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요약

여기, 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 유전자 및 인간 답게 된 마우스 모델을 사용 하 여 백혈병에서 마약 대상으로 c Fos와 Dusp1의 유전과 화학 유효성 검사에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 유전 유효성 검사 및 치료 개발에 대 한 모든 대상에 적용할 수 있습니다.

초록

만성 골수성 백혈병 (CML) 치료에 tyrosine kinase 억제제 (TKIs)의 데모는 암 치료에 새로운 시대를 예 고 했다. 그러나, 세포의 작은 인구에 반응 하지 않는 TKI 치료 결과 최소 잔여 질병 (MRD); 이 세포를 근절 하기 위해 심지어는 가장 강력한 TKIs 실패. 이러한 MRD 세포 치료에 저항을 개발 하는 저수지 역할을 합니다. 왜 TKI 치료 MRD 셀에 대 한 효과 알 수 없습니다. TKI 치료 동안 MRD 세포의 생존을 지 원하는에 연루는 성장 인자 신호 하지만 기계적 이해 부족. 최근 연구는 높은 c-Fos와 Dusp1 집중 결과로 종양 표현과 MRD 셀에 신호 하는 성장 인자 중재 TKI 저항을 설명 했다. C-Fos와 Dusp1의 유전과 화학 억제 CML를 TKIs에 절 묘하게 과민 한 렌더링 하 고 두 유전자 및 인간 답게 된 마우스 모델에 CML을 치료. 우리는 TKI-민감하고-내성 세포에서 여러 microarrays를 사용 하 여이 대상 유전자 발견. 여기, 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 마우스 모델을 사용 하 여 대상 유효성 검사 메서드를 제공 합니다. 이러한 메서드는 쉽게 유전자 유효성 검사 및 치료 개발에 대 한 모든 대상에 적용할 수 있습니다.

서문

BCR-ABL1 퓨전 oncogene의 제정 티로신 키 니 아 제 활동 하면 CML, 작은 분자 억제제 여 키 니 아 제 활동에 근거를 제공 한다. CML 환자 치료에 TKIs의 성공 타겟된 치료1,2의 개념을 혁명. 그 후, 안티 니 정밀 의학으로 치료는 단단한 종양을 포함 한 다른 여러 악성 종양에 대 한 개발 되었다. 지금까지, 30 개 이상의 kinase 억제제는 다양 한 악성 종양 치료를 위한 미국 국가 FDA에 의해 승인 되었습니다. TKI 치료 질병 억제에 매우 효과적 이다, 그러나 그것은 치료입니다. 게다가, 암 세포의 작은 인구는 치료 기간 동안 지속: MRD3,,45. 완전 한 사 함을 보여도 환자가 결국 결과에 재발 하지 않을 경우 지속적으로 억제 MRD 남아 있습니다. 그러므로, MRD 세포의 박멸 내구성 또는 치료 응답을 달성 하기 위해 필요 합니다. CML은 발암, 합리적인 대상 감독 치료제, 질병의 진행, 그리고 약물 저항 메커니즘, 정밀 의학의 개념을 정의 하기 위한 귀중 한 패러다임을 나타냅니다. 그러나, 오늘날에 암 세포에 TKI 유도 된 세포 죽음을 운전 하는 메커니즘은 완전히 이해 되지 않습니다,도 왜 MRD 세포 (leukemic 줄기 세포 [LSCs]의 구성)은 본질적으로 TKIs4,6. 그럼에도 불구 하 고, 돌연변이 니 oncoprotein 하 "oncogene 의존"의 현상 TKIs에 의해 타겟된 oncogene의 심각한 저해 대규모 proapoptotic 응답 또는 셀에 정지에 이르게 하는 종양 충격을 발생 하는 TKI 효능에 연루는 맞는 방식으로6,7,,89. 그러나, oncogene 의존의 기계적 underpinning 부족 이다. 최근 연구는 주석은 oncogene 의존 성장 인자 신호 및 따라서 TKI 치료10,,1112에 저항을 수 여 연루 있다. 따라서, oncogene 의존의 메커니즘에 대 한 통찰력을 얻기 위해 우리가 수행 전체-게놈 식 중독 BCR-ABL1 및 nonaddicted 세포 성장 인자 (성장), c-Fos와 Dusp1의 중요 한 중개자는 밝혔다에서 프로 파일링 oncogene 중독13. C-Fos와 Dusp1의 유전 삭제 합성 BCR ABL1 표현 하는 치명적인 셀 이며 실험에 사용 하는 생쥐 백혈병을 개발 하지 않았다. 또한, 작은 분자 억제제에 의해 c-Fos와 DUSP1의 억제 생쥐에서 BCR ABL1 유도 CML 치료. 결과 높은 수준의 치료13저항을 야기 하는 동안 낮은 수준의 마약 감도 부여 c Fos와 Dusp1의 식 수준 암 세포, apoptotic 임계값 정의 보여 줍니다.

Oncogene 의존을 운전 하는 유전자를 식별 하기 위해 우리는 마우스-그리고 CML 환자 파생 셀 (K562)를 사용 하 여 성장 인자와 TKI (imatinib)의 실험을 프로 파일링 하는 여러 전체 게놈 식 수행. 이러한 데이터는 CD34에서 얻은 CML 환자 데이터 세트와 병렬로 분석 되었다+ 조 혈 줄기 세포 imatinib 치료 전후. 이 분석 공개 3 개의 유전자 (전사 요소 [c-Fos], 이중 특이성 인산 가수분해 효소 1 [Dusp1], 그리고 RNA 의무적인 단백질 [Zfp36])는 일반적으로 upregulated TKI 내성 세포에서. 약물 저항을 부여에 있는이 유전자의 중요성을 확인 하기 위해 우리는 단계별 생체 외에서 그리고 vivo에서 분석 실시. 이 유전자의 표현 수준 실시간 정량 (RT-정량)와 서 부 럽 약물 내성 세포에 의해 확인 되었다. 또한, cDNA overexpression 및 c-Fos, Dusp1의 shRNA 헤어핀으로 최저 그리고 Zfp36 높은 c-Fos와 Dusp1 식은 충분 하 고 TKI 저항을 부여 하는 데 필요한. 따라서, 우리는 c-Fos와 Dusp1 모델 마우스를 사용 하 여 생체 조건 유효성 검사를 수행. C-Fos와 Dusp1의 유전 유효성 검사에 대 한 우리 ROSACreERT를 유도할 수 있는 c-Fosfl/플로리다 쥐 (조건부 녹아웃)14 만들어지고 Dusp1-/- (똑 바른 녹아웃)15 ROSACreERT2-c-Fosfl/플로리다 수 있도록 그들을 넘어 Dusp1/- 이중 유전자 변형 쥐. 골 수 파생 된 c-키트+ 세포 (c Fos에서fl/플로리다-, Dusp1-/--, c-Fosfl/플로리다Dusp1-/-) BCR ABL1 표현 했다 분석 생체 외에서 에 콜로 니 형성 단위 (CFU) 분석 결과, vivo 백혈병 개발에 혼자 또는 함께 c-Fos와 Dusp1의 요구를 테스트 하려면 치명적 방사능된 쥐에서 골 수 이식에 의해. 마찬가지로, DFC (difluorinated curcumin)16 c-Fos와 BCI에 의해 Dusp1의 화학 임무 (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 시험 되었다 생체 외에서 그리고 vivo BCR-ABL1-표현, 뼈를 사용 하 여에서 야생-타입 (WT) 마우스에서 골 수 유래 c-키트+ 세포. 우리 어디 BCR ABL1 특히 유도 되었다 그것의 줄기 세포에 doxycycline (Tet transactivator 표현 murine 줄기 세포 백혈병 (SCL) 유전자 3' 증강에 의해 CML 마우스 모델을 활용 하는 leukemic 줄기 세포에서 c-Fos와 Dusp1의 요구를 확인 하려면 레 귤 레이 션)18,19. 우리 골 린-사용 Sca+c-키트+ (LSK) 세포 vivo에서 이식 분석 결과에서 이러한 쥐에서. 또한, 우리는 설립 phopsho-p38 수준 및 Dusp1 및 c-Fos 저해 수립이 동적 생체로 일리노이-6의 식 각각, vivo에서. 마지막으로, 인간의 관련성, CD34 환자 파생에 대 한 연구를 확장+ 세포 (마우스에서 c-키트+ 세포에 해당) 복종된 장기 생체 외에서 문화 시작 셀 분석 실험 (LTCIC)를 했다 vivo에서 인간 답게 마우스 모델의 CML20,21. Immunodeficient 마우스 CML CD34 + 세포, 약물 치료 및 인간 leukemic 세포 생존의 분석으로 이식 했다.

