생체 외에서 Hypopigmentation 활동의 정량화

요약

체 외 화학 물질의 hypopigmentation 활동을 평가 하기 위한 세 가지 실험 방법 설명: 1) 셀룰러 tyrosinase 활동과 2) 멜 라 닌 콘텐츠, 및 3) 멜 라 닌 세포의 멜 라 닌 얼룩 및 이미지 분석에 의해 측정의 정량화.

초록

이 연구는 생체 외에서 hypopigmentation 활동의 정량화에 대 한 실험실 방법을 선물 한다. Melanocytes에 주요 안료 멜 라 닌은 여러 세포와 환경 요인에 대 한 응답에서 합성 됩니다. 멜 라 닌 자외선 손상 으로부터 피부 세포를 보호 하지만, 또한 생물 및 생 화 확 적인 기능을가지고. 과도 한 생산 또는 축적 melanocytes에 멜 라 닌의 주 근 깨, 검 버섯, melasma, 사마귀 등 피부 문제를 일으킬 수 있습니다. 따라서, hypopigmentation 에이전트 melanogenesis 제어 임상 또는 화장품 요구와 개인에서 중요 하다. 멜 라 닌은 주로 외부 영향 melanogenesis 라는 복잡 한 생 화 확 적인 과정에 내재 성 요인, 호르몬, 염증, 나이, 등 자외선 빛 노출 melanocytes melanosomes에 합성 됩니다. 우리는 화학 물질 또는 melanocytes에 자연 물질의 hypopigmentation 활동을 결정 하는 세 가지 방법을 설명: 1) 셀룰러 tyrosinase 활동 및 2) 멜 라 닌 콘텐츠 및 이미지 3) 얼룩과 측량 셀룰러 멜 라 닌의 측정 분석입니다.

Melanogenesis에서 tyrosinase L-티로신 그리고 dopaquinone로 3, 4-dihydroxyphenylalanine (l 아미노산의 일종)으로 변환 하는 속도 제한 단계 catalyzes. 따라서 tyrosinase의 저해는 기본 hypopigmentation 메커니즘입니다. 교양된 melanocytes에 tyrosinase 활동 기판으로 아미노산의 일종을 추가 하 고 dopaquinone 생산 분 광 광도 법으로 측정 하 여 측정할 수 있습니다. Melanogenesis 또한 멜 라 닌 콘텐츠를 측정 하 여 측정할 수 있습니다. 포함 하는 멜 라 닌 세포 일부는 NaOH와 함께 추출 되 고 멜 라 닌 spectrophotometrically 계량. 마지막으로, 멜 라 닌 콘텐츠 폰 타나-마 송 멜 라 닌의 얼룩이 다음 이미지 분석에 의해 측정할 수 있습니다. 이러한 생체 외 분석 실험의 결과 항상 복제 될 수 없다 인간의 피부에, 비록 이러한 메서드는 널리 특히 잠재적인 hypopigmentation 활동을 식별 하는 초기 단계로 melanogenesis 연구에 사용. 이 방법 또한 melanocyte 활동, 성장과 분화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 세 가지 다른 방법으로 일관 된 결과 효과의 유효성을 확인합니다.

서문

멜 라 닌은 생리학, 병리학, 피부, 눈, 뇌¹등 여러 장기의 독성에 중요 한 역할을 한다. 멜 라 닌의 주요 기능 사진 심사 및 생 화 확 적인 효과가 있습니다. 멜 라 닌 근처-적외선과 보이는 빛으로 자외선 (UV) 방사선, 짧은 파장의 빛;에서 증가 흡수 속도와 흡수 따라서, 멜 라 닌 가시광선 이나 자외선 방사선²로 인 한 손상 으로부터 조직을 보호 합니다. 멜 라 닌은 항 산화 및 금속과 다른 독성 화학 물질;에 대 한 선호도 따라서, 그것은 산화 화학 스트레스³에서 조직을 보호할 수 있습니다. 그러나, 멜 라 닌의 과도 한 생산 피부 문제를 발생합니다.

피부와 홍 채에 있는 melanin의 품질과 수량은 아이리스와 피부 색깔의 가장 중요 한 결정 요인. 개인은 다른 피부 색깔 기본 설정; 있을 수 있습니다. 다른 더 가벼운 피부 색깔을 선호 하는 동안 일부 검게 그을린된 피부를 선호 합니다. 이러한 소비자 프로 파일에 따라 hypopigmentation 화장품 선호 피부 색상⁴에 대 한 개별 시장을 만족 시키기 위해 개발 되었습니다. 따라서, hypopigmentation 및 안티 melanogenic 활동의 연구 모두 과학적으로 그리고 실제적으로 중요 하다.

