초초파라마그네틱 산화질소 나노프로브의 합성, 특성화 및 적용

요약

결핵 균균에 대한 혈청학적 진단 테스트를 개선하기 위해 초파라마그네틱 산화철 나노프로브를 개발하여 폐결핵을 검출했습니다.

초록

초파라마그네틱 산화물(SPIO) 나노입자 및 결핵 표면 항체(MtbsAb)를 포함하는 분자 이미징 프로브를 합성하여 폐외 결핵(ETB)에 대한 이미징 감도를 향상시켰다. SPIO 나노프로브를 합성하고 MtbsAb와 공액화하였습니다. 정제된 SPIO-MtbsAb 나노프로브는 TEM 및 NMR을 사용하는 것을 특징으로 하였다. 프로브의 표적화 능력을 결정하기 위해, SPIO-MtbsAb 나노프로브는 시험관내 이미징 검사를 위해 Mtb로 배양하고 자기 공명(MR)으로 생체 내 조사를 위해 Mtb 접종 마우스에 주입하였다. Mtb 및 THP1 세포의 자기 공명 영상(MRI)에 대한 대비 향상 감소는 SPIO-MtbsAb 나노프로브 농도에 비례하는 것으로 나타났다. Mtb-감염된 마우스내의 정맥 SPIO-MtbsAb 나노프로브 주사 30분 후, 육아종 부위의 신호 강도는 PBS 주사를 받은 마우스에 비해 T2 가중 MR 이미지에서 14배 향상되었다. MtbsAb 나노 프로브는 ETB 검출을 위한 새로운 양식으로 사용될 수 있습니다.

서문

전 세계적으로, 폐외 결핵 (ETB)는 결핵 (TB) 케이스의 중요한 비율을 나타냅니다. 그럼에도 불구하고, ETB 진단은 종종 그것의 교활한 임상 프리젠 테이션 및 진단 테스트에 대한 성능 저하 로 인해 놓치거나 지연됩니다; 거짓 결과는 산 빠른 간균에 대한 부정적인 가래 얼룩을 포함, 조직 병리학에 육아종 조직의 부족, 또는 배양 결핵에 실패 (Mtb). 일반적인 케이스에 비해, ETB는 적게 빈번하게 생기고 Mtb 간균의 작은 해방을 관련시킵니다. 또한, 일반적으로 림프절, 흉막 및 골관절 부위^1과같이 접근하기 어려운 부위에 국한되어 있다. 따라서, 세균 학적 확인을 위험하고 어렵게 만드는 적절한 임상 표본을 얻기위한 침습적 인 절차는 필수적입니다^2,3,4.

ETB에 대한 시판되는 항체 검출 시험은 광범위한 민감도(0.00-1.00) 및 모든 폐 부위에 대한 특이성(0.59-1.00)이^{결합된 5로}인해 임상 적 검출에 신뢰할 수 없다. 인터페론-γ, 배양 여과 단백질(CFP) 및 초기 분비 항원 표적(ESAT)에 대한 효소 연계 면역스팟(ELISPOT) 분석실험은 잠복 및 활성 결핵 을 진단하는데 사용되어 왔다. 그러나, 결과는 ETB^6,7,8을진단하기 위한 다른 질병 사이트 사이에서 변화합니다. 또한, 피부 PPD(정제단백질 유도체) 및 정산페론-TB는 잘못된 음성 결과를 자주^제공9. QuantiFERON-TB-2G는 환기관으로부터 의편을 필요로 하지 않는 전혈 면역 반응성 분석법이며,이것은 대체 진단 도구^{6,10,11일일}수 있다. 전형적으로 중합효소 연쇄 반응과 같은 결핵 수막염에 사용되는 다른 진단 방법은 임상 진단^12,13을자신있게 배제하기에는 여전히 너무 민감하지 않다. 이 전통적인 시험은 폐 감염 사이트를 발견하기 위하여 부족한 진단 정보를 보여줍니다. 따라서, 새로운 진단 양식은 임상적으로 요구됩니다.

분자 화상 진찰은 생체 내 질병 프로세스의 특정 분자 표적을 직접 스크리닝할 수 있는 새로운 공구를 디자인하는 것을 목표로^{합니다 14,15.} T2 가중 NMR 조영제인 초파라마그네틱 산화물(SPIO)은 자기공명(MR) 이미징(MRI)^16,17의특이성 및 민감도를 현저히 향상시킬 수 있다. 이 새로운 기능적인 화상 진찰 양식은 리간드 수용체 상호 작용을 통해 분자 수준에 있는 조직 변경을 정확하게 스케치할 수 있습니다. 본 연구에서, SPIO 나노입자를 포함하는 새로운 분자 이미징 프로브는 ETB 진단을 위해 Mtb 표면 항체(MtbsAb)와 접합하도록 합성되었다. SPIO 나노 프로브는 검사^18,19에서조직과 신체에 최소 침습적입니다. 또한, 이러한 나노 프로브는 파라마그네틱 특성으로 인해 낮은 농도에서 정확한 MR 이미지를 시연할 수 있습니다. 또한, SPIO 나노 프로브는 철 이온의 존재가 정상적인 생리학의 일부이기 때문에 적어도 알레르기 반응을 유도하는 것으로 나타났다. 여기서, ETB를 표적화하는 SPIO-MtbsAb 나노프로브의 민감도 및 특이성을 세포 및 동물 모델 모두에서 평가하였다. 결과는 나노 프로브가 ETB 진단을 위한 초과민성 화상 진찰 에이전트로 적용되었다는 것을 보여주었습니다.