이 프로젝트에서 우리는 다른 전 임상 모델을 사용 하 여 대상 식별 및 유전과 화학 도구를 사용 하 여 유효성 검사에 대 한 방법을 개발 한다. 이러한 메서드는 치료 개발에 대 한 화학 modalities를 개발 하는 다른 대상 유효성을 성공적으로 적용할 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 신시내티 아동 병원 의료 센터 (CCHMC)의 지침에 따라 실시 했다. 인간의 표본 (일반 BM 그리고 CML에서 (p210-BCR-ABL +) 백혈병) 기관 검토 위원회 승인 프로토콜을 통해 얻은 했다 (기관 검토 위원회: Federalwide 보증 #00002988 신시내티 아동 병원 의료 센터) 및 CCHMC, 신시내티 대학에서 기부자 정보 동의.

1. 실시간 정량 분석

  1. BaF3 셀 인터 루 킨-3 (IL-3)의 원천으로 10 %FBS 10% 지출 WEHI 문화 매체와 보충 RPMI에 성장에서 총 RNA 격리 합니다.
  2. 로그 단계 (99% 살아) 대우 (IL-3 및 imatinib) 뿐만 아니라 치료 샘플에서 세포를 수확 하 고 3 분 435 x g 에서 원심. 건강과 세포의 성장 단계는 그들의 유전자 식 프로필 극적으로 변경할 수 있습니다 중요 합니다.
  3. 총 RNA22를 정화 하 여 RNA를 분리. 계량 총 RNA; 그런 다음, DNase 치료23주제. 동일한 양의 RNA DNA-무료 변환 (2 µ g) cDNA 역전사24와 함께 하.
  4. QPCRs 유전자 특정 뇌관 (표 1)을 수행 합니다. PCRs 0.2 ml에서 20 µ L 반응에 실행, 1 x 중 합 효소를 사용 하 여 광학 모자, PCR 튜브 얇은 벽 ( 재료의 표참조), 각 뇌관의 0.5 µ M, 1 µ L의 DNA, 그리고 물. 다음 주기 thermocycler 반응 장소: 단계 1, 95 ° C 10 분; 2, 95 ° C 15 단계 s; 1 분;에 대 한 60 ° C에서 3 단계 4 단계, 40 번 2-3 단계를 반복 합니다. Triplicates에서 모든 PCRs를 수행 하 고 β-말라 식 플롯 하기 전에 실시간 데이터를 정상화.

2. 서 부 럽

참고: 전체 셀 추출 물 Kesarwani에 설명 된 대로 세포의 용 해 버퍼 x 1의 250 µ L을 추가 하 여 준비 되었다 외13 칵테일, 프로 테아 제 억제 물과 인산 가수분해 효소 억제 물 칵테일 2 보충.

  1. 수확에서 로그 단계 (99% 살아)에서 5 백만 BaF3 셀 (IL-3 및 imatinib) 치료로 치료 BaF3에서 4 ° c.에 3 분 동안 435 x g 에서 원심 분리 하 여 세포 1 x 80 ° c.에서 5 분 부 화 뒤 위아래로 pipetting으로 세포의 용 해 버퍼 (250 µ L)에서 세포를 lyse 5의 5-6 펄스와 함께 모든 DNA 뜨 lysate sonicate s 각 4 ° c.에 추운 방에
  2. 1.5 mL 튜브에는 lysate 전송 하 고 모든 불용 성 물질을 제거 하 5 분 16000 x g 에서 원심. 추출-80 ° C에서 사용까지 저장할 수 있습니다. 로드 하기 전에 열 블록에 5 분 동안 80 ° C에 열 샘플. 10 %SDS-PAGE 젤에 젤 로드 팁을 사용 하 여 샘플의 10 µ L을 로드 합니다.
  3. 참조 염료는 젤의 맨 아래에 도달할 때까지 150 V에서 단백질을 해결. 1 h 1 앰프 전기 이동 이체로 니트로 세포 막 단백질을 전송. 송금 후 차단 Tris 버퍼 식 염 수 + 0.1% x 1에서 막 1 시간 그리고 1:1,000 희석에 적절 한 항 체와 4 ° C에서 하룻밤 프로브에 대 한 5% 비-지방 우유와 함께 트윈 20 (TBST).
  4. 3 막 씻고 10 분 각; TBST 가진 5 x x 다음, 프로브는 HRP 활용 된 적절 한 2 차 항 체로 (1:5, 000 희석) 실 온에서 1 h. TBST 사용 컨테이너 크기에 따라 다릅니다. 완전히 TBST에 막 잠수함 있는지 확인 합니다. 이차 항 체 3 세척 TBST 가진 5 분 각 x.
  5. 오 점 chemiluminescent 기질 시 약을 사용 하 여 개발 합니다. 기판 및 버퍼를 사용 하기 전에 바로 두 병의 동일한 볼륨을 믹스. 기판 1 mL 피 펫과 전체 막 커버 하 고 1 분 동안 품 어 막의 상단에 추가 합니다. 도 말 추가 기판의 1-10 분 이내 몇 군데 되어야 한다.
  6. 이미징 시스템의 플랫폼에는 막 장소 신중 하 게 무딘 집게를 사용 하 여 참조 테이블의 재료, 액체의 대부분을 피하. 라이브 뷰를 선택 하 고 메뉴에서 오 점 및 chemiluminiscence을 선택 합니다. 수동 수집을 사용 하 여 다른 시간 지점에서 다중 노출 취득. 이러한 파일은 구상 될 수 있다 하 고 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 계량.

