Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

요약

높은 지질 콘텐츠로 인해 지방 조직 전통적인 조직학 방법을 사용 하 여 시각화를 도전 하고있다. Adipo 분명 강력한 라벨 및 지방이 많은 직물의 고해상도 체적 형광 이미징 기술을 삭제 하는 조직 이다. 여기, 샘플 준비, 전처리, 얼룩, 지우기, 및 이미징에 대 한 설치 방법을 설명 합니다.

초록

지방 조직 에너지 항상성 및 체온 조절에 중심 역할을 한다. 그것은 다른 유형의 adipocytes, 뿐 아니라 체형 선구자, 면역 세포, 섬유 아 세포, 혈관 및 신경 예측 구성 됩니다. 셀 형식 지정의 분자 제어 하 고 이러한 세포의 상호 작용 점점 입각, 비록이 지방 주민 세포의 보다 포괄적인 이해 그들의 배포 아키텍처를 시각화 하 여 달성 될 수 있다 통해 전체 조직. 기존 immunohistochemistry 면역 형광 접근 지방 조직학 분석을 얇은 파라핀 포함 된 섹션에 의존 합니다. 그러나, 얇은 섹션 조직;의 작은 부분만 캡처 그 결과, 결론 조직의 어떤 부분을 분석 하 여 편견 수 있습니다. 따라서 전체 adipose 조직에 분자 및 세포 패턴의 포괄적인 3 차원 시각화를 허용 기법, Adipo-명확 하 고, 삭제 하는 지방 조직 개발 했습니다. Adipo 클리어 iDISCO에서 적응 / iDISCO +, 특정 수정에 게 완전히 제거 하는 기본 조직 형태를 유지 하면서 조직에 저장 된 지질. 함께 빛 시트 형광 현미경 검사 법, 여기는 전체 지방 조직의 고해상도 체적 이미지를 Adipo Clear 메서드를 사용 하 여를 설명 합니다.

서문

최근까지, 지방이 많은 직물 지방 세포의 비정 질 컬렉션으로의 잉태 했다. 지난 몇 년간 우리의 이해 지금 adipocytes, 체형 선구자의 종류, 면역 세포, 섬유 아 세포, 맥 관 구조, 및 신경 예측을 포함 하는 복잡 한 기관 수를 인식 하는 지방으로 더 정교한 성장 했습니다. 이 지방 주민 세포 간의 상호 작용 효과 지방 조직 및 organismal 생리학 및 이상¹발음 있다. 신흥 연구 기본 특정 상호 작용 하는 중요 한 분자 메커니즘 unraveled 있다, 하지만 더 포괄적인 이해 안정적인 구조 프로 파일링 3 차원 (3D)에 전체 조직의 필요 합니다.

지방이 많은 직물 형태학의 우리의 현재 지식은 기반 상대적으로 높은 확대 화상 진 찰 (10 X) 가진 얇은 단면도 (5 μ m)의 조직학 분석^2,3. 그러나,이 방법은 몇 가지 중요 한 제한이 있다. 첫째, 복잡 한 등 교감 신경 맥 관 구조, 많은 기능^4,5,,67에 중요 한 역할을 알려져 있습니다 filamentous 구조는 평가 하기 어려운 통해 얇은 섹션입니다. 둘째, 겉보기 무 조직 모양 및 대표적인 구조 단위에 초점의 부족, 그것은 지방 조직 구조 섹션 얼룩에 기반으로 감사 어렵다. 셋째, 지방 조직 취득 3D 해 부 재건, 전체 두뇌 형태학⁸을 연구 하는 데 사용 하는 기존의 방법에 대 한 적합 한 일관 된 직렬 섹션에 과제를 만드는 매우 높은 지질 내용을 있습니다. 이러한 요소를 감안할 때, 아직도 세포 해상도 달성 하면서 전체 지방 서비스 센터의 3D 시각화를 제공할 수 있는 전체-마운트 접근에 대 한 중대 한 필요가 있다.