Melanogenesis는 멜 라 닌 생 합성 효소 및 자발적인 화학 반응을 melanocytes에 일련의 복잡 한 프로세스입니다. 한 melanocyte 약 36 keratinocytes 둘러싸여 있으며 melanocytes 이웃 keratinocytes 그들의 제품을 배포 하는 멜 라 닌 합성 공장. 피부에 멜 라 닌을 생산 하 고 melanocytes의 melanosomal 구획에 저장 dendrites 통해 표 피에에서 인접 keratinocytes에 수송 된다.

L-티로신 melanogenesis 및 효소 tyrosinase 초기 기판 catalyzes L-티로신 그리고 dopaquinone로 3, 4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)으로 변환 하는 두 개의 연속 반응을 제공 합니다. 이러한 반응 속도 제한 단계 melanogenesis^5,6에 있습니다. 따라서, hypopigmentation 활동 세포 tyrosinase 활동을 직접 평가 하 여 먼저 측정할 수 있습니다. 이렇게 하려면 melanocyte 추출 tyrosinase를 포함 하는 인 큐베이 팅 DOPA와 및 dopaquinone 샘플에서 475에 분 광 광도 법으로 측정 될 수 있다 nm. 값은 샘플, 및 컨트롤에 비해 적은 dopaquinone 형성에 hypopigmentation 활동 결과와 물질의 단백질 농도 의해 정규화 됩니다.

둘째, hypopigmentation 활동 교양된 melanocytes에 멜 라 닌을 직접 측정 하 여 측정할 수 있습니다. 시험 체와 세포 치료, 후 멜 라 닌 알칼리 조건 하에서 추출 되 고 멜 라 닌 콘텐츠 400 분 광 광도 법으로 정량 nm. Hypopigmentation 에이전트 컨트롤⁷보다 더 낮은 melanin 내용을 발생 합니다.

마지막으로, hypopigmentation 활동 폰 타나-마 송 melanin 얼룩 및 후속 이미지 분석 하 여 측정할 수 있습니다. 폰 타나-마 송 얼룩에 멜 라 닌과 립을 보이는 검은 금속 상태로 암모니아-실버 질산염을 줄일 하 고 미세한 이미지 셀의 검정 영역은 멜 라 닌의 양을 나타내며.

Hypopigmentation 에이전트 보통 제공 일관 되 고 비교 결과이 세 가지 방법으로는 물질의 활동 올바른지 확인 합니다. 또는, 그것은 주요 유전자와 단백질 melanogenesis hypopigmentation 활동을 조사 하는 시험 물질에 대 한 응답에서에 식을 측정 하기 유용할 수 있습니다. Tyrosinase, 뿐만 아니라 tyrosinase 관련 (TRP-1) 단백질과 dopachrome tautomerase (TRP-2) melanogenesis⁸에 중요 한 효소는. 녹음 방송 요인 microphthalmia 관련 된 전사 요소 (MITF) melanogenesis는 유전자/단백질 식 레벨의 정량화에 마스터 레 귤 레이 터 또는 발기인 활동 분석 결과 hypopigmentation 활동을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 매체, 화합물, 및 시 약의 준비