3입니다. 녹아웃 마우스의 생성

  1. ROSACreERT2c 포fl/플로리다 마우스13을 생성 하기 위해 ROSACreERT2 마우스와 c Fosfl/플로리다 쥐를 교차. 더블-녹아웃 (KO) 마우스를 만들려면 ROSACreERT2c 포fl/플로리다 Dusp1/- 생쥐13을 생성 하기 위해 Dusp1/- 생쥐와 ROSACreERT2c 포fl/플로리다 쥐를 사육 한다. 유전자 형 꼬리 클립으로 쥐 뒤 PCR, 아래 설명 된 대로.
  2. 유전형:
    1. DNA를 준비 하려면가 위로 꼬리의 작은 부분을 클립 하 고 1.5 mL 튜브에 넣어. 온수가 위로 꼬리 부식. 튜브에 잘린된 꼬리를 50 m NaOH m의 200 µ L을 추가 하 고 1 시간에 대 한 열 블록에서 95 ° C에서 품 어.
    2. 소용돌이 관 잘, 50 µ L 1 M Tris HCl pH 6.8의 및 소용돌이 다시 추가 하 여 중화 하는 고. 1 분 동안 최대 속도로 튜브 원심
    3. PCRs 20 µ L 반응 0.2 ml, 얇은-벽으로 PCR 튜브 1 x Taq 중 합 효소 마스터 믹스 포함 염료, 0.5 µ M의 각 뇌관, DNA, 그리고 물의 1 µ L를 사용 하 여 수행 합니다. thermocycler에 튜브를 놓고 표 2와 같이 적절 한 주기를 실행 합니다.
    4. 2 %agarose 젤 고 젤 문서 시스템을 사용 하 여 이미지에 PCR 제품을 실행 합니다.

4. 골 수에서 c-키트+ 세포의 고립

  1. 기관 지침에 따르면 쥐를 희생.
    참고: 여기, 쥐에 드러낸 이산화탄소 (CO2)에 따르면 죽음은 호흡과 심장 박동의 정지에 의해 결정 되었다 때까지 유량을 권장 AVMA 다음 자 궁 경관 탈 구.
  2. 마우스에서 다리뼈 를 수확-두 개의 화관, 두 tibias, 두 iliacs. 메스와 멀리 된다고 하 여 모든 조직을 뼈에서 떨어져 청소. 얼음에 감기 1 x PBS에 다리 뼈를 넣어-15 mL 튜브에 5 mL. 박격포로 튜브의 내용을 부 어과 유 봉과 호감.
  3. 10 mL 피 펫을 피 펫을 사용 하 여 연결을 50 mL 스크류 캡 튜브에 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액 필터링. 박격포와 유 봉 찬 1 x PBS, 수집 하 고 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 추가 함께 여러 번 씻어. 5 분 제거는 표면에 뜨는 통해 진공 유리 피 펫과 연결 된 4 ° C에서 1200 x g 에서 골 아래로 회전 합니다. 5 ml를 피펫으로와 1 x PBS의 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.
  4. 피 펫, 천천히 추가 정지 골 실내 온도 (온도 중요 한)의 5 mL의 상단에 polysucrose, 인터페이스를 방해 하지 않기로 큰 돌. 해제 브레이크 20 분 동안 실 온에서 400 x g 에서 회전 합니다.
  5. 피 펫과 흐린 총 단 핵 세포 (TMNC) 인터페이스를 수집 하 고 새로운 15 mL 튜브에 넣어. 볼륨을가지고 최대 세척에 대 한 1 x PBS와 10 ml, 복용,에 대 한 20 µ L 5 분 삭제는 상쾌한 4 ° C에서 1200 x g 에서 회전 하 고 단계 4.6.1 얼음에 펠 릿을 저장.
  6. C-키트+ 수행 고립 세포.
    1. C-키트+ microbead 키트 프로토콜에 따라 절연 셀. 107 셀에 1 x PBS + EDTA BSA의 80 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 세포 현 탁 액을 CD117 MicroBeads/107 총 셀의 20 µ L를 추가 합니다. Vortexing에 의해 잘 믹스와 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어 볼륨을가지고 최대 10 mL PBS + EDTA + BSA와 스핀 x 1을 추가 하 여 5 분 동안 4 ° C에서 1200 x g 에서.
    2. 상쾌한 진공을 통해 제거 하 고 1 x PBS + EDTA BSA에 500 µ L/108 총 셀에 셀 펠 릿을 일시 중단. 자석 스탠드를 사용 하 여, 자기 열 3 mL PBS + EDTA BSA x 1의 추가 15 mL 컬렉션 튜브로 중력을 통해 흐를 수 있도록.
    3. 첫 번째 버퍼 추가 열 통과 완료 되 면, 15 mL 컬렉션 튜브에 중력을 통해 흐를 수 있도록 열에 세포 현 탁 액을 추가 합니다. 이 flowthrough는 원치 않는 셀 분수입니다.
    4. 워시 3 번 3 mL 1 x PBS + EDTA BSA와 열 때마다, 컬렉션 튜브에 통해 중력을 통해 흐름을 수 있도록. 자석에서 열을 제거 하 고 15 mL 튜브의 상단에 배치.
    5. PBS + EDTA BSA x 1의 5 mL을 추가 하 고 즉시 제공 하는 열과 플런저와 플러시. 플런저를 제거 하 고 PBS + EDTA BSA x 1의 추가로 5 mL와 플러시를 반복 합니다. 표준 방법을 사용 하 여 전체 볼륨에 있는 셀을 계산 합니다.
    6. 5 분 제거는 상쾌한 4 ° C에서 1200 x g 에서 셀 아래로 회전 하 고 완전 한 IMDM에 펠 릿을 resuspend (IMDM + 10 %FBS + IL-6 [10 ng/mL] mSCF [50 ng/mL] FLT3 ligand [20 ng/mL] + + IL-3 [10 ng/mL]) 문화에 대 한. 문화가이 세포에서 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 그들을 배치 하 여 셀 IMDM 완전 한 미디어의 2 x 106 셀/1 mL에서 하룻밤.

