape	Fisherbrand	15-901-30	For fixing the mouse on the corkboard
2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin stock solution
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Avertin stock solution
siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC003	Non-target siRNA with fluorescence
microRNA Mimic Transfection Control with Dy547	Dharmacon	CP-004500-01-05	Non-target microRNA with fluorescence
Plasmids preparation kit	Invitrogen Purelink	K210016	GFP-coding plasmid preparation
Fast Green Dye	Millipore-Sigma	F7252	For better visualization of the DRG outline during injection
Ketamine	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	Anesthesia induction
Xylazine	AnaSed	NDC 59399-110-20	Anesthesia induction
Acetaminophen	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	Post-surgical pain relief