pT3N0M0 위암 조직의 파라핀 내장 슬라이드에 탄성 염색

요약

여기에서, 우리는 포르말린 고정, 파라핀 내장 절편에 pT3N0M0 위암 조직에서 탄성 섬유를 확인하기 위하여 탄성 염색의 프로토콜을 제시합니다. 이어서, 우리는 종양 세포가 탄성 라미나 너머로 침입하는지 여부를 결정하는 방법을 기술한다.

초록

탄성 층은 일반적으로 복막 중피 세포에 인접한 중피 하부 층에 위치하며, 헤마톡실린 및 호신 (H&E) 염색에 양과성이지만 탄성 염색을 통해 시각화 할 수 있습니다. 탄성 염색의 중요한 이점 중 하나는 종양 세포가 탄성 라미나 너머로 침입했는지 여부를 쉽게 확인할 수 있다는 것입니다. 이것은 복부 표면 침략의 넓이를 검토하는 것을 돕고, 이로서 위장암에 있는 pT3 그리고 pT4 단계를 구별합니다. 본 연구에서, 우리는 포르말린 고정, 파라핀 내장 pT3N0M0 위암 조직 섹션에서 탄성 섬유를 식별하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 슬라이드에 고정 된 5-μm 파라핀 섹션을 준비하고 모든 슬라이드는 염색 절차 중에 분리되고 재수화됩니다. 그 후, 모든 섹션은 과망간산 칼륨에 의해 산화되고, 옥살산에 의해 표백되고, 탄성 염색으로 염색되고, 반 기슨에 의해 반염색됩니다. 마지막으로, 우리는 염색의 효과를 검토; 탄성 라미나는 청색-블랙염색되고 콜라겐 섬유는 빨간색으로 염색되고 암세포는 다양한 노란색 음영으로 염색됩니다. 우리는 또한 암세포와 탄성 라미나 사이의 위치 관계를 결정하는 데 사용되는 방법을 자세히 설명합니다. 이 방법은 탄성 섬유에 대한 탁월한 선택성 및 본격적인 결과로 인해 위장암에서 후막 표면 침습의 식별에 간단하고, 저렴하며, 널리 적용 가능하다.

서문

종양, 노드 및 전이(TNM) 암 발판 시스템에 따라, 병리학 단계 pT4에서 위암의 예후는 pT3(제8UICC/AJCC)에서보다 훨씬더 나쁘다 1. 위암으로, 1 차적인 종양 (pT)의 분류는 일반적으로종양 침략의 깊이에 달려 있습니다 2. 병리학적인 단계 pT3 위암은 근위 세포증을 통해 서체 조직으로 침입하는 암으로 정의되는 반면, pT4 위암은 내장 복막의 표면에 관통하는 암으로 정의됩니다. 침막 표면의 존재 침략은 두 단계^2를구별하는 열쇠입니다. 그러나, 후막 중피 세포층이 매우 얇기 때문에, 수술, 수술 후 치료 및 고정 시 손상될 수^있다3. 더욱이, 종양 관련 염증성 변화와 섬유증은 후막의 정상적인 해부학을 손상시킬 수 있으며, 이는 H&E 염색 4를 사용하여 후막표면 침입을 정확하게 판단하기가 매우 어렵다. 세포학 및 면역조직화학과 같은 현재의 보조 진단 방법은가양성이거나 비용 효율성이 낮기 때문에 진단값 5,^6이 제한된다.

상기 혈청막은 복막, 흉막 및 심낭을 포함하며, 중피, 지하막 및 중피하 부층^7로구성된다. 혈청 막의 한 가지 일반적인 조직학적 특징은 중피 세포^8,9에인접한 하부 중피 층에 탄성 층의 존재이다. 탄성 라미나는 강한 항손상 능력을 가지며 중피 세포가 심한 종양 관련 염증 또는 섬유증에 의해 파괴되는 경우 대체 예후 마커로서 작용할 수^있다3. 탄성 라미나는 주로 탄성 염색에 의해 시각화 될 수있는 엘라스틴과 마이크로 피브릴^(10)로구성된다. 탄성 염색의 사용 뒤에 주된 이유는 엘라스틴이 엘라스틴 용액에 있는 레소시놀의 페놀 그룹과 수소 결합을 형성하고, 탄성 섬유가 청색 - 검은 색으로 염색되는 원인이되기 때문입니다. 반 기손(VG)이 대조되는 염색 후, 콜라겐 섬유는 적색 및 근육 섬유및 적혈구를염색할 수 있으며 황색 8,^11,12,13.

