기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가

요약

여기 선물이 leukemic 세포 백혈병 환자 골 수에서 격리 및 그들의 대사 상태 분석을 위한 프로토콜. 기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가 1 차 셀의 수요 특성을 더 나은 하는 데 도움이 수 그리고 더 맞춤된 의학까지 이어질 수 있습니다.

초록

암 세포의 대사 요구 부정적인 생존 및 치료 효능에 영향을 미칠 수 있습니다. 요즘, 변화 통로의 제약을 대상으로 다양 한 종양에서에서 테스트 됩니다. 따라서, 암 세포 대사 설치의 대상 환자의 전반적인 결과 개선 하기 위해 올바른 경로 위해 불가피 하다. 불행 하 게도, 암의 대다수에서 악성 세포가 더 높은 숫자를 매우 어려운 및 조직 생 검 필요 합니다. 백혈병은 예외, 어디 leukemic 세포의 충분 한 수 골에서 격리 될 수 있습니다. 여기, 우리는 leukemic 세포 백혈병 환자 골 수에서 분리 및 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 그들의 대사 상태의 이후 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. Leukemic 세포는 그들의 생존에는 영향을 미치지 않습니다 밀도 그라데이션에 의해 격리 됩니다. 다음 재배 단계 재생성 하 그들을 도와, 따라서 대사 상태 측정은 최적의 조건에서 셀의 상태. 이 프로토콜은 개인된 치료에 사용 될 수 있는 일관 된, 잘 표준화 된 결과 달성 수 있습니다.

서문

신진 대사 프로필 셀의 주요 특징 중 하나 이며 변경 된 생체는 지금 암^1,2,3의 특징 중 하나를 간주 됩니다. 또한, 신진 대사 설치에 변경 신호 변환 통로 또는 암 세포^4,,56의 효소 기계 장치를 대상으로 암 치료에 사용 될 수 있습니다. 암 세포의 변화 경향을 알고 따라서 이점을 이며 현재 치료를 향상 시킬 수 있습니다.

문화에 있는 세포의 대사 활동을 평가할 수 있는 이미 설정 된 방법의 많음이 있다. 분해에 대하여 포도 당 통풍 관 측정 될 수 있다 방사성 라벨 2-NBDG를 사용 하 여 (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) 또는 extracellular 젖 산 수준 측정 효소^7,8. 지방산 산화 속도 isotopically 레이블된 물^9,10에 의해 측정 하는 또 다른 대사 매개 변수입니다. 산소 소비 속도 셀^11,12, 미토 콘 드리 아 막 잠재적인 평가^13,14, ATP/ADP (아데노신 함께 미토 콘 드리 아 활동을 결정 하는 데 널리 사용 되는 방법 5 '-3 인산 염/아데노신 5 '-diphosphate) 비율 측정¹⁵ 또는 총 세포내 ATP 측정¹⁶. 알려진 대사 과정을 조절 하는 통로 신호 단백질 quantifications에 의해 결정 될 수 있었다 고 대사 측정^17,,1819의 이해를 향상 시킬 수 있습니다.

그러나, 이러한 모든 방법을 하나만 측정 또는, 최고의 시나리오 하나에 몇 가지 변화 매개 변수는 동시에 샘플. 중요 한 것은, 산소 소비 속도 (OCR) 및 세포 외 산성화 속도 (ECAR)의 동시 측정, 예를 들어 해 마 XFp 분석기에 의해 세포 외 유출 분석에 의해 얻을 수 있습니다. OCR은 미토 콘 드리 아 호흡 ECAR 이며 주로 분해 (우리는 CO₂ 생산 가능성이 높은 산화 인 산화 활동 ECAR 셀의 높이 무시할 수 없는)의 결과²⁰. 지금까지, 다양 한 세포 유형 사용이 분석기^21,,2223공부 되었습니다.

