전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

요약

여기 이미지 칼슘 murine neuromuscular 접속점에 개별 셀 종류의 인구에 있는 신호 프로토콜 선물이.

초록

Electrophysiological 기법에 의해 조직에 있는 세포의 전기적 활동을 모니터링할 수 있습니다 있지만 이들은 일반적으로 개별 셀의 분석을 제한. 셀의 이미징 형광 칼슘-민감한 로드 이후는 cytosol에서 세포내 칼슘 (캘리포니아^{2 +})의 증가 종종 전기 활동 때문에 발생 합니다 또는 다른 자극의 무수에 응답,이 프로세스에 의해 모니터링 수 있습니다. 염료입니다.  그러나, 그것은이 염료는 조직 내의 모든 세포 유형에 의해 채택 하기 때문에 전체 조직 내에서 개별 셀 형식에서이 응답을 이미지 어렵다. 반면, 유전자 인코딩된 칼슘 지표 (GECIs)는 개별 셀 형식에 의해 표현 될 수 있습니다 및 세포내 캘리포니아^{2 +}, 따라서 허용의 캘리포니아^{2 +} 의 전체 인구에 있는 신호 이미징의 증가에 대 한 응답 형광 개별 셀 종류입니다. 여기, 우리는 마우스 신경 근육 학 교차로 적용할 GECIs GCaMP3/6의 사용, 모터 신경, 골격 근육, 및 터미널/perisynaptic 사이 3 자간 냅 Schwann 세포. 조직 준비 클래식 비보 전 에이 기법의 유틸리티를 설명합니다. 광 스플리터를 사용 하 여, 우리 수행 동적 캘리포니아^{2 +} 신호 듀얼-파장 이미징 및 신경 근육 학 교차로 (NMJ)의 정적 레이블 두 셀 전용 GECI 또는 유전자 인코딩된 전압 모니터링을 쉽게 적용할 수 있는 방법을 지표 (GEVI) 동시에. 마지막으로, 우리는 형광 강도의 공간 지도 캡처하는 데 사용 하는 루틴을 논의. 함께, 이러한 광학, 유전자 변형, 그리고 분석 기술은 공부를 다양 한 문맥에서에서 NMJ에 뚜렷한 세포 모집단의 생물 학적 활동을 사용할 수 있습니다.

서문

모든 시 냅 스 처럼 NMJ 3 요소의 구성: 터미널 연 접 신경 postsynaptic 신경/이펙터 셀에서에서 파생 하 고 perisynaptic glial 세포^1,2. 시 냅 시스 전송의 기본적인 측면 처음이 시 냅 스³에서 설명 되었다, 하는 동안이 프로세스의 여러 측면,이 시 냅이 스의 고유 셀룰러 요소에 의해 동일한 분자의 표현 때문에 부분에서 알 수 없는 남아 있습니다. 예를 들어 모터 뉴런 척추 NMJ에 의해 공동 출시 되는 퓨 린 아데닌 뉴클레오티드 ATP와 아 세 틸 콜린 (ACh) 수용 체 근육, Schwann 세포, 모터 신경, 따라서 복잡의 해석에 의해 표현 됩니다. 이러한 물질 (예를 들어, 송신기 릴리스 또는 응답, 근육 힘 세대)⁴에 의해 발휘 하는 기능 효과. 또한,는 NMJ의 같은 구성 요소는 간단한에 비해, 예를 들어 신경 중앙 신경 조직에 여러 개의 시 냅 스 입력, 수시로 전시 하는 모터 신경 세포, 근육 세포, 또는 Schwann 세포 다를 기반으로 하는 자극에 대 한 응답 여부 그들의 내장에 (예를 들어, 배아 파생, 섬유 하위, 형태학)이 명확 하지 않다. 각 이러한 문제를 해결 하기 위해 그것은 동시에 같은 시간, 같은 다른 별도 요소 중 하나에 응답에 트랙 뿐만 아니라 한 시 냅 스 요소 내의 많은 세포의 응답을 추적 하는 것입니다. 칼슘 신호 측정 화학 염료를 사용 하 여 기존의 전략 목욕 적용 염료 조직으로, 신청 후 여러 셀 유형에 의해 채택 되 고 침 로드 염료 시각화에 사용할 수 있기 때문에이 두 가지 목표를 달성할 수 없는 셀의 개인 또는 작은 동료 여기, 휴대 전용 칼슘 신호, 특정 영상 및 소프트웨어 도구⁵, 우리는이 두 가지 전반적인 목표의 처음을 설명 하 고 토론을 측정 하도록 설계 GECIs를 표현 하는 유전자 변형 쥐를 이용 하 여 어떻게의 새로운 유전자 변형 도구 두 번째 달성 도움이 될. 이 기술은 추적 칼슘 역학 또는 동시에 여러 세포 인구에서 유전자 인코딩 광학 센서를 통해 이벤트 관찰할 신호 다른 세포에 관심이 사람에 대 한 유용할 것 이다.