5입니다. 변환

  1. Transfection retroviral 플라스 미드
    1. 갓 HEK293 세포 물 욕조에 전에 오후 37 ° c.로 설정 해 동 Cryotube 3 분 제거에 대 한 실 온에서 435 x g 에서 HEK 세포를 포함 하는 표면에 뜨는 통해 진공 회전 하 고 10% 보충 DMEM의 1 mL에 셀 펠 릿 중단 FBS, 페니실린, 스, 그리고 글루타민.
    2. 셀을 계산 하 고 적절 한 볼륨 처리 10 cm 접시 (4 ~ 106 HEK293T 셀 x)을 추가. DMEM 10 미디어의 14 mL 접시에 추가 하 고 평등 분배를 위해 아래로 슬라이딩으로 잘 혼합. 37 ° C, 5% CO2 배양 기 하룻밤에 접시를 놓습니다.
    3. 다음 날 아침에는 거꾸로 가벼운 현미경 세포의 합류를 확인 (50% 이상 잘 작동).
    4. DNA (원하는 retroviral 플라스 미드), PclEco (포장 플라스 미드), 2 M CaCl2, H20 (= 500 µ L) 1.5 mL 튜브에 결합 한 micropipette를 사용 하 여 다음 금액에서: 7.5 µ g의 DNA (BCR-ABL1-YFP), pCLeco, 2m CaCl2 의 62 µ L의 7.5 µ g 그리고 500 µ L. 추가 500 µ L의 또 다른 1.5 mL 튜브에 2 x HBS의 최종 볼륨을 물.
    5. 혼합 하는 동안 DNA 2 x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES, 및 1.5 m m 나2HPO4)의 500 µ L을 포함 하는 1.5 mL 튜브에 dropwise 믹스를 추가 합니다. 최저 속도 소용돌이 설정 하 여 이것을 달성 하기 누르고 HBS 튜브 그것에 transfection 믹스를 추가 하는 동안 일정 한 혼합에 대 한.
    6. 실 온에서 20-30 분 동안 품 어 transfection 혼합을 수 있습니다. 부 화, 동안 HEK 세포를 25 nM 클로로퀸을 추가 하 고 다시는 인큐베이터에에서 배치. 부 화 후 HEK 세포에 dropwise transfection 믹스를 추가 하 고, 부드럽게 섞어 접시에 걸쳐 transfection 믹스 미디어 소용돌이.
    7. ~ 8 h 37 ° C, 5% CO2 배양 기에에서 대 한 믹스와 함께 셀을 품 어. 아주 천천히 추가 14 mL 신선한 DMEM 10 미디어에 의해이 세포에 미디어를 변경 합니다. 접시의 벽에 천천히 pipetting HEK 세포의 모든 스트립을 방지할 수 있습니다. 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 하룻밤 셀을 품 어.
    8. 10 mL 주사기 바이러스 상쾌한을 수집 하 고, 주사기에는 상쾌한 그릴 0.45 μ m 주사기 필터 연결. 바이러스 성 상쾌한 새로운 컬렉션 튜브로 급락. 나중에 바이러스 표면에 뜨는 ~ 16 h의 첫 번째 컬렉션을 가져가 라.
  2. Fibronectin 바이러스 농도 및 변환
    1. 치료 6-잘 배양 배지를 1 x PBS에 0.1 mg 재조합 인간 fibronectin 파편의 2 개 mL를 추가 합니다. 전지와 genotypes의 수에 달려 있는 만큼 fibronectin 필요에 따라 준비 합니다. 하나 잘 transduce 충분히 수 10 백만 c-키트+ 세포. 4 ° c.에 하룻밤 접시를 품 어
    2. 다음 날, 피 펫, 피 펫 플레이트, 차단 하 여 실 온에서 30 분 동안 품 어 1 x PBS에 살 균 2 %BSA 2 mL와 우물에서는 fibronectin를 제거 합니다. BSA는 진공을 통해 제거 하 고 철저 하 게 1 x PBS에 pipetting 2 mL로 씻고 진공을 통해 제거.
    3. 바로 갓 수집과 (0.45 μ m)에서 필터링을 추가 바이러스 표면에 뜨는 최대 5 mL. 2 헤는 표면에 뜨는 통해 진공 제거를 추가 갓 수집 된 바이러스 상쾌한와 함께이 단계를 반복 하 고 다시 회전 435 x g 32 ° c에서 원심. 표면에 뜨는 통해 진공을 제거 하 고 1 x PBS;의 2 개 mL를 추가 하 여 우물을 세척 다음,를 통해 진공 그것을 제거 합니다.
    4. C-키트+ 마우스 세포 하 교양된 하룻밤 (단계 4.6.6) 바이러스 성 코팅된 웰 스에 의해 셀 정지를 잘 혼합 하 고 지금 바이러스 집중된 fibronectin 접시에 pipetting을 추가 합니다. 셀은 37 ° C, 5% CO2 배양 기에에서 넣어 90 분 25 ° C에서 1200 x g 에서 회전 합니다.
    5. 48 h posttransduction, 5 분 동안 4 ° C에서 1200 x g 에서 원심 분리 하 여 셀을 작은 고 6 x 106/mL을 FACS 버퍼 #1 (1 x PBS + 0.5 %BSA)에서 resuspend. YFP 긍정적인 cytometry 사용의 비율을 측정 하 여 BCR ABL1 긍정적인 세포의 백분율을 결정 합니다.
    6. 표준 절차와 함께 이벤트를 취득 합니다. 첫째, 앞으로 및 측면 분산형 기반 라이브 셀 게이트. 그런 다음, 부정적인 컨트롤 (그림 4)에 의해 결정 YFP negativecells 제외 YFP 긍정적인 라이브 셀 게이트.