여기 우리는 백혈병 환자에서 주요 폭발 (미 숙 조 혈 단계에서 파생 된 백혈병 세포)의 세포 외 유출 분석에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 지식 최선을 주 폭발에 대 한 특정 프로토콜 사용할 아직 아니에요.

프로토콜

모든 샘플 어린이 부모 또는 보호자의 informed consent와 찰스 대학에서 프라하, 체코 공화국, 연구 윤리 위원회의 승인을 얻어 졌다 아니. NV15-28848A입니다.

1입니다. 시 약의 준비

1. 137 mM NaCl, 2.7 m m KCl, 4.3 m m 나₂HPO₄, 1.47 m m KH₂포₄, ddH₂HCl Sterilize와 O. 조절 pH 7.4에 압력가 마로 소독 하 여 용 해 하 여 PBS의 500 mL를 준비 합니다.
2. 100ml RPMI 매체의 준비: L-Alanyl-글루타민 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 μ g/mL)와 RPMI-1640 매체.
3. 0.1 m M NaHCO₃ 증류수 50 mL를 준비 합니다. 8.1에 pH를 조정, 필터 (0.22 μ m) 소독 및 4 ° c.에 저장
   참고: 두 개의 8-잘 세포 외 유출 분석기 접시, 0.1 m M NaHCO₃ pH 8.1의 250 μ 준비.
4. 1 mL의 증류수에 2 M D-포도 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장
5. 1mm Oligomycin A 에탄올에서의 100 μ를 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장
6. 1 M 2-의하여-D-포도 당 (2-DG) 최소 DMEM (Dulbecco의 수정이 글의 중간)에서 250 μ를 준비 합니다. 37 ° C로 온난 하 고 pH 7.4 (37 ° C에서 pH 측정 수행)를 조정 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장
7. 1mm DMSO에 FCCP (carbonyl 시안-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone)의 100 μ를 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장
8. 100 μ에서 에탄올 1 m m로 테 논의를 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장
9. 1 mg/mL 에탄올에 Antimycin A의 100 μ를 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장
10. 바로 사용 전에 분해 스트레스 테스트 매체의 10 mL를 준비 합니다. 물 욕조에 37 ° C 최소한 DMEM 따뜻한 고 pH 7.4 (37 ° C에서 pH 측정 수행)를 조정 합니다.
11. 이전에 사용 하 여, BSA와 셀 미토 스트레스 테스트 매체의 10 mL를 준비 합니다. 2 m L-글루타민, 10 m m D-포도 당, 1mm HEPES (pH 7.4), 1 mM pyruvate와 0.1 %BSA (소 혈 청 알 부 민) 최소 DMEM을 보충. 따뜻한 물 욕조에 37 ° C를 pH 7.4 (37 ° C에서 pH 측정 수행)를 조정 합니다.
12. 이전에 사용 하 여, BSA 없이 셀 미토 스트레스 테스트 매체의 10 mL를 준비 합니다. 2 m L-글루타민, 10 m m D-포도 당, 1mm HEPES (pH 7.4) 최소 DMEM 보충 및 1 mM pyruvate. 따뜻한 물 욕조에 37 ° C에 BSA 없이 셀 미토 스트레스 테스트 매체 고 pH 7.4 (37 ° C에서 pH 측정 수행)를 조정 합니다.
    참고: BSA 매체 BSA와 보충 때 셀 FCCP에 더 나은 응답 때문에 셀 미토 스트레스 테스트 중간에 추가 됩니다 (다른 조건 테스트를 했다). BSA 없이 세포 미토 스트레스 테스트 매체 제조자는 매체에서 BSA를 사용 하 여 권장 하지 않습니다 포트 로드 사용 됩니다.

2. 단 세포 골 수에서 격리

참고: 이상적으로, 기본 백혈병 세포의 대사 상태의 측정은 골 수 수집 및 셀 격리 후 즉시 시작 한다. 그럼에도 불구 하 고, 관련 데이터 셀 분리 후 체코 공화국에 있는 다른 혈액학에서 교통 센터에서 또한 얻을 수 수 있습니다. 메 마른 조직 문화 후드에 모든 하위 단계를 수행 합니다.