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프로토콜

축산 및 실험 치료 및 실험 동물의 사용 및 네바다의 대학에 IACUC 국가 학회 건강 가이드에 따라 수행 했다.

1. 격 막 및 유전자 변형 쥐에서 인할지 신경의 준비

1. 유전자 변형 쥐와 유전자 형을 oligonucleotide 뇌관 이러한 마우스 구입.
   참고: 뇌관은 이러한 쥐의 각에 대 한 "정보" 페이지에 표시 됩니다.
   1. Cre 드라이버 대립 유전자 변형/노크-에서 적절 한 1 부와 조건부 GCaMP3의 하나 또는 두 개의 복사본을 표현 하는 같은 나이의 두 번째 마우스 조건부 GCaMP3/6 대립 유전자의 복사본 0 3-6 개월 마우스 사육 / 6 대립 유전자와 제로 사본의 Cre 드라이버 대립 유전자.
   2. 유전자 형 Cre와 조건부 GCaMP3/6 대립 새끼와 마크 것 들-이 이제부터 이중 유전자 변형 쥐 이라고 불릴 것 이다 (예를 들어, Myf5 Cre, 조건부 GCaMP3)⁶.
      참고:이 방법으로 모든 데이터는에서 파생 Cre와 조건부 GCaMP3/6 대립 유전자의 복사본 하나를 표현 하는 쥐. 이 십자가에 다른 돌연변이 마우스 (예를 들면, 녹아웃)에 추가할 때 이것은 특히 중요 하다입니다.
2. 적절 한 나이의 이중 유전자 변형 쥐가 되는 때 (예를 들어, 0 또는 5 [P0 또는 P5] 출생 후 하루 또는 성인)가 위 (P10 보다 젊은 쥐)에 대 한 그들을 목이 또는 isoflurane 흡입 챔버에 배치 하 여 쥐를 안락사-때 더 이상 꼬리를 꼬 집는 집게의 쌍을 가진 반응, 그들은 희생에 대 한 준비입니다.
3. 가 위로 잘린 여 동물을 희생.
4. 전체 동물 간 바로 아래와 심장 그리고 iridectomy가 위 폐 바로 위에 걸쳐 transversely 섹션.
5. 멀리 간, 심장, 그리고 충분히 흡입 전극 (즉, 1-2 cm)으로 얻을 수 긴 인할지 신경의 길이 유지 하기 위해 주의 되 고 폐 해 부.
   참고: 왼쪽된 인할지 신경 왼쪽된 횡 경 막의 중간 부분을 입력 하는 직물의 백색 조각으로 확인할 수 있습니다. 그것은 폐를 제거할 때 잘라 하지 해야 합니다. 바로 인할지 신경도 뛰어난 베 나 정 맥을 포함 하 고 얇고 하얀 베 나 정 맥 보다는 근 막의 조각 내에서 실행 됩니다. 함께, 그들은 둘 다 오른쪽 중간 격 막 관통.
6. 또한 흉 곽과 횡 경 막 주위의 얇은 릿지를 제외한 척추 열을 제거 합니다.
7. 어둠 속에서 10 분 1 µ g/mL 594-αBTX와 Krebs 벨 솔루션 microfuge 관에서 횡 경 막과 인할지 신경 샘플을 놓습니다.
   참고: 594-αBTX의이 농도 그들의 기능 (개인 관찰)를 차단 하지 않고 ACh 수용 체 (AChRs) 라벨.