6. 식민지 형성 UnitAssays

  1. 1-2 헤 Aliquot 3 ml 바늘 없는 5 mL 주사기를 사용 하 여 FACS 튜브에 스의 실 온에서 마우스에 대 한 cytokines와 스 동 정렬 셀 정렬 YFP 긍정적인 세포.
  2. 셀 아래로 회전 하 고 IMDM 완전 한 미디어에 펠 릿을 중단. IMDM 완전 한 미디어의 100 µ L에 5000 YFP 긍정적인 세포를 얻기 위해 그들을 희석 및 도금 될 셀을 계산 합니다.
  3. 100 µ L 5000 YFP 긍정적인 세포와 스의 3 mL을 적절 한 억제제를 포함 하는 셀 서 스 펜 션의 추가 ( 재료의 표참조). 10-30 s 혼합 높은 소용돌이.
  4. 공기 거품 탈출의 대부분, 후 1 mL 주사기를 사용 하 여 한쪽에 미디어 꺼내기 및 천천히 균등 하 게 확산 원형 운동에 있는 접시를 기울이기에 의해 3 개의 복제 3 cm 격판덮개에 미디어의 1 mL 접시.
  5. 사용 하는 저 해제의 최종 농도 3 µ M, 0.2 μ M에 DFC 및 0.5 µ M에 BCI에서 imatinib 혼자 또는 조합에서. 어디에 적절 한, 4-hydroxytamoxifen (1 µ g/mL)는 스에 추가 된 셀을 도금 하 여 c-Fos를 삭제 합니다.
  6. 도금, 후 중간에 살 균 물 2 mL를 포함 한 오픈 접시와 접시 큰 페 트리 접시에 넣어. 큰 페 트리 접시를 커버 하 고 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 신중 하 게 품 어. 현미경으로 식민지의 총 수를 계산 하 여 도금의 1 주 후 식민지 번호를 기록 합니다.
  7. PCR에 의해 c Fos 삭제에 대 한 적절 한 접시에서 몇 식민지를 분석 합니다. P1000 팁 그들을 빠는 하 여 식민지를 수집 합니다. PBS에서 팁을 여러 번 세척 하 여 1 x PBS의 500 µ L에서 세포를 분리 하십시오. 1 분 동안 6000 x g 에서 셀 정지 회전 하 고 게놈 DNA 분리 kit를 사용 하 여 셀 펠 릿에서 DNA를 추출.
  8. PCR 뇌관 mFos FP3 mFos를 사용 하 여에 대 한 게놈 DNA를 사용 하 여-RP5, 표 2에 설명 된 대로. 젤 문서 시스템을 사용 하 여 이미지를 2 %agarose 젤에 PCR 제품을 분석.
  9. 그래픽 프레 젠 테이 션의 식민지, 식민지, Iodonitrotetrazolium 염화를 사용 하 여 얼룩. Iodonitrotetrazolium 염화 1 mg/mL 해결책을 얻기 위해 물 10 mL에 10 mg을 디졸브. 필터는 조직 문화 후드에서 무 균 조건 하에서 10 mL 주사기에 부착 된 0.2 µ m 필터 Luer 자물쇠를 사용 하 여 솔루션을 소독.
  10. 조직 문화 후드에 dropwise CFU 접시; 주위 얼룩 솔루션의 100 µ L를 추가 수 슬라이드 또는 식민지를 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 하룻밤은 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터에에서 접시를 품 어. 식민지는 어두운 붉은 갈색 돌 것 이다. 메 마른 조직 문화 후드에 흰색 배경을 사용 하 여, 얼룩진된 CFU 접시의 사진을 찍어.

7. 이식 및 사망률 분석 결과

  1. 치명적 4.75 Gy 다음 7.0 Gy의 복용량에는 137 Cs 기반-감마선을 사용 하 여 분할 방사선으로 쥐를 비추는 (0.5 Gy/분), 3 h는 이식 하기 전에 떨어져.
  2. 4 x 10를 이식4 YFP 긍정적인 정렬 되지 않은 (YFP의 비율에 따라 계산) 꼬리를 통해 각 마우스에 캐리어로 3 x 105 정상 골 수 세포와 세포 정 맥 주입.
  3. 이식의 1 주 후는 engraftment FACS를 사용 하 여 말 초 혈액에서 YFP 긍정적인 세포를 분석 하 여 결정 합니다.
  4. 꼬리 정 맥 출혈 및 FACS 분석을 수행 합니다.
    1. 과열 또는 구울 주의 열 램프 아래에서 쥐의 케이지 따뜻한.
    2. 마우스 restrainer에 마우스를 억제 하 고 메 마른 잎을 가진 꼬리 정 맥 닉. 부드럽게 우유 후부, 축적을 혈액 드롭 수 있도록 앞쪽에서 꼬리. 때까지 그것은 heparinized 모 세관 튜브와 혈액 수집 (주위 수집 75-100 µ L). EDTA를 포함 하는 혈액 컬렉션 튜브로 채워진된 모 세관 튜브에서 혈액 급락 하 고 잘 섞으십시오.
    3. 1 x RBC 세포의 용 해 버퍼 (염화 암모늄 150 mM, 10 mM 칼륨 중 탄산염, 그리고 0.13 mM EDTA) 3 mL에 혈액의 30-40 µ L을 추가 하 여는 Rbc를 lyse. 믹스 잘, 반전 튜브 여러 번. 5 분은 표면에 뜨는 통해 진공 제거 하 고 세척에 대 한 1 x PBS의 2 mL에 펠 릿을 일시 중단 4 ° C에서 1200 x g 에서 10-15 분 회전을 위해 상 온에서 품 어.
    4. 5 분 제거는 상쾌한 4 ° C에서 1200 x g 에서 회전 시키십시오 그리고 FACS 버퍼 # 1에에서 그것을 중단. FACS 분석 단계 5.2.5–5.2.66에서 위에서 설명한 대로 수행 합니다. 단기 저장소 나머지 혈액 컬렉션 튜브, 4 ° c.에 다양 한 다른 목적을 위해 사용 될 수 있는
  5. 10-40 %YFP 긍정적인 세포 주변 혈액에서 이식된 생쥐 실험을 위해 사용 되었다. YFP 긍정적인 세포의 2% 미만 했다 마우스 연구에서 제외 되었다.
  6. 옥수수 기름 완전히 해산 때까지 간헐적으로 vortexing와 60 ° C에서 20 mg/mL에서 tamoxifen을 준비 하 고 치료 하는 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 저장. Intraperitoneally tamoxifen (옥수수 기름에 100 mg/kg)를 주입 하 여 c-Fosfl/플로리다 대립 유전자 이식의 1 주 후 삭제 (i.p.) 쥐, 연속 3 일 동안 매일에. 주사를 얼마나 tamoxifen을 결정 하는 마우스 무게는 중요 하다.입니다. 타 목 시 펜 치료 후 (적절 한) 약물 치료에 대 한 쥐 그룹 (n = 5/그룹).
  7. 백혈병 진행 및 생존에 대 한 마우스를 모니터 하 고 살아남은 쥐에서 8 주 leukemic 부담 (FACS에 의해 YFP 긍정적인 세포) 주간 최대 결정 합니다.
  8. 섹션 6에서에서 설명한 것 처럼 어디에 적절 한, c Fos 삭제에 대 한 혈액 분석. 매일 살아있는 쥐의 수를 기록 하 고 그래픽 소프트웨어를 사용 하 여 실험의 끝에 생존 곡선을 플롯.