전체 장기의 3 차원 체적 영상 도전 가벼운 살포의 가려지는 효과 때문 이다. 생물 학적 조직의 빛 분산의 주요 원천이 지질 수성 인터페이스에서 온다. 지질을 제거 하 여 피해를 제거 하는 노력에 대 한 지속적인 세기 왔다, 하지만 많은 수의 최근 혁신⁹되었습니다. 하나 같은 새로 개발 조직-개간 방법은 용 매 허가 기관의 immunolabeling 기반 3D 이미징 (iDISCO / iDISCO +)^10,11. 그러나 지방 조직 특정 도전 주어진 지질 높은 수준을 제공 하는, 따라서는 iDISCO 추가 수정 / iDISCO + 프로토콜 완전히 붕괴에서 조직을 보호 하면서 지질을 추출 하는 데 필요한. 수정된 프로토콜을 개발 했습니다, 지금은 Adipo 클리어 라는 고해상도 체적 영상¹²에 적합 최적의 투명도 달성 하기 위해 지방이 많은 직물의 메탄올/dichloromethane 기반 delipidation를 사용 합니다. delipidation 단계 크게 표현 endogenously 냉각 형광 단백질 GFP와 RFP, 때문에 immunolabeling에 의해 이러한 단백질의 시각화를 달성 해야 합니다. 전반적으로,이 간단 하 고 강력한 프로토콜 지방 주민 세포의 조직 수준 조직 연구에 적용할 수 있는 개발 하는 동안 체형 조상 세포, 그리고 지방 morphogenesis의 혈통 추적.

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프로토콜

동물 관리 및 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 록펠러 대학에 의해 승인 절차에 따라 수행 했다.

1. 조직 준비

1. 혈액은 조직에서 완전히 제거 될 때까지 4 ° C에서 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1 ~ 20 mL와 함께 표준 intracardiac 관류를 수행 합니다.
2. 목과 꼬리는 크게 굳 어 때까지 perfusate ~ 20 mL 통 솔루션 (4 %paraformaldehyde (PFA) 1 x PBS에) 4 ° C에서의 전환.
   주의: PFA 독성이 있다. 피부, 눈 및 점 막과의 접촉을 피하십시오. 솔루션은 증기 두건 안쪽 여야 한다.
3. 신중 하 게 그것을 손상 하지 않고 전체 지방 패드를 제거 하는 관심의 지방 패드를 해 부. 무뚝뚝한 끝난 집게를 사용 하 여 곤란 또는 조직을 압박을 피하기 위해. 모든 모피와 해 부 조직을 오염 하지 마십시오.
4. 후 4% PFA 1 x PBS에 4 ° c.에서 하룻밤에 조직 수정 각 지방 패드 15 mL 원뿔 튜브에 고정 솔루션의 ~ 10 mL와 수정 후.
5. 실 온 (RT)에서 조직 1 x PBS로 3 회 (각 1 시간)을 씻어.
6. 단기 (최대 2 주)에 대 한 조직 4 ° C에서 1 x PBS에 저장 하 고 빛 으로부터 보호. 장기 저장 (예를 들어, 1-2 년)에 대 한 전환 버퍼 0.05% 나트륨 아 지 드와 1 x PBS (방부 제)로.
   주의: 나트륨 아 지 드 구두로 섭취 또는 피부를 통해 흡수 하는 때 매우 독성이 있다. 나트륨 아 지 드 솔루션 (5% 이상) 증기 두건에서 처리 되어야 집중.