폐암의 TNM 발판의 제8판은 내장 흉막 침막(T2)을 내장 흉막의 표면에서탄성 라미나 또는 침윤을넘어서는 종양 침입으로 정의한다 2. 대장암에 대한 연구는 pT3 대장암의 탄성 라미나 침입이 예후 가 불량한 이유일 수 있음을 보여주었습니다. 대장암의 5년 질병 없는 전반적인 생존율은 또한 pT4a^13,14,15와같은 것으로 입증되었다. 탄성 염색에 대한 우리의 이전 연구에 기초하여, 탄성 층상 침수는 pT3 위암의 예후에 상당한 부정적인 영향을 미치고 pT4a 위암(12)과 동일한 방식으로 치료되어야 한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 이 간단하고 비용 효과적인 방법은 H&E 염색을 통해 얻은 결과의 불확실성을 제거하는 데 도움이 될 수 있으며, 세포학 및 면역 조직 화학을 포함한 다른 보조 진단 방법과 관련된 기타 일반적인 한계를 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 다른. 이 방법은 위장관암의 후막 표면 침입을 진단하기 위해 효율적으로 사용할 수 있습니다, 특히 일부 모호한 경우에. H&E 얼룩 및 기타 얼룩은 일반적으로 이러한 침입을 식별하기 어렵기 때문에 편리합니다. 이 방법은 또한 특히 탄성 섬유에 매우 선택적이기 때문에 결과의 신뢰성을 보장합니다. 여기서, 우리는 종양 세포가 pT3N0M0 위암(12)에서 탄성 라미나에침입했는지 여부를 확인하기 위해 탄성 염색을 실시한다.

이 방법은 포르말린 고정, 파라핀 내장 섹션에 조직에서 탄성 섬유를 식별하는 데 사용되며, 냉동 섹션에도 사용될 수있다. 여기에서, 우리는 세포와 조직 형태학의 제일 정비를 위한 파라핀 내장 된 단면도를 선택합니다. 이 프로토콜의 모든 단계는 실온에서 수행됩니다. 제시된 연구에서는 과망간산 칼륨, 옥산 용액, 엘라스틴 용액 및 Van Gieson 용액을 포함하는 상업용 염색 키트가 사용됩니다.

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프로토콜

1994년과 2005년 사이, 환자 견본은 중앙 사우스 대학 의과 대학의 Xiangya 학교의 제휴 암 병원에 있는 2명의 경험있는 위장 병리학자에 의해 선택되었습니다, 위 신 생물의 위 절제술을 겪은 환자에게서, pT3N0M0 단계에서 위암의 수술 후 병리학 진단 (일곱 번째 TNM 스테이징에 따르면). 이 연구는 윤리 검토 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 절편

1. 파라핀 블록을 썰매 마이크로토메의 고정 홀더에 넣고 블레이드를 가로질러 앞뒤로 이동할 수 있습니다. 블록과 마이크로토메 나이프 사이의 최적의 각도를 조정합니다.
   참고: 최적의 각도는 블레이드의 형상뿐만 아니라 절삭 속도와 기술에 따라 달라집니다.
2. 필요에 따라 파라핀 블록을 다듬고 5μm 두께의 단면으로 자른다.
3. 파라핀 5-μm 섹션을 약 40-45°C의 수조에 놓고, 이어서 물에서 유리 슬라이드, 슬라이드당 한 섹션에 장착한다.
4. 종이 타월에 장착된 부분을 조심스럽게 눌러 잔류물과 잠재적인 기포를 제거합니다.
5. 섹션이 30 분 동안 공기 건조를 허용한 다음 2 시간 동안 45 - 50 °C에서 오븐에서 구워줍니다.

2. 모든 슬라이드의 탈파화 및 수화

1. 10분 동안 코플린 항아리에 실렌에 슬라이드를 담그십시오.
2. 첫 번째 자일렌 항아리에서 슬라이드를 꺼내 10 분 동안 다른 항아리에 자일렌에 담급하십시오.
3. 이제 100% 에탄올을 코플린 병에 5분 동안 담그십시오.
4. 다른 코플린 항아리에 100% 에탄올로 슬라이드를 담그고 5분 간 담그십시오.
5. 95% 에탄올로 슬라이드를 코플린 항아리에 2분 동안 담그십시오.
6. 슬라이드를 코플린 항아리에 70% 에탄올에 2분 동안 담그십시오.
   참고: 위의 단계를 수행하는 동안 슬라이드가 솔루션에 완전히 잠겨 있는지 확인합니다.
7. 슬라이드를 새 병에 증류수로 간략하게 헹구십시오.