프로토콜

동물 실험에 관한 모든 프로토콜은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건 원 지침 (8 판, 2011)에 따라 실험실 동물 사육에 대한 표준 운영 절차를 따르며, 동물 보호 및 사용 위원회를 운영합니다.

1. SPIO 나노 입자 합성

1. dextran 코팅 된 산화철 자기 나노 입자를 실온에서 dextran T-40 (5 mL; 50 % w) 및 수성 FeCl₃× 6H₂O (0.45 g; 2.77 mmol) 및 FeCl₂× 4H₂O (0.32 g; 2.52 mmol) 용액을 격렬하게 교반하여 준비하십시오.
2. NH₄OH (10 mL; 7.5 % v / v)를 빠르게 추가하십시오.
3. 1시간 동안 블랙 서스펜션을 추가로 저어; 그 후, 17,300 x g에서 10 분 동안 원심 분리를 한 다음 응집체를 제거합니다.
4. 최종 SPIO 제품을 겔 여과 크로마토그래피(20)에 의해 언바운드 덱스트란트^T-40과분리한다.
5. 반응 혼합물(총 부피 = 5 mL)을 2.5 cm × 33 cm 컬럼에 적재하고 0.1 M Na 아세테이트 및 0.15 M NaCl을 pH 7.0에서 포함하는 완충액으로 용해한다.
6. 공극 부피에서 정제된 덱란 코팅 된 산화철 자기 나노 입자를 수집하고 염산 및 페놀 / 황산 방법^20을사용하여 330 및 490 nm에서 철 및 덱스렌용 컬럼 용루를 각각 분석합니다.

2. SPIO-MtbsAb 합성

1. 이전에 보고된 방법^21,22를사용하여 SPIO-컨쥬게이션EDBE를 합성한다.
2. SPIO-EDBE-간결한 무수화물 (SA)을 합성합니다.
   1. 24 시간 동안 실온에서 SPIO-EDBE 및 SA (1g; 10 μmol)의 알칼리성 용액 (5 M NaOH; 10 mL)을 저어줍니다.
   2. 분자 다공성 멤브레인 튜브 (12,000-14,000 MW 컷오프)를 사용하여 증류수 2 L의 20 변화로 용액을 투석하십시오. 각 변경에 대해 6 시간.
3. 마지막으로, SPIO-EDBE-SA 100 μL(Fe의 4 mg/mL)을 4.5 mg/mL MtbsAb의 400 μL에 추가하여 SPIO-MtbsAb를 1-로 합성합니다. 하이드록시벤조트리졸 및(벤조트리아졸-1-일록시) 트리롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트를 촉매로서 실온에서 24시간 동안 저어.
4. 마지막으로, 겔 여과 크로마토그래피를 통해 언바운드 항체로부터 솔루션을 분리합니다.
5. 반응 혼합물(5 mL)을 2.5 cm× 33 cm 컬럼에 적재하고 PBS 완충액을 사용하여 용성한다. 비신코닌산 단백질 분석^{키트(23)를}사용하여 Ab-nanoparticle 복합체(즉, 나노프로브)를 확인한다.

3. 입자 형태 관찰 및 이완 계층 측정

1. 100 kV의 전압에서 투과 전자 현미경을 사용하여 평균 입자 크기, 형태 및 크기 분포를 검사합니다.
   1. 복합 분산액을 200메쉬 구리 그리드에 떨어뜨리고 실온에서 공기 건조한 후 현미경으로 적재합니다.
2. 20 MHz 및 37.0°C ±0.1°C에서 NMR 이완계를 이용하여 나노프로브의 이완 시간값(T1 및_T2)을측정하였다.
   1. 각 측정 전에 완화계를 보정합니다.
   2. 반전-회수 및 Carr-Purcell-Meiboom-Gill 펄스 시퀀스를 통해 생성된 8개의 데이터 포인트로부터 r₁ 및 r2 값을 각각 기록하여 r₁ 및 r2 완화도^20을결정합니다.