1. B16F10 성장 전체 매체를 준비 합니다. 보충 Dulbecco의 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 (해충)이 글의 중간 (DMEM) 수정.
   1. 완전 한 매체의 500 mL을 FBS와 1 패 멸 균된 유리병에 해충의 5 mL 50 mL와 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM)의 445 mL를 혼합 한다. 부드럽게 혼합 후 새로운 소독된 유리 병을 4 ° c.에 다음 저장소 0.2 µ m 병 상위 필터를 통해 매체 필터링
      주의: 모든 셀 문화 기술은 미생물 안전 무 균을 보장 하기 위해 무 균 기술을 사용 하 여 캐비닛에 이루어져야 한다.
2. 세포의 용 해 버퍼 준비: 0.1% 트라이 톤 X-100 (v/v) 버퍼 pH 7.5 (pH 조정 HCl)를 포함 하는 20 m m Tris (hydroxymethyl) aminomethane. 3 개월 동안이 버퍼를 사용할 수 있습니다 (RT) 실내 온도에 저장 될 때. Protease 억제제 사용 하기 바로 전에 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다.
3. Tyrosinase 억제 물 분석 결과 버퍼를 준비 합니다. 1 M NaH₂포₄ (이수소) 및 1 M 나₂HPO₄ (염기) 재고 솔루션을 준비 합니다. 나₂HPO₄ 의 0.1 M 나트륨 인산 염 버퍼 (pH 6.8)의 최종 볼륨을 준비가 NaH₂포₄ 의 53.7 mL 46.3 mL를 혼합.
   1. 6.8에 마지막 해결책의 pH H₂o. 조정 1 l (최종 볼륨) 결과 혼합물을 희석. 이 버퍼는 1 달 동안 사용할 수 있습니다 4 ° c.에 저장 될 때
4. Tyrosinase 기판 솔루션 준비: tyrosinase 억제 물 분석 결과 버퍼에 녹아 있는 0.1 %3, 4-dihydroxy-L-페닐알라닌 (DOPA, w/v) (1.3 단계 참조).
   주의: 사용 하는 동안 얼음에 계속.
5. 100 U/mL 버섯 tyrosinase를 준비. Tyrosinase 억제 물 분석 결과 버퍼에서 동결 건조 된 버섯 tyrosinase 해산. 2 개월 동안이 솔루션을 사용할 수 있습니다 – 20 ° c.에 저장 될 때 버섯 tyrosinase 활동 뿐만 아니라 세포 tyrosinase 활동 셀 재료의 계산 됩니다.
   주의:이 솔루션은 피할 수 있습니다 동결 및 해 동을 반복 따라서 동결 전에 aliquoted. 계속 사용 하는 동안 얼음에 솔루션.
6. 1 N NaOH 솔루션을 준비 합니다. 그리고 무게 부피 플라스 크에 NaOH의 4 g을 100 mL의 증류수에 용 해.
7. 고정 솔루션 (10% 포 르 말린)를 준비 합니다. 희석 증류수의 73 mL와 함께 37% 포름알데히드의 27 mL. 신선한 매일을 준비 합니다.
8. 암모니아 실버 재고 솔루션을 준비 합니다. 5 mL 부피 플라스 크에 10% 실버 질산염 솔루션의 준비. 침전은 완전히 용 해 될 때까지 dropwise, 수산화 암모늄 솔루션을 추가 합니다. 200 μ의 실버 질산염 용액 (10%)를 추가 합니다. 솔루션은 약간 흐린 될 것입니다.
   주의: 접촉 및 흡입을 피하십시오. 사용 하 여 증기 두건.
9. 암모니아 실버 작업 솔루션을 준비 합니다. 7.5 mL 증류수와 암모니아 실버 재고 솔루션의 2.5 mL를 희석. 한 번 사용 하 고 삭제.
   주의: 접촉 및 흡입을 피하십시오. 사용 하 여 증기 두건.
10. 금 0.1% 염화를 준비 합니다. 골드 10% 염화 물의 1 mL를 준비 하 고 부피 플라스 크에 증류수의 99 mL를 추가 합니다. 신선한 매일을 준비 합니다.
11. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 준비 합니다. 8 g의 NaCl, KCl, 0.2 g 1.44 g Na₂HPO₄ 의 KH₂포₄ 증류수 800 ml에서의 0.24 g을 추가 합니다. HCl. Dilute 증류수 1 l (최종 볼륨) 결과 혼합물과 7.4에 pH를 조정 합니다.
12. 증류수에 용 해 하는 5% (w/v) 나트륨 thiosulfate 솔루션을 준비 합니다.

2. 세포 배양 및 치료

1. 상업적으로 이용 가능한 B16F10 세포를 사용 합니다. 완전 한 매체에서 B16F10 세포를 유지 합니다. 습도에 셀 문화 플라스 크를 계속 5% CO₂ 분위기 인큐베이터에서 37 ° c.
2. 테스트 화합물, 억제제 긍정적인 통제, 및 부정적인 제어 샘플을 준비 합니다.
   1. 적절 한 용 매에 있는 시험 화합물을 디졸브. 이중 증 류 물에서 물 녹는 화합물을 디졸브. 적절 한 유기 용 매, 예물 불용 성 화합물을 분해., DMSO.
   2. 여기, 사용 알 부 틴 테스트 화합물 또는 부정적인 통제와 비교 된 hypopigmentation 활동을 평가 하기 위해 긍정적인 컨트롤로 이중 증 류 물 (125 μ g/mL)에 녹. 부정적인 통제 (차량 처리 제어) 사용 하 여 솔루션 또는 테스트 샘플, 예를 들어, 이중 증 류 물, DMSO, 사용 버퍼 에탄올.
3. 셀 시드 및 치료
   1. 5 × 10⁴ 씨 B16F10 세포 세포/완전 한 매체를 사용 하 여 24-잘 배양 배지에서 잘 하 고 24 h에 대 한 CO₂ 배양 기에서 품 어. 부 화, 후 완전 한 매체 발음.
   2. DMEM 매체 (FBS와 1% 페니실린/스) 없이 테스트 화합물, 억제제 컨트롤 또는 72 h. 검사 세포는 현미경 아래 모든 24 h에 대 한 CO₂ 배양 기에서 부정적인 컨트롤을 포함 하는 셀을 품 어. 이 단계 후 추가 실험을 위한 단계 3-5로 이동 합니다.
      주의: 시험 물질과 DMEM 매체의 혼합 0.2 μ m 필터를 통해 필터링 해야 합니다.