2. 자극과 근육 활동 전위의 기록

1. 횡 경 막을 무력화 minutien 핀을 사용 하 여 고정 6 cm 접시에 실리콘 유 전체 젤 코팅 산소 Krebs 벨 솔루션의 ~ 8 mL 가득 하 고 현미경 스테이지에 배치. 30 분에 대 한 더 많은 Krebs 벨 솔루션 (8 mL/min) 격 막 perfuse
   참고:이 빨고 언바운드 594-αBTX로 조직 해 부 후에 equilibrates.
2. ⁷설립된 방법 따라 흡입 전극을 확인 합니다.
   1. Micromanipulator를 사용 하 여 4 배 확대에서 왼쪽된 인할지 신경 흡입 전극 이동 하 고 흡입 전극에 연결 된 배관에 연결 된 5 mL 주사기의 배럴을 밖으로 당겨 흡입을 적용 합니다.
      참고: 성공적으로 흡입 전극으로 당겨 때 인할지 신경 긴장 된입니다. 자극을 자극은 인할지는 수동 틀 지 하 여 신경 스위치 1 x.
   2. 횡 경 막 계약 1 Hz 자극에 응답에서 시각적으로 명시 조명 그것을 검사 하 여 확인 합니다. 그렇지 않은 경우에 점차적으로 근육 수축의 시각적인 검사에 의해 확인 될 수 있는 supramaximal 펄스를 달성 하기 위해 전압 조절기를 켜는 여 전압을 조정. 아직도 보이지 않는, 주사기와 신경 려 고 흡입을 적용 하 여 다시 그리는 시도.
3. 관류를 끄고 특정 근육 myosin 억제제 제너 시스⁶ 또는 전압 개폐 나트륨 채널 길 항 제 µ-conotoxin⁸ 100 µ M의 최종 농도를 추가.
   1. 100 µ M 제너 시스, DMSO에 200 m m 재고 4 µ L 플라스틱와 Krebs 벨 솔루션의 1 mL에 predilute.
   2. 접시에서 Krebs 벨 솔루션의 1 mL를 제거 합니다.
   3. 접시에 제너 시스 prediluted를 추가 합니다.
      참고:이 predilution GCaMP3 표현 셀에 임시가 아닌 형광 반응의 undiluted DMSO에 의해 유도 방지할 수 있습니다.
   4. 30 분을 기다려 하 고, 또 다른 20-30 분에 대 한 신선한 Krebs 벨 솔루션의 관류를 켭니다.
4. 기록 전극 준비.
   1. 입고 장갑는 1 m m와 0.4 m m의 내부 직경 (ID)의 외경 (OD)와 붕 규 산 filamented 유리 micropipette 끌어당기는 장소와 위치에 그것을 클램프로 다이얼을 조여. 끌어당기는 사람 문을 닫습니다.
   2. P-97 끌어당기는 사람을 사용 하 여 다음과 같은 설정 프로그램: 900에서 열, 120에서 당겨, 75에서 속도, 250, 500, 그리고 아무 추가 루프에서 압력에 시간.
      참고: Resistance (R)는 앰프의 소프트웨어 컨트롤을 사용 하 여 측정: 수식 V를 해결 하 여 저항을 확인 하는 데이터 수집 소프트웨어 적외선 = 소프트웨어 컨트롤러 전극을 통해 알려진된 전류 (I) (일반적으로 1 없음)를 전달 하 고 우리 인민에 대 한 해결 하기 위해 활성화 전압 (V)에 변화를 측정
   3. 배아 격 막에 대 한 저항 60 m ω, 및 더 오래 된 격 막, 10-20 m ω에 대 한 있는지 확인 합니다. 3m KCl와 기록 전극 로드.
5. 10 배 확대에 전극 자극 전극으로 무대의 반대 측에 두 번째 micromanipulator를 사용 하 여 근육에 낮은.
6. 휴식 막 잠재력 0에서-65로 변경 될 때까지 기다립니다 electrophysiological 데이터 수집 소프트웨어를 사용 하 여, mV 또는 아래.
7. 1 Hz에서 자극 하 고 겸손 한 오버 슛을 전시 하는 큰 잠재력을 확인 하 여 근육 활동 전위의 존재를 확인 (0 이상으로 상승 잠재력-65에서 시작 될 때 뮤직 비디오 mV 또는 아래). 활동 전위와 자극 유물을 혼동 하지 마십시오.
   참고: 잠재력은 상당히 긴 기간 (~ 5 ms)에 자극 유물 보다.