3. 염색

1. 염색을 진행하기 전에 티슈 페이퍼로 슬라이드의 조직 주위의 여분의 용액을 닦아냅니다.
2. 슬라이드를 실내 온도 및 실내 습도 조건에 두어 전체 염색 공정전반에 걸쳐 슬라이드에 티슈가 건조되지 않도록 하십시오.
3. 5 분 동안 과망가네이트 칼륨 몇 방울로 슬라이드를 산화. 과망가네이트 칼륨의 부피가 각 슬라이드의 조직 섹션을 덮기에 충분한지 확인하십시오.
4. 산화 된 슬라이드를 코플린 항아리에 증류수로 헹구고 2 - 3 번 변경하십시오. 조직의 파란색을 관찰하십시오.
5. 지금, 표백이 슬라이드 5 분 동안 옥사산의 몇 방울을 추가하여.
6. 증류수로 채워진 코플린 항아리에 담그어 슬라이드를 헹구십시오. 헹위 2x - 3x를 수행합니다.
7. 이제 이 슬라이드를 95% 알코올로 간략하게 씻은 다음 슬라이드를 엘라스틴 용액(5 g/L)에 8-24시간 동안 담급니다.
   참고 : 엘라스틴 용액은 휘발성이며 염색 시간이 상대적으로 길기 때문에 밀봉 캡이있는 투명 유리 병과 같은 밀봉 된 용기에 탄성 염색으로 슬라이드를 담그는 것이 가장 좋습니다. 용기의 용량과 엘라스틴 용액의 부피는 모든 슬라이드의 완전한 침수를 가능하게하는 한 침지 된 슬라이드의 수에 따라 달라집니다.
8. 이 슬라이드를 95% 에탄올에 직접 1-2분 간 담그어 각 조직 부분을 잘 분화시합니다.
   참고 : 분화는 조직에 의해 흡수 된 과도한 염색을 제거하고 색상을 명확하게하는 조직 섹션의 전하의 변화를 말합니다. 엘라스틴 용액 염색 후, 분화의 어려움을 피하기 위해 샘플을 증류수로 세척해서는 안됩니다. 필요에 따라 파란색-검은색 탄성 섬유 염색 및 회색 배경이 있는지 현미경으로 확인하십시오. 후속 반 기손의 카운터스테인도 탄성 얼룩을 다소 추출할 수 있기 때문에 조직을 약간 과분화하는 것이 좋습니다.
9. 분화 후 증류수로 이 슬라이드를 완전히 헹구십시오.
10. 반 기슨의 용액에서 1분 동안 슬라이드를 카운터스테인.
    참고: Van Gieson 용액의 부피는 각 슬라이드의 조직 섹션을 완전히 담글 수 있을 만큼 충분해야 합니다.
11. 각 조직 절편을 잘 분화하기 위해 몇 초 동안 이 조각에 95% 에탄올을 빠르게 떨어뜨립니다.
    참고: 반 기슨의 카운터스테인링 후 반 기슨의 카운터스테인링의 색상을 약화하거나 심지어 용해시킬 수 있기 때문에, 반 기슨의 카운터스테인링 후 물로 슬라이드를 헹구지 마십시오.

4. 탈수 및 장착

1. 슬라이드를 95% 알코올에 5분 동안 담그면 빠르게 탈수됩니다.
2. 이 슬라이스를 100% 알코올의 2가지 변화로 계속 탈수시키고, 매번 5분 동안 슬라이드를 침지합니다.
3. 슬라이드를 3분 동안 매번 2번의 자일렌 변경 사항에 담그십시오.
4. 슬라이드에 수지 장착 매체 한 방울을 넣고 커버슬립을 상단에 놓습니다.

5. 슬라이드의 현미경 관찰

1. 혈청 방향을 찾아 탄성 염색의 결과를 관찰 : 탄성 섬유 (라미나)는 파란색 - 검은 색, 콜라겐 섬유는 빨간색스테인, 근육 섬유는 노란색 염색된다.
2. 전체 슬라이드에서 암세포를 찾으십시오 : 암세포는 노란색^12로염색됩니다.
3. 암세포와 탄성 층막 사이의 위치 관계를 결정합니다.
   참고: 여기에는 두 가지 상황이 있습니다. 전체 슬라이드에서 탄성 라미나 너머로 침입 한 종양 세포가 있는 한,이 경우탄성 라미나 침입으로 간주 될 수 있습니다. 한편, 전체 슬라이드에서 탄성 라미나 너머로 침범한 종양 세포가 없는 경우에만, 이 경우 탄성 라미나 비침침공으로 간주될 수 있다.

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결과

성공적인 탄성 염색은 pT3 위암에서 탄성 층상과 암세포를 명확하게 드러냅니다. 도 1 - 저전력 분야, 엘라스틴 용액 염색 후 현미경으로 확인, 언급 된 프로토콜에 따라 반 기손의 카운터 스테인 이전에 - 탄성 라미나가 혈청 중피 세포에 가깝고 청색 -검은색으로 염색됨을 나타낸다. 필라멘트의 형태, 그리고 여전히 종양 세포와 탄성 층사이의 특정 ?...

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토론

여기서 제안된 이 방법은 서브세로살 탄성 라미나 를 식별하기 위한 정확한 접근법을 제공한다. 상기 방법은 종양 세포가 pT3N0M0 위암(12)에서 탄성 라미나에 침입했는지 여부를 평가하는데 사용될 수 있다. 탄성 라미나는 콜라겐 섬유와 쉽게 구별 할 수없는 H & E 염색 섹션에서 적색이며 세포학 및 면역 조직 화학과 같은 다른 기존 보조 진단 방법도 제한된 진단 값을 발휘했습니?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Elastin-Van Gieson staining kit	Baso	BA4083B	Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers
Permount TM Mounting Medium	MXB Biotechnologies	DAB-0033	Used for mounting
Ethanol	LMAI Bio	LM64-17-5	100%
Xylene	LMAI Bio	LX820585