2. Delipidation 및 Permeabilization

타이밍: 1-2 일

1. 20%, 40%, 60% 및 80% 메탄올 그라데이션 B1n 버퍼 (표 1) (v/v), 예를 들어, 20% 메탄올/B1n 버퍼에 대 한 준비, 메탄올의 20 mL와 B1n 버퍼의 80 mL를 혼합. 4 ° c.에 모든 버퍼 저장 글리신 결정 채도 인해 60% 및 80% 메탄올/B1n 버퍼에서 침전 한다. 크리스탈;를 제거 하지 마십시오 액체 솔루션을 사용 하 여 다음 세척에 대 한.
   주의: 메탄올은, 자극성, 휘발성 및 가연성. 피부 또는 눈 접촉을 피하십시오.
2. 부드럽게 해 부 현미경 아래 예제에서 머리를 제거 합니다. 어떤 머리, 보풀, 또는 파편 샘플에 연결 된 이미징 동안 그림자를 발생 합니다. 새로운 튜브로 청소 샘플을 전송 합니다.
3. 달리 명시 하지 않는 한 또는 얼음에 4 ° C에서 다음 단계를 모두 수행 합니다. (예를 들어, 젊은 마른 쥐에서 후부 피하/perigonadal 지방 패드) 작은 샘플에 대 한 솔루션의 1.6 mL와 함께 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 합니다. 큰 샘플에 (예를 들면, 비만 쥐에서 지방 패드) 높은 지질 콘텐츠로 샘플 솔루션의 4 mL와 5 mL 튜브를 사용 합니다.
   1. 가로로 설정 궤도 셰이 커에 샘플을 포함 하는 튜브를 놓고 ~ 100 rpm. 샘플 튜브 안에 자유롭게 이동할 수 있는지 확인 합니다.
4. 지정 된 시간 (표 2)에 대 한 20%, 40%, 60%, 80%, 및 100% 메탄올/B1n 버퍼의 등급된 시리즈에서 샘플을 탈수. 이어지기 솔루션을 최소화 합니다.
5. Delipidate 100 %dichloromethane (DCM)와 샘플 (3 회), 부 화 시간에 각각 표 2에 표시. 샘플의 두 번째 및 세 번째 DCM 세척 끝 튜브의 바닥에 싱크 한다. 그렇지 않은 경우 전체 delipidation를 위해 보육 시간 연장 (예를 들어, 30 분에서 1-2 시간까지).
   주의: DCM 연기 후드 안에 처리 되어야 합니다. 유리 용기를 사용 하 여 저장 및 microcentrifuge 튜브 외피에 대 한 폴 리 프로필 렌에서 만들어집니다. Microcentrifuge 튜브 DCM의 장기 저장을 위해 사용할 수 없습니다. 접시 및 serological 펫 폴리스 티 렌에서 DCM와 호환 되지 않습니다. DCM은 매우 휘발성 이다. 신속 하 게 건조를 방지 하기 위해 신선한 솔루션에는 샘플을 전송 합니다.
6. 지정 된 시간 (표 2)에 대 한 100% 메탄올으로 두 번 세척.
7. 옵션: 없으면 샘플 잘 perfused, 나머지 적혈구에서 헤모글로빈의 색 될 수 있습니다 강한 autofluorescence. 4 ° c.에 하룻밤 메탄올 (메탄올의 5 볼륨 30% H₂O₂ 의 1 볼륨)에서 5% H₂O₂ 와 표 백제
8. 반전된 메탄올/B1n 버퍼 시리즈에서 샘플 rehydrate: 80%, 60%, 40%, 20% 메탄올/B1n, 및 100 %B1n 버퍼 (2 회) 지정 된 시간 (표 2).
9. 실시간에서 PTxwH 버퍼 (표 1) 2 시간에 대 한 샘플을 씻어
10. Delipidated 샘플 4 ° C (최대 1 년)에서 PTxwH 버퍼에 저장 하거나 immunostaining 단계로 바로 진행 합니다.

3. 전체 마운트 Immunostaining

타이밍: 8-10 일

참고: 다음 단계를 모두 수행 되어야 합니다 밖으로 RT에 떨고와 빛 으로부터 보호, 언급 하지 않는 한. 작은 샘플에 대 한 솔루션의 1.6 mL와 함께 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 합니다. 큰 샘플에 대 한 솔루션의 4 mL와 5 mL 튜브를 사용 합니다. 먼저 조직 또는 메탄올 처리 조직 단면도의 작은 조각에 항 체를 검사 하는 것이 좋습니다.

1. 권장된 농도에 PTxwH 버퍼에 1 차적인 항 체 희석. 항 체 희석된 솔루션 소개 항 체 침전 또는 집계를 방지 하기 위해 10 분 ~ 20000 x g에서 원심
2. 지정 된 시간 (표 2)에 대 한 1 차적인 항 체 솔루션 delipidated 샘플을 품 어.
3. 일련의 인큐베이션 단계에서 PTxwH 버퍼와 샘플을 세척: 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 1 시간, 2 시간, 4 h와 하룻밤.
4. 권장된 농도에 PTxwH 버퍼에 이차 항 체 희석. 항 체 희석된 솔루션 소개 항 체 침전 또는 집계를 방지 하기 위해 10 분 ~ 20000 x g 에서 원심
   참고: 조직 autofluorescence에 의해 발생 하는 높은 백그라운드를 방지 하려면 fluorophores 빨간색과 빨강 영역에 빛을 방출로 활용 된 이차 항 체는 권장 됩니다. 현미경에 레이저 라인 수에 따라 최대 3-4 마커 수 수 몇 군데 동시에 하나의 샘플에.
5. 지정 된 시간 (표 2)에 대 한 2 차 항 체 솔루션 샘플을 품 어.
6. 일련의 인큐베이션 단계에서 PTxwH 버퍼와 세척 샘플: 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 1 시간, 2 시간, 4 h와 하룻밤.
7. 옵션: 조직 유형 연약한, 수정 얼룩진된 조직 4% PFA 1 x PBS에 조직 형태를 유지 하기 위해 4 ° C에서 하룻밤.
   참고:이 단계는 이미징 배경을 증가할 수 있습니다. 지방 조직에 대 한이 단계를 수행할 필요는 없습니다.
8. 1 x PBS와 샘플 일련의 인큐베이션 단계에서 세척: 5 분, 10 분, 그리고 30 분.
9. 부드럽게 해 부 현미경 아래 예제에서 린 트를 제거 합니다.