3. 샘플의 형광 이미징

1. 20 X 확대, 녹색/황색 빛 여기에서 NMJs 594-αBTX-표시를 찾아 근육의 중심에 종판 밴드 찾습니다 (550 nm). 파란 가벼운 흥분으로 전환 (470 nm) 이미지 캘리포니아^{2 +} 근육, 모터 신경, Schwann 세포에 응답을.
2. 원하는 경우, 대역 통과 필터와 듀얼-파장 이미징 dichroic 단일에 지 필터 이미지 스플리터를 설정 합니다.
3. GCaMP3/6 표현 조직에 의해 전시 최대 형광 (Fmax)를 계산 하기 위해 횡 경 막 준비⁶3 M 염화 칼륨 (KCl)의 12 µ L를 추가 합니다.
   1. GCaMP3/6 표현 조직 KCl에 binning 없이 20 배 확대에 채도 전시 하는 레벨의 110%로 설정 하는 조회 테이블 바에 밝기 바와 실험을 수행 합니다.
4. 어떤 빠른 이벤트를 놓치지 하지 초당 20 프레임에 기록.
5. 충 동을 사용 하 여 흡입 전극의 기차를 제공 하 여 신경 자극의 20-40 Hz의 1-45 s 자극 하 고 또는 목욕 응용 프로그램 또는 관류 약리 촉진제를 추가 하 고 동적 형광 캘리포니아^{2 +} 응답 한 셀 하위에 수집 함께 정적 594-αBTX NMJ 신호.
   참고: 조직의 특정 빨강 또는 빨강 GECI 또는 GEVI 마우스는 NMJ에 사용 하기 위해 사용할 수 있게, 그들은 NMJ에 두 가지 세포 요소를 반영 하는 두 개의 동적 신호 수집을 사용할 수 있습니다.
6. 끝나면 이미징 또는 electrophysiological 실험은 원하는 결과 달성 했기 때문에, perfuse 관류 라인을 통해 물 하 고 물 2 배-3 배 소금 구축 하지 않습니다 보장 하기 위해 흡입 전극을 통해 빨 아.

4. 수출 및 (SD_iu16) 형광 강도의 표준 편차 지도 데이터의 분석

1. 16 비트 TIFF 스택으로 기록 된 이미지 시퀀스를 기록 하 고 분석을 위해 원하는 이미지 데이터 분석 시스템으로 그들을 로드.
2. 소프트웨어의 8 d 파일 메뉴에서 관심의 이미지 스택 을 선택 하 고 로드를 클릭 합니다.
   1. 비디오 로드, 일단은 아무 세포 형광 활동 섹션을 식별 하는 시간을 통해 검색 합니다.
      참고:이 지역의 배경 샘플을 만드는 데 사용 됩니다.
   2. Shift 를 누른 배경 샘플 지역으로 확인 된 지역 지역 관심 (ROI) 상자를 클릭 합니다.
   3. 상자를 만든 후 배경 활동 변경의 플롯을 생성 하기 위해 스페이스 바 를 누르십시오.
   4. 추적 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 xy 좌표 텍스트 파일로 추적을 덤프 텍스트로 ROI 에 옵션을 제시 하는 여러 옵션을 선택 합니다.
3. 다시 관심의 비디오를 이동, 다시 관심의 활동 발생 시간 영역을 식별 하기 위해 스캔.
   1. 마우스 가운데 단추를 사용 하 여 노란색 시간 상자에이 시간 영역을 선택 합니다.
   2. 동영상에 단추로 스택 본부 및 다음 합계 지도 옵션 5 선택 합니다.
      참고: 왼쪽된 창에 표준 편차 (SD 지도) 지도 생성 됩니다.
   3. SD에 클릭 하 고 다음 눌러 ] 키 19 x 적용 적절 한 색상 열 지도를.
   4. SD 지도 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 STM 로드 및 저장, SD 지도 저장 하 stm tiff로 저장 하는 옵션을 제공 합니다를 선택 합니다.
   5. 그때, 기자 [ 키 19 x는 회색조 색상 지도 돌아갑니다.
   6. C 와 다음 D 밀도 매핑 도구를 누릅니다. 왼쪽된 마우스 버튼, 가운데 마우스 버튼 사용 하, 임계값 SD 지도에 표시 된 모든 형광 활동을 조정할.
   7. C 임계값 설정을 유지 하면서 밀도 도구를 닫으려면 누릅니다.
   8. SD 지도 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택한 STM 입자 다음 찾을 PTCLS.
      참고:이 형광 활동을 표현 하는 개별 셀을 식별 합니다.
   9. SD 지도 한 번 더 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 입자 ROIs 만들기를 선택 합니다.
      참고:이 관심의 원본 동영상에서 선택한 셀을 입력 해 것입니다.
   10. Shift 키를,하는 동안 원본 비디오에 지금은 확인 된 입자 ROIs 중 하나에 마우스 오른쪽 단추로.
   11. 투자 수익 마커 및 투자 수익의 측정 Int를 선택 합니다.
       참고:이 관심의 비디오에서 확인 된 각 투자 수익에 대 한 개별 형광 활동 플롯을 생성 합니다. 이 텍스트로 덤프 ROI선행 Assorted, 선택 하 고 아무 이들 중 하나를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 저장 될 수 있습니다.
4. 이러한 작업을 기본 자세한 논리, 소스 코드 파일⁹를 참조 하십시오.