3. 세포 Tyrosinase 활동 측정

1. 2 단계에서에서 설명 하는 방법을 사용 하 여 미디어를 제거 하 고 차가운 PBS의 300 μ로 두 번 셀 린스.
2. 얼음에 셀 문화 접시를 놓습니다. 300 μ의 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 고 5 분 동안 품 어. 다음 세포 lysate 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 수집 하 고 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 lysate를 전송할.
3. 14500 rpm 2 셀 균질 화기와 세포 lysate를 균질 s, 세포내 tyrosinase를 얼음에 3 번. 균질 화기에 대 한 최적의 상태로 관련을 사용 합니다.
4. 4 ° C에서 12000 × g 에서 10 분 동안 centrifuge 고 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 표면에 뜨는 전송. 사용 하는 동안 얼음에 계속.
5. 96-잘 분명 폴리스 티 렌 microplate에는 상쾌한의 70 μ를 전송.
6. Tyrosinase 기판 (DOPA) 96-잘 분명 폴리스 티 렌 microplate에를 포함 하는 솔루션의 140 μ를 추가 하 고, 부드럽게, 동요 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어
7. 옵션, 추가 100 U/mL 버섯 tyrosinase 솔루션의 70 μ 각 잘 하 고 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어
8. 475의 파장에서 tyrosinase 활동 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여.
9. 각 샘플의 단백질 농도를 tyrosinase 활동 정상화. Bradford 분석 실험에 의해 각 샘플의 단백질 농도 측정 합니다.

4. 멜 라 닌 함량을 측정

1. 2 단계에에서 설명 된 메서드를 사용 하 여 미디어를 제거 하 고 차가운 PBS의 300 μ로 두 번 셀 린스.
2. 얼음에 셀 문화 접시를 놓습니다. 300 μ의 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 고 5 분 동안 품 어. 다음 세포 lysate 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 수집 하 고 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 lysate를 전송할.
3. 4 ° c.에 12000 × g 에서 10 분 원심 분리기
4. 새로운 튜브 정규화에 대 한 측정 총 단백질 농도 상쾌한 전송. Bradford 분석 실험에 의해 각 샘플의 단백질 농도 측정 합니다.
5. 각 펠 릿에 300 μ 1 N NaOH의 추가 하 고 1 시간에 60 ° C에서 품 어.
6. 녹은 솔루션 4 ° c.에 12000 × g 에서 10 분 원심
7. 96-잘 microplate에는 상쾌한의 200 μ를 전송.
8. 400의 파장에서 멜 라 닌 내용을 측정 nm.
9. 멜 라 닌 콘텐츠 단백질 농도를 정상화.