4. 조직 개간

타이밍: 1-2 일

1. 선택 사항: agarose 빛 시트 현미경 검사 법에 대 한 샘플 장착을 촉진 하기에 샘플을 포함 합니다.
   참고:이 단계는 좋습니다 이미징 동안 모양을 안정화를 지방 조직에 대 한.
   1. 1 x PBS (w/v)에서 1 %agarose 포함 솔루션을 준비 합니다. 포함 솔루션 쿨 ~ 40 ° C ~ 샘플 과도 한 열을 노출 하지 마십시오.
   2. (예, 페 트리 접시 또는 보트 무게) 금형 청소 샘플을 배치 하 고 원하는 위치에 정렬. 어떤 액체의 carryover를 하지 마십시오. 부드럽게 샘플 포함 솔루션을 붓는 다. 어떤 공기 방울을 피하십시오.
   3. 완전 실시간 컷에 샘플을 포함 하는 블록을 공고히 하는 agarose를 하자.
      참고: 하룻밤 외피를 포함 하 여 다음 단계를 모두 수행 되어야 합니다 밖으로 RT에 떨고와 빛 으로부터 보호. 작은 샘플에 대 한 솔루션의 1.6 mL와 함께 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 합니다. 큰 샘플에 대 한 솔루션의 4 mL와 5 mL 튜브를 사용 합니다.
2. 지정 된 시간 (표 2)에 대 한 H₂소개할 25%, 50%, 75% 및 100% (3 회)와 메탄올에서에서 샘플을 탈수.
   참고: 샘플 100% 메탄올 단계에서 하룻밤 남아 있을 수 있습니다.
3. (3 회)을 떨고와 1 시간에 대 한 100 %DCM 샘플을 품 어. 샘플 각 DCM 세척의 끝에 관의 바닥에 싱크 한다. 그렇지 않은 경우에 메탄올의 완전 제거를 보장 하기 위해 보육 시간 연장. 샘플은 100 %DCM 단계에서 하룻밤 남아 있을 수 있습니다.
4. 일치 하는 굴절률을 달성 하기 위해 가벼운 떨고와 dibenzyl 에테르 (DBE)에 샘플 밤새 품 어.
   참고: 샘플 결국 가시 광선에 투명 하 게 될 것 이다.
   주의: DBE 위험입니다. 피부와 접촉을 하지 마십시오. 두 계층 장갑 연기 후드 안에 그것을 처리 합니다. 최대한 빨리 그것은 DBE와 함께 오염 된 장갑을 삭제 합니다. 유리 용기를 사용 하 여 저장 및 microcentrifuge 관 (폴 리 프로필 렌) 외피에 대 한. Microcentrifuge 튜브 DBE의 장기 저장을 위해 사용할 수 없습니다. 접시 및 폴리스 티 렌에서 혈 청 학적인 펫 DBE와 호환 되지 않습니다. 100% 에탄올으로 어떤 유출 청소.
5. 어둠 속에서 RT에서 샘플 2 h. 저장소 떨고 가벼운와 신선한 DBE와 함께 샘플을 품 어 나 영상에 직접 진행.
   참고: 샘플은 한 달 내 이미지를 권장 됩니다. 특정 fluorophores 다른 사람 들 보다 더 안정 되어 있지만,이 단계에서 샘플의 장기 보관 권장 하지 않습니다.