8. 유전자 변형 생쥐 모델 BCR ABL1 백혈병의

  1. LSK 절연
    1. BCR-ABL1의 식을 방지 하기 위해 아목시실린과 차에 Scl 온 유전자 변형 쥐를 유지 합니다. 이식, 전에 4 주 걸릴는 아목시실린과에서 쥐 BCR ABL1 식 차 우.
    2. 섹션 4에서에서 설명한 대로 Scl 온 유전자 변형 쥐에서 TMNCs를 격리 합니다. FACS 버퍼 #2 TMNCs (1 x PBS 0.5 %BSA + 2 mM EDTA) 106 셀/mL를 일시 중단 합니다.
    3. 혈통-긍정적인 세포에 대 한 TMNCs의 계보 셀 검출 칵테일 biotin 10 µ L을 추가 하 여 고갈 (CD5에 대 한 단일 클론 항 체 biotin 활용 [쥐 IgG2a], CD11b [쥐 IgG2a], CD45R [B220] [쥐 IgG2a], 안티-7-4 [쥐 IgG2a], 안티-Gr-1 [Ly-6 G/C, 쥐 IgG2a], 및 안티-Ter-119 [쥐 IgG2b]) 1 x 106 셀 당. 어둠 속에서, 10 분 5 분 Aspirate는 상쾌한 4 ° C에서 1200 x g 에서 완전히 회전 그리고 FACS 버퍼 # 2의 400 µ L에서 세포를 중단 FACS 버퍼 # 2의 5 mL로 세척 하 여 다음 4 ° C에서 세포를 품 어.
    4. 안티 비오 틴 항 체-FITC 켤레의 5 µ L, Ly-6A/E (Sca1) PECy7의 1.2 µ L 및 최대 108 백만 셀 CD117 (c-Kit) APC 항 체의 2.4 µ L를 추가 합니다. 볼륨을 함으로써 10 분 세척에 대 한 실 온에서 어둠 속에서 품 어 최대 5 mL FACS 버퍼 #2; 그리고 5 분 제거는 상쾌한 4 ° C에서 1200 x g 에서 원심 FACS 버퍼 # 2의 500 µ L에서 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.
    5. 블루 필터 캡 FACS 튜브에 세포 현 탁 액을 필터링 합니다.
    6. 게이트 앞으로 및 측면 살포를 사용 하 여 라이브 셀 다음, MFI를 보여준 린- 셀을 선택 합니다 (미만 10의 형광 강도 의미2) LSK 얻으려면 세포 c-키트+ 및 Sca1+ 는 biexponential에 린- 부모에서 플롯 및 (그림 7 정렬 C).
    7. 정렬된 셀을 수집 하 고 5 분 동안 4 ° C에서 1200 x g 에서 원심.
  2. 이식
    1. 치명적 4.75 Gy 이식 전에 3 h 후 다음 7.0 Gy의 분할 방사선 복용량과 BoyJ 마우스를 비추는.
    2. 비친된 BoyJ 마우스에 꼬리 정 맥 (i.v.) 통해 WT BoyJ 마우스에서 0.3 x 106 조 골 세포와 5 x 103 BCR-ABL1-LSK 셀에 3 x 103 주사.
    3. 4 주 posttransplantation, CD45.1 및 CD45.2에 대 한 받는 사람 마우스를 분석. 꼬리 정 맥 출혈이 단계 7.4에에서 설명 된 대로 말 초 혈액에서는 TMNC를 가져옵니다. FACS 버퍼의 100 µ L 셀 resuspend 1 µ L 각 1 시간 실 온에서 CD45.1 FITC와 CD45.2 PE 항 체의 셀을 품 어.
    4. FACS 버퍼와 3 mL을 볼륨을 가져와서 셀을 세척 하 고 5 분 제거는 상쾌한 고 1 x PBS의 200 µ L에서 resuspend에 4 ° C에서 1200 x g 회전.
    5. 첫 번째 게이팅 전방 및 측면 분산형, 게이팅 FITC와 PE 긍정적인 세포 흠 없는 샘플에 따라 다음에 따라 라이브 셀 CD45.1와 CD45.2에 비율 분석.
    6. 4 개의 그룹으로 그룹화 하는 쥐 (n = 6 그룹 당). Imatinib 치료 시작 (75 mg/kg 2 매일 x) 혼자와 함께 DFC + BCI (모두 약 2 10 mg/kg의 복용량에 주어진 매일 x).
    7. 마찬가지로, imatinib (75 mg/kg) + curcumin (150mg/kg) + BCI (10 mg/kg) 및 imatinib (75 mg/kg) + NDGA (100mg/kg) + BCI (10 mg/kg)의 조합으로 다른 그룹에 대 한 치료 3 개월, 하루, x 2로 주입 된 i.p.
    8. CD45.2의 비율을 결정 함으로써 leukemic chimerism에 대 한 6 개월 동안 한 달 x 쥐 1 분석 꼬리에 의해 말 초 혈액에서 세포 정 맥 출혈 설명 된 대로 긍정적인 단계에서 7.4.

9. Vivo BCI와 DFC 활동의 평가에서

  1. 인-p38 분석
    1. 섹션 7에에서 설명 된 대로 BCR ABL1 표현 하는 c-키트+ 세포, 이식 했다 3 leukemic 쥐 (8-12 주 이전)를 가져가 라. BCI (10 mg/kg)로 i.p. 4 주 posttransplant를 주입 하 여 쥐를 주사.
    2. 인-p38 주변 혈액 공급 업체의 지침에 따라 인 산화 흐름 cytometry 키트를 사용 하 여 TMNC의 수준을 측정 합니다. 혈액에서에서 수집 각 마우스 전과 6 h 약물 주입 후. RBC 고갈으로는 TMNCs를 분리 하 고 그들을 다음과 같이 수정.
    3. 말 초 혈액의 100 µ L 당 RBC 세포 솔루션의 4 mL를 추가 합니다. 믹스와 Rbc. 4 ° C에서 5 분 동안 1200 x g 에서 셀 아래로 스핀을 lyse 제거는 상쾌한을 5 분 동안 얼음에 품 어. 더 많은 x 세포 1을 반복 합니다.
    4. 두 번째 세포 단계 후 PBS에 2 %BSA 1 mL와 함께 셀 펠 릿을 세척. 고정 및 permeabilization 솔루션의 100 µ L을 추가 하 여 셀을 수정 하 고 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 품 어. 4 ° c.에서 5 분 동안 1200 x g 에서 원심 분리 하 여 셀을 펠 렛
    5. Permeabilization 워시 x 1의 1 mL와 펠 릿을 세척. 20 분 100 µ L의 3 개의 동등한 aliquots 셀 분할 하기 위해 실내 온도 permeabilization 워시 버퍼에서 2 %BSA 300 µ L을 추가 하 여 셀을 차단 (~ 1 x106).
    6. 고정된 셀의 각 약 수를 각각 총 p-38 항 체, 항 체 인 p38의 1 µ L 또는 isotype IgG 제어의 1 µ L의 1 µ L을 추가 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어
    7. 1 세포를 씻어 x 5 mL PBS에 2 %BSA 고 실 온에서 1 h에 대 한 2 차 항 체 (알 렉 사 Fluor-488 활용의 1 µ L)으로 품 어. 다시 x 1 셀을 세척 하 고 1x PBS의 200 µ L에서 그들을 중단.
    8. FACS에 의해 데이터를 취득 하 고 교류 cytometry 분석 소프트웨어에 의해 분석.
    9. 실험 샘플의 MFI에서 IgG 컨트롤의 MFI를 공제 한다. 인-p38 MFI 값 다음 BCI 주입 후 인-p38 레벨을 결정 하기 위해 총 p-38의 정규화 됩니다.
  2. C-Fos 대상 유전자의 정량 유전자 표정 분석
    1. 섹션 7에에서 설명 된 대로 BCR ABL1 표현 하는 c-키트+ 세포로 이식 했다 3 leukemic 쥐 (8-12 주 이전), 가져가 라. 각 마우스에서 말 초 혈액을 수집 하 고 10 mg/kg 각 DFC + BCI와 쥐를 주입.
    2. 약물 주입 후 말 초 혈액 6 h를 수집 합니다. 위에서 설명한 대로 TMNCs RBC 고갈으로 격리 합니다. 펠 렛은 TMNCs 및 페 놀 기반 세포의 용 해 버퍼에서 그들을 중단 ( 재료의 표참조).
    3. Bcl2l11, Lif, 일리노이-6 유전자 특정 뇌관 ( 표 1참조)를 사용 하 여 실시간 정량 분석 (섹션에서에서 설명한 대로 1)를 실시 합니다.