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결과

형광 강도 변화, 세포내 캘리포니아^{2 +} , NMJ의 정의 된 세포 유형 내에서 증가 의해 중재의 몇 가지 예는이 접근의 유틸리티 표시. 이러한 결과 응답 셀의 위치 뿐만 아니라 셀 수 응답 및 얼마나 많은 각 셀에 특정 응답의 평가 되므로 그들의 반응의 강도 제공 하는 공간 형광 강도 지도 제시 자극입니다. 예를 들어 그림 1에서 보듯이, 우리의 ?...

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토론

여기 우리는 측정 캘리포니아^{2 +} 그대로 신경 근육 학 조직 GECI 표현 하는 마우스를 사용 하 여 특정 셀에 응답의 몇 가지 예제를 제공 합니다. 이러한 실험을 성공적으로 수행 하려면 인할지 신경 해 부 동안에 상처를 하지 필수적입니다. 캘리포니아^{2 +} 응답 Schwann 세포 낮은 또는 높은 전력 (즉, 20 X 또는 X 60)에, 이미지를 제너 시스 또는 µ-conotoxin 블록에 사용할 필요가 있다. ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Myf5-Cre mice	Jax	#007893	Drives muscle cell expression as early as E136
Wnt1-Cre mice	Jax	#003829	Drives expression into all  Schwann cells at E13 but not P209
Sox10-Cre mice	Jax	#025807	Drives Schwann cell expression at older ages
Conditional GCaMP3 mice	Jax	#029043	Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion
Conditional GCaMP6f mice	Jax	#024105	Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion
BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)	Hit2Lead	#5102862	Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6
CF594-α-BTX	Biotium	#00007	Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ
µ-conotoxin GIIIb	Peptides Int'l	#CONO20-01000	Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8
Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard	Ellswoth Adhesives	# Sil Dielec Gel .9KG	Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins
Minutien pins (0.1mm diameter)	Fine Science Tools	26002-10	Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel
Eclipse FN1 upright microscope	Nikon	MBA74100	Allows staging and observation of specimen
Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator	Autom8	MXMScr	Allows movement of specimen
Manual micromanipulator	Narishige	M-152	Holds recording and stimulating electrodes
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Axoclamp 900A	Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording
Microelectrode low-noise data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1550	Allows electrophysiological data acquisition
Microelectrode data analysis system	Molecular Devices	PCLAMP 10 Standard	Performs electrophysiological data analysis
Square wave stimulator	Grass	S48	Stimulates nerve to excite muscle
Stimulus Isolation Unit	Grass	PSIU6	Reduces  stimulation artifacts
Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter	Sutter	FG-GBF100-50-15	Impales and records nerve-evoked muscle potentials
Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter	Sutter	BF150-117-15	Lengthened and used for suction electrode
Micropipette Puller	Sutter	P-97	Pulls and prepares recording electrodes
1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera	Photometrics	Prime 95b	Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging
Light Source	Lumencor	Spectra X	Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation
Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm	Nikon	CFI60	Provide long working distances for visualization of specimen
Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp	Sumita	LS-DWL-N	Provides illumination for brightfield observation
W-View Gemini Image Splitter	Hamamatsu	A12801-01	Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera
Single-band Bandpass Filters  (512/25-25 and 630/92-25)	SemRock	FF01-512/25-25; FF01-630/92-25	Permits dual band imaging
560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter	Sem Rock	FF560-FDi01-25x36	Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging
Imaging data acquisition system	Nikon	NIS Elements - MQS31000	Allows imaging data acquisition
Wavelength control module	Nikon	MQS41220	Module for imaging data acqusiition
Emission splitter hardware module	Nikon	MQS41410	Module for imaging data acqusiition
Imaging data analysis system	NA	Volumetry 8D5, Fiji	Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data