4. 세포 화상 진찰

1. RPMI 1640에서 인간 단핵구 THP-1을 10 % 태아 소 혈청, 50 μg / mL 젠타마이신 황산염, 100 단위 / mL 페니실린 G 나트륨, 스트렙 토마이신 황산염 100 μg, 0.25 μg / mL 균존에서 5 %_CO2 인큐베이터에서 재배하십시오.
2. 인큐베이트 SPIO-MtbsAb 나노프로브(2 mMM)와 마이코박테리움 보비스 BCG의^106개의 콜로니 형성 단위(CFU)를 마이크로센트리퓨지 튜브(1 mL)에서 1×10⁷ 활성 단핵구로 미리 인양하여 37°C에서 37°C에서_CO2 인큐베이터에 1시간 동안 배양하였다.
3. 200 x g의 원심 분리튜브를 폐기하고 상급튜브를 버린다. 배지(200 μL)에서 펠릿을 재용해 한다.
4. 빠른 그라데이션 에코 펄스 시퀀스를 사용하여 샘플을 스캔(반복 시간(TR) = 500; 에코 시간(TE) = 20; 플립 각도 = 10°) 통해 3.0-T MRI를 통해 나노프로브의 특이성 및^{민감도(21,22)를}결정한다.

5. BCG (바실러스 칼메트-게린) 접종

1. Sauton의 배지에서 동약 백신 또는 세균 성 스톡을 재구성한 다음 앞서 설명한 대로 적절하게 분산될 때까지 식염수로 주식을^{희석합니다(24).}
2. ADIMMUNE (타이페이, 대만)에서 얻은 M. bovis BCG의 살아있는 감쇠 균주를 접종 (Connaught 균주; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux)의 부피에서 0.1 mL/마우스(즉, 10⁷ CFU)를 마우스의 왼쪽 또는 오른쪽 등쪽 견갑골 피부내로, 앞서^23일설명한 바와 같이. 음성 대조군으로 생쥐에 식염수 주입. BCG 접종 후 매일 동물을 모니터링하십시오.
3. 이산화탄소 안락사를 사용하여 박테리아 접종 후 1 개월 동안 동물을 희생하십시오. 상상 접종 부위에서 조직을 수확하십시오. 조직을 10% 포르말린에 고정시키고 5-10 μm의 직렬 섹션에 파라핀에 포함시키고, 페마톡실린/에오신 및 지엘-넬센 얼룩을 함유하여 산성 고속^{박테리아(24)와} 페릭 아이언^25용베를린 블루를 함유하였다.

6. 생체 내 MRI

1. 케타민 (체중 80 mg/kg)과 자일라진 (12 mg / kg 체중)을 동물 마취를 위해 마우스에 피하주사하십시오.
2. SPIO-TbsAb 프로브(2 nmol/200 μL)를 마우스의 꼬리 정맥에 주입합니다. MR 영상 마우스는 프로브 주입 전후 직후에 30분 동안 5분마다 T2 가중치가 있는 고속 스핀 에코 이미지를 획득한다(TR =3000; TE = 90; 시야 = 8).
3. 신호 강도(SI)를 사용하여 모든 MR 이미지를 정량적으로 분석하여, Mtb 육아종 센터와 육아종 영역에 인접한 뒷근육의 비교 가능한 위치에서 관심 있는 정의된 영역의 측정.
4. 수식을 사용하여 조영제의 주입 전(SIpre; 제어) 및 0-3시간 후(SIpost) 주입 전의 SI 측정을 사용하여 상대 신호 향상을 계산합니다.
   
   [(시포스트 - 시프레)/시프레] × 100
   
   여기서 SIpre는 미리 강화된 스캔에 대한 병변의 SI이고 SIpost는 포스트 강화 스캔에 대한 병변의^{SI(21,22)이다.}

결과

SPIO-MtbsAb 나노프로브 합성 및 특성화
SPIO 나노 입자는 MtbsAb와 결합하도록 설계되었습니다. SPIO 나노입자의 표면상에 안정화된 덱천은 에피클로로히드린에 의해 가교되었다. SPIO 나노입자는 이후에 EDBE와 혼입하여 덱스렌 말단에서 1차 아민 작용기를 활성화시켰다. SA는 그 때 SPIO-EDBE-SA를 형성하기 위하여 융합되었습니다. SPIO-MtbsAb 나노프로브는 커플링 제의 존재에서 SPIO-EDBE-SA와 Mtbs...

토론

관련 연구와 유사하게, SPIO-MtbsAb 나노 프로브에 관한 우리의 연구 결과는 Mtb^27,28에대한 유의한 특이성을 입증했다. 피하 Mtb 육아종은 마우스 모델에서 결핵 주사 후 1개월 후에 발견되었다. 전형적인 결핵 육아종 성 학발견은 림프구 침투, 상피 대식세포의 존재, 및 신생 혈관을 포함했다. 산-고속 간균은 결핵 병변에 흩어졌고, MtbsAb 면역히스토화학 적 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate	Sigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazole	Sigma-Aldrich
dextran(T-40)	GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine)	Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrate	Fluka
ferrous chloride tetrahydrate	Fluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCG	Pasteur Mérieux	Connaught strain; ImmuCyst Aventis
MRI	GE medical Systems	3.0-T, Signa
NH4OH	Fluka
NMR relaxometer	Bruker	NMS-120 Minispec
Sephacryl S-300	GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25	GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off	Spectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb	Acris Antibodies GmbH	BP2027
transmission electron microscope	JEOL	JEM-2000 EX II