10. 장기 문화 시작 셀 분석 결과

참고: LTCIC 분석 결과 앞에서 설명한25수행 되었다.

  1. MEMα에 마우스 fibroblast 세포 선 MS-5 confluency T175 조직 배양 플라스 크에서 성장. HEK293T에 대 한 위에서 설명한 대로 셀을 trypsinize. 2 x 106 셀/mL에서 MEMα 셀을 일시 중단 합니다. 10 x 106 셀 50 mL 원뿔 튜브에 고 80 Gy에서 비추는. 10 %FBS (M10) 미디어와 함께 보충 하는 MEMα에서 106 셀/mL x 0.5 셀을 희석. 12-잘 접시에 잘 당 2 mL 접시 하 고 37 ° C, 5% CO2 배양 기 하룻밤 사이에 그것을 품 어.
  2. 다음 날, 2.5 mg MEMα (1 M 솔루션)의 5 mL에 용 해 하 여 날린 나트륨 hemisuccinate를 준비 합니다. 필터-소독 biosafety 두건에서 0.2 µ m 주사기 필터를 사용 하 여 날린 솔루션. 100 µ M 솔루션을 얻기 위해 가상 직렬 희석 하 여는 날린 희석. 인간의 장기 배양 (HLTM)의 25 ml이 250 µ L를 추가 (참조 테이블의 재료) 그냥 사용 하기 전에, 1 µ M의 최종 농도 달성 하기 위해.
  3. CML CD34+ 와 UCP3 TMNCs 스핀 짧은 vortexing, 여는 HLTM에서 그들을 중단 하 고 카운트는 hemocytometer에 의해 결정.
  4. 기질 세포와 시드 12-잘 접시에서 M10 미디어에서 진공 하 고 환자 세포의 1 mL (CML CD34+ [10000] 및 UCP3 TMNCs [1 x 106]) HLTM에 서 스 펜 션. 셀 당 약 조합 당 3 개의 우물을 사용 합니다.
  5. HLTM에 필요한 농도의 2 배를 마약 주식 희석. 1 x 약물 농도를 위에서 언급 한 세포를 약물과 미디어의 1 mL를 추가 합니다. 5 주 동안 매주 갓된 HLTM와 미디어의 절반을 교체 합니다.
  6. 6 주 LTC IC 시험 기간의 끝에, 문화에서 nonadherent 셀 튜브로 수집 합니다. 부착 세포 trypsinize을 해당 nonadherent 세포와 그들을 결합 합니다.
  7. 스 중간 포함 30% 태아 종 아리 혈 청, erythropoietin (3 단위/mL), SF에에서 셀과 CFUs에 대 한 분석 결과 세척 (50 ng/mL), 및 IL-3(20 ng/mL), 일리노이-6 (20 ng/mL), G-CSF (20 ng/mL), 및 granulocyte/대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF) (20 ng / mL).는 hemocytometer에 의해 개수 결정.
  8. 3 복제에 플레이트 5 x 104 셀. 20 %FBS 10 %DMSO 나머지 셀 아래로 고정. 1 오픈 접시 중간에 물을 포함 하는 큰 페 트리 접시에 접시 논의. 큰 페 트리 접시를 신중 하 게 커버 하 고 37 ° C, 5% CO2 배양 기 2 주 동안에 품 어.
  9. 2 주 후에 식민지를 점수. 경우에 따라 수확의 유일한 부분 이다 분석 CFUs에 대 한). CFUs 셀 수확의 부분에서 얻은 기반으로 하는 LTCIC에 바탕 하 여 초기 셀 서 스 펜 션의 총 수를 계산 합니다. LTC-IC 당 평균 CFU 출력 8입니다.
    참고: 예를 들어 처음 1 x 106 세포 5 주 후에 잘 도금 했다 경우 0.5 x 106 세포 수확 했다, CFU에 대 한 5 x 104 의 세포 도금 했다 그리고 50 CFUs 얻어 졌다. 이 500 CFUs/1 백만 도금된 셀을 같습니다. 이 수는 62.5, LTCIC을 8로 나눕니다.

11. 인간 답게 된 CML CD34를 사용 하 여 마우스 모델+ 세포

  1. Sublethally 8 주 오래 끄 덕 scid 감마 쥐, 인간의 IL3 표현 비추는 GM-CSF와 50 래 드/min 7.0 Gy (700 래 드)의 단 하나의 복용량으로 SCF (NSGS).
  2. 3 x 106 CD34 주사+ 세포에서에서 선택한 BCR-ABL1-긍정적인 CML 만성 단계 환자가 방사능된 쥐로 정 맥 주사에 의해.
  3. 2 주 후 이식, leukemic engraftment FACS CD45에 대하여 마우스 및 인간의 특정 항 체를 사용 하 여 골 수에서 결정 합니다.
  4. FACS 분석을 수행 합니다.
    1. 받아 이식된 생쥐의 화관에서 골 aspirate. Rbc RBC 세포의 용 해 버퍼를 사용 하 여 위에서 설명한 대로 lyse 고 원심 분리 하 여는 TMNCs를 수집 합니다. 펠 릿 1 씻어 감기 1 x PBS와 x.
    2. 인간의 FcR 블록 및 마우스 FcR 블록 CD45 FITC와 반대로 마우스 CD45 APCCy7 4 ° c.에 하룻밤 안티 인간 얼룩 뒤 셀 차단 LSRII에 FACS 분석을 수행 하 고 교류 cytometry 분석 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석.
  5. 4 명의 다른 동료로 그룹화 하는 쥐 (n = 6/그룹) 차량, imatinib (75 mg/kg), DFC + BCI (10 mg/kg에서 둘 다), 또는 imatinib (75 mg/kg) + DFC + BCI (10 mg/kg에서 둘 다) 처리를 위해. 1 x PBS (차량)의 재고 약물을 희석 하 고 그들 i.p. 2를 주입 하 여 그들을 관리할 매일 x.
  6. 6 주 동안 쥐 취급 하며 11.4에서 위에서 설명한 대로 이식 후 8 주 까지는 2 주마다, leukemic 부담을 결정.