5입니다. 현미경

1. 빛-시트 현미경 DBE와 호환 되는 이미지입니다.
   참고: 유기 용 매 기반 이미징에 대 한 승인 되 고 DBE의 굴절률과 일치 하는 유일한 목표는 DBE 몰입 이미징에서 목표를 찍기로 사용할 수 있습니다.
   1. Agarose 포함 샘플 영상 동안 움직임을 막을 수 있는 홀더에 탑재 합니다. DBE 채워진 챔버로 샘플을 담가.
   2. Z-스택 전체 샘플 (예를 들어, 1-2 배 확대) 전체 조직 유통/관심의 마커의 구조를 취재를 수집 합니다.
   3. (예를 들어, 4-12 배 확대) 자세한 구조를 이미지를 관심 영역을 확대 하려면 더 높은 확대와 함께 목표를 전환 합니다.
      참고: 콜라겐 지방 조직, 주변 모든 지방 세포¹³의 기질에 큰 기여입니다. 콜라겐은 약 400에 이르기까지 일반적인 방출 스펙트럼 550 nm¹⁴nm. 488 레이저 선 (녹색)으로 샘플을 상상 하 고 내 콜라겐 (예를 들어, 525-550 nm)의 방출 스펙트럼 파장 범위에서 방출된 빛을 수집 이전에 보여 줬던 조직 autofluorescence 신호를 제공할 것입니다. 지방 세포 윤곽 및 전반적인 조직 아키텍처¹²를 나타냅니다.
2. 거꾸로과 이미징 confocal 또는 두 광자 현미경.
   1. 모든 플라스틱 부품 (또는 인감 수 있습니다 기타 DBE 호환 이미징 챔버)을 건드리지 않고 agarose 포함 샘플 챔버 슬라이드 유리 바닥에 놓습니다. DBE 밖으로 누출 되지 않는 다는 것을 확인 하십시오.
   2. 더 깊은 침투를 달성 하 긴 작동 거리를 가진 목표를 선택 하십시오.
      참고: 이미지는 챔버 슬라이드의 유리 바닥을 통해 거꾸로 또는 2 광자 공초점 현미경으로 행해져야 한다. 샘플 및 찍기 DBE 기반 이미징에 대 한 제안 하지 목표 사이의 직접 접촉을 하지 마십시오.

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결과

Adipo 명확한 준비 전체 지방 패드 조직 형태 및 세포질 상호 작용 고 비만 상태에 영향을 분석 하는 차원에서 몇 군데 있습니다. 이 메서드는 녹색 채널에 조직 autofluorescence 신호를 수집 하 여 일반 지방 구조 분석에 쉽게 적용할 수 있습니다. 우리가 이전 것으로 나타났습니다는 autofluorescence 지방 오버레이 perilipin 얼룩, 성숙한 adipocytes¹²개요 일반적으로 ?...

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토론

Adipo 명확한 지방 조직, 일반 랩 설치에서 쉽게 실행 될 수 있는 삭제 위한 간단 하 고 강력한 방법입니다. IDISCO 등 다른 용 매 기반 개간 방법 비교 / iDISCO +^10,,1112, Adipo 클리어는 특히 지방 조직 및 다른 조직 높은 지방 콘텐츠를 지우기. Delipidation 단계 완전히 지방에서 지질을 제거 합니다 및 따라서 전체 조직에 걸쳐 immunolabeling...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148-1KG
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-500ML
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287-500ML
Heparin	Sigma Aldrich	H3393-100KU
Dichloromethane	Sigma Aldrich	270991
Hydrogen peroxide 30%	Fisher Scientific	325-100
Benzyl ether	Sigma Aldrich	108014
Agarose	Invitrogen	16500500
Sodium azide	Sigma Aldrich	71289-5G
Glycine	Fisher Scientific	BP381-1
Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase	Millipore	AB152	1:200 dilution
Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1	R&D Systems	AF3628	Final concentration of 2 µg/mL
Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11	Bio-Rad	MCA1957	Final concentration of 2 µg/mL
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	711-605-152	Final concentration of 5-10 µg/mL
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	Final concentration of 5-10 µg/mL
Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153	Final concentration of 5-10 µg/mL
Imaging chamber	ibidi	80287
Light sheet microscope	LaVision BioTec	Ultramicroscope II
Imaging software	LaVision BioTec	Imspector software
Microscopy visualization software	Bitplane	Imaris