5. 폰 타나-마 송 얼룩

1. 폰 타나-마 송 얼룩
   1. 셀 차가운 PBS의 300 μ로 두 번 씻는 다.
   2. 각 잘을 10% 포 르 말린의 200 μ를 추가 하 고 1 시간 4 ° c.에 대 한 품 어
   3. 증류수로 씻어.
   4. 200 μ의 미리 데워 진 암모니아 솔루션 작업을 추가 하 고 37 ° C에 또는 셀 색깔에 황색/갈색 될 때까지 1 시간에 품 어.
      주의: 58-60 ° C 물 욕조에 갓 혼합된 암모니아 실버 작업 솔루션 놓고 온도 equilibrate를 위한 충분 한 시간을 허용 합니다.
   5. 암모니아 실버 솔루션 작업을 제거 하 고 증류수로 헹 구 십시오.
   6. 증류수를 제거 합니다. 금 0.1% 염화의 200 μ를 추가 하 고 실시간에 2 분 동안 품 어
   7. 0.1% 골드 염화 솔루션을 제거 하 고 증류수로 헹 구 십시오.
   8. 증류수를 제거 합니다. 나트륨 thiosulfate 솔루션 (5%, w/v)의 200 μ를 추가 하 고 2 분 동안 품 어.
   9. 나트륨 thiosulfate 솔루션을 제거 하 고 증류수로 헹 구 십시오.
   10. 증류수를 제거 합니다. 핵 빠른 레드의 200 μ를 추가 하 고 5 분 동안 품 어.
   11. 핵 빠른 붉은 색을 제거 하 고 수돗물으로 씻어.
   12. 수돗물을 제거 하 고 관찰 하는 현미경으로 얼룩진된 셀.
2. 폰 타나-마 송 (임계값 분석 사용 하 여 ImageJ) 얼룩
   참고: ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 분석 절차의 예는 보충 자료에 표시 됩니다.
   1. ImageJ 프로그램을 엽니다.
   2. 파일을 선택 | 오픈 | 현미경 이미지.
   3. 이미지 선택 | 조정 | 임계값 색상.
   4. 폰 타나-마 송 물 면적 측정, 밝기 매개 변수 바는 0으로 설정 하 고는 모든 스테인드 셀 (검정 또는 진한 갈색) 포함 됩니다 지점을 찾기 위해 밝기 막대를 조정 합니다.
   5. 선택 분석 | 입자 분석. 분석 입자 창에서 요약 상자를 확인 하 고 확인을 누릅니다. 요약 결과 얻을 하 고 스프레드시트에 붙여 넣습니다.
      참고 설명 결과 상자 매개 변수는 다음과 같습니다.:
      각 이미지의 슬라이스: 이름
      카운트: 스테인드 셀 수
      계산된 셀의 총 면적: 총 면적
      평균 크기: 총 면적/수
      % 지역: 스테인드 영역/총 면적 × 100%; 총 면적 자동으로 계산 됩니다.
   6. 상대적 계산 지역 전체 면적의 값을 사용 하 여 멜 라 닌으로 물.
      상대 멜 라 닌 스테인드 영역 (%) = 제어 × 100, 즉, 의 테스트 샘플/평균 전체 면적의 총 세포질 영역의 값

결과

알 부 틴, 안티-melanogenic의 hypopigmentation 활동에 대 한 대표적인 결과 화합물, B16F10 melanocytes 다음과 같습니다. 그림 1A 는 그 알 부 틴은 크게 차량 처리 제어에 비해 세포 tyrosinase 활동 억제를 보여 줍니다. 마찬가지로, 알 부 틴과 자극된 세포의 멜 라 닌 콘텐츠 컨트롤 (그림 1B)에 비해 감소 크게 되었다. 셀 폰 타나-마 송 얼룩과 ?...

토론

우리는 교양된 melanocytes을 사용 하 여 테스트의 hypopigmentation 활동을 평가 하기 위한 프로토콜을 제시. 대표 결과 알 부 틴, 저해 tyrosinase 활동 및 셀룰러 멜 라 닌 콘텐츠 tyrosinase 억제 물의 hypopigmentation 효과를 보여주었다. 이러한 메서드는 안티 melanogenic 활동 연구에 널리 사용 됩니다. 이 분석 실험을 사용 하 여, 또한 성공적으로 확인 했습니다 melanogenesis B16F10 세포에 억제 효과 과거에는 여러 가?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine	Sigma	D9628
Ammonium hydroxide solution	Sigma	#320145
Arbutin	Fluka	#10960
DMEM	HyClone	SH30243.01
FBS	HyClone	SH30084.03
Formalin	Yakuri Pure Chemicals	#16223	37%
Gold chloride	American MasterTech	AHG0226	0.10%
HCl	Samchun chemical	H0255
KCl	Bio basic Canada Inc.	PB0440
KH2PO4	Sigma	#60218
Na2HPO4	J.T.Baker	#3817-01
NaCl	Duksan pure chemicals	#81
NaOH	Sigma	655104
Nuclear fast red	Merck	100121	Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.
Penicillin and streptomycin solution	HyClone	SV30010
Silver nitrate	Duksan Pure Chemicals	#900
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	J.T. Baker	#3817-01
Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)	Sigma	S5011
Sodium thiosulfate pentahydrate	Duksan Pure Chemicals	#2163
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Bio Basic Canada	TB0196
Triton X-100	Union Carbide	T8787
Tyrosinase from mushroom	Sigma	T3824	25 KU