결과

Oncogene 중독 TKIs의 치료 효능에 연루 되었습니다. 그러나, oncogene 의존 운전 메커니즘 이해 되지 않는다. 우리는 중독을 계획에 관련 된 유전자 구성 요소를 식별 하기 위해 여러 편견된 유전자 식 분석을 수행. 이러한 분석 3 유전자, c Fos, Dusp1, 및 Zfp36, 암 세포는 생존을 위한 종양 신호에 의존 하 고, 따라서, TKI 치료를 구분 하지 않습니다의 upregulation를 공개 했다. ShRNA 중재 ...

토론

암 세포의 대량에 대 한 치료 응답 TKI은 티로신 키 니 아 제 oncoprotein 신호는 종양은 중독의 봉쇄에 의해 중재 됩니다. 그러나, 상대적으로 작은 MRD에 기여 하는 암 세포의 소수 oncogene 의존과 치료4를 탈출 하는 방법에 대 한 알려져 있다. 최근 연구는 백혈병에 단단한 기관 종양 약물 저항을 중재 성장 인자 신호 밝혀. 이 다양 한 분자 메커니즘 본질적인 저항10

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

저자 BaF3 및 WEHI 세포를 제공 하기 위한 G. Q. 데일리 감사 이며 T. Reya MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP에 대 한 구성. 저자는 M. 캐롤 감사 CML 폭발 위기에서 환자 샘플을 제공 합니다. 이 연구 NCI (1RO1CA155091), 백혈병 연구 재단 및 V 재단, 그리고 NHLBI (R21HL114074-01)에서 석사를 교부 금에 의해 지원 되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Biological Materials
RPMICellgro (corning)15-040-CV
DMEMCellgro (corning)15-013-CV
IMDMCellgro (corning)15-016-CVR
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin FragmentTakaraT100B
MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU)Stem Cell3434
MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU)Stem Cell4434
4-HydroxytamoxifenSigmaH6278
Recombinant Murine SCFProspecCYT-275
Recombinant Murine Flt3-LigandProspecCYT-340
Recombinant Murine IL-6ProspecCYT-350
Recombinant Murine IL-7Peprotech217-17
DFCLKT Laboratories Inc.D3420
BCIChemzon ScientificNZ-06-195
ImatinibLC LaboratoryI-5508
CurcuminSigma458-37-7
NDGASigma500-38-9
Penn/StrepCellgro (corning)30-002-CI
FBSAtlanta biologicalS11150
Trypsin EDTA 1xCellgro (corning)25-052-CI
1x PBSCellgro (corning)21-040-CV
L-GlutamineCellgro (corning)25-005-CL5 mg/mL stock in water
PuromycinGibco (life technologies)A11138-03
HEPESSigmaH7006
Na2HPO4.7H2OSigmaS9390
Protamine sulfateSigmaP33695 mg/mL stock in water
Trypan Blue solution (0.4%)SigmaT8154
DMSOCellgro (corning)25-950-CQC
WST-1Roche11644807001
0.45 μM acro disc filterPALL2016-10
70 μm nylon cell starinerBecton Dickinson352350
FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose)Simga1083
PBSCorning21040CV
LS ColumnsMiltenyi130-042-401
Protease Inhibitor CocktailRocheCO-RO
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2SigmaP5762
Nitrocullulose MembraneBio-Rad1620115
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)Thermo Scientific34075
CD5eBioscience13-0051-82
CD11beBioscience13-0112-75
CD45R (B220)BD biosciences553092
CD45.1-FITCeBioscience11-0453-85
CD45.2-PEeBioscience12-0454-83
hCD45-FITCBD Biosciences555482
Anti-Biotin-FITCMiltenyi130-090-857 
Anti-7-4eBioscienceMA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)eBioscience13-5931-82
Anti-Ter-119eBioscience13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7BD 558612
CD117 APC BD 553356
BD Pharm LyseBD 555899
BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution)BD 554714
BD Perm/Wash  (permeabilization and wash solution for phospho flow)BD 554723
phospho p38Cell Signaling Technologies4511S
total p38Cell Signaling Technologies9212
Mouse IgG controlBD 554121
Alexa Flour 488 conjugated InvitrogenA-11034
Calcium ChlorideInvitrogenK278001
2x HBSInvitrogenK278002
EDTAAmbionAM9261
BSASigmaA7906
Blood Capillary TubesFisher22-260-950
Blood Collection TubeGiene Bio-One450480
Newborn Calf SerumAtlanta biologicalS11295
ErythropoieinAmgen5513-267-10
human SCFProspecCYT-255
Human IL-3ProspecCYT-210
G-SCFProspecCYT-220
GM-CSFProspecCYT-221
MyeloCult (media for LTCIC assay)Stem Cell Technologies5100
Hydrocortisone Sodium HemisuccinateStem Cell Technologies7904
MEM alphaGibco12561-056
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2Becton Dickinson329461
Mortor pestleCoor tek 60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM)Butler Schien29405
SOCNew England BiolabsB90920s
AmpicillinSigmaA0166100 mg/mL stock in water
Bacto agar (agar)Difco214050
Terrific brothBecton Dickinson243820
AgaroseGenemateE-3119-500
Doxycycline chowTestDiet.com52662modified RMH1500, Autoclavable 5LK8  with 0.0625% Doxycycline 
TamoxifenSigmaT5648
Iodonitrotetrazolium chloride SigmaI10406
Kits
Dneasy Blood & tissue kitQiagen69506
GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye)PromegaM1722
miRNeasy Mini Kit  (RNA isolation kit)Qiagen217084
DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR)Ambion, Life TechnologiesAM1906
Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis)Invitrogen18080051
SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR)Bio-Rad1725270
CD117 MicroBead KitMiltenyi130-091-224
Human Long-Term Culture Initiating Cell AssayStemp Cell Technologies
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubatorThermo scientific
Swing bucket rotor cetrifuge 5810REppendorf
TC-10 automated cell counterBio-RAD
C-1000 Thermal cyclerBio-RAD
Mastercycler Real Plex 2Eppendorf
ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots)Bio-RAD17001401
Hemavet (boold counter)Drew-Scientific
LSR II (FACS analyzer)BD 
Fortessa I (FACS analyzer)BD 
FACSAriaII (FACS Sorter)BD 
Magnet StandMiltenyi
Irradiator J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CAMark I Model 68Asource Cs 137
Mice
ROSACreERT2Jackson Laboratory
Scl-tTA Dr. Claudia Huettner’s lab
BoyJ mouse core facility at CCHMC
C57Bl/6 Jackson Laboratory
NSGSmouse core facility at CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- Made in house
ROSACreERT2/c-Fosfl/flMade in house
Cells
BaF3Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
WEHIGift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
CML-CD34+ and Normal CD34+ cellsUniversity Hospital, University of Cincinnati

참고문헌

  1. Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
  2. Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).
  3. Mahon, F. X., et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).
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