1. PBS와 실내 온도에 밀도 그라데이션 중간에 워밍업.
2. 1: 1의 비율에 PBS 가진 백혈병 환자의 골 수 샘플을 희석. 샘플 leukemic 돌풍의 80% 이상 포함 되어 있는지 확인 합니다.
3. Cytometry 특정 CD 마커를 사용 하 여 셀의 immunophenotype 특성에 의해 폭발의 백분율을 결정 합니다. 밀도 그라데이션 분리 후 전반적인 세포 수를 설치 하기 위하여 핵 산 핵 염료와 긍정적인 이벤트를 감지 합니다.
4. 그런 다음, 백혈병의 각 유형에 대 한 특정 CD 마커를 사용 하 여 백혈병 세포를 결정: B-모든 (CD19, CD45), T-모든 (CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD99) 및 AML (CD45, CD33, 그리고 특정 골수성 마커)²⁴. 모든 핵 세포 백혈병 폭발 세포의 백분율을 확인 하 여 특정 CD 표식에 대 한 긍정적인 백혈병 세포의 수를 나눕니다.
   참고: 골 수 anticoagulants 튜브에 수집 수 있다.
5. 신중 하 게 6 mL 희석된 골 수 샘플 15 mL 원뿔 튜브에 밀도 그라데이션 매체의 이상 6 mL의 레이어. 브레이크 없이 진동 물통 회전자에 4 ° C에서 35 분에 대 한 400 x g에서 원심.
   참고: 샘플의 더 큰 볼륨은 더 aliquots로 분할 될 수 또는 50 mL 원뿔 튜브 밀도 그라데이션 매체의 더 큰 금액으로 사용 될 수 있습니다.
6. 5 mL PBS의 새로운 50 mL 원뿔 튜브 interphase 레이어 단 세포 (그림 1)으로 구성 된 전송 신중 하 게 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여. 진동 물통 회전자에 4 ° C에서 10 분 동안 400 × g에서 원심.
   참고: 단일 50 mL 원뿔 튜브 PBS의 5 mL에 모든 단 세포 층을 전송.
7. 상쾌한 발음 하 고 메 마른 PBS의 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
   참고: aspirated 골의 1 mL에 백혈병 세포의 수는 환자²⁵마다 크게 다릅니다.

3. 하룻밤 재배 단 세포의

참고: 모든 하위 단계를 수행 하는 살 균 조직 문화 후드.

1. RPMI의 20 mL으로 두 T75 플라스 크를 준비 합니다. 각 플라스 크에 고립 된 30 x 10⁶ 단 셀을 추가 합니다. 16-24 h 5% CO₂ 와 37 ° C에 서 플라스 크로 셀을 품 어

4. 셀 접착제 코팅 접시의 준비

1. 코트 두 8 잘 세포 외 유출 분석기 접시.
   참고: 메 마른 조직 문화 후드에 코팅을 수행 합니다.
2. 2.2 μ의 세포 접착제 추가 (밀도: 2.54 mg/ml)을 0.1 m M NaHCO₃, pH 8.1, 고 각 잘으로 피 펫 즉시 12.5 μ의 250 μ.
   참고: 셀 접착제 재고 솔루션 그들의 밀도에 차이가, NaHCO₃ 에 따라 추가 볼륨을 조정할 수 있습니다.
3. 약 20 분, 후드에 앉아 셀 접착제 발음 그리고 잘 두 번 살 균 물 200 μ를 사용 하 여 각 세척 접시를 보자. 웰 스는 건조 때까지 뚜껑 열기와 후드에 앉아 보자.
4. 지금 당장 접시를 사용 하 여 또는 응축을 피하기 위해 파라핀 영화에 싸여 테두리와 4 ° C에서 최대 1 주를 저장 합니다. 그 접시는 예 열 (약 20 분) 동안 실내 온도에 후드에 셀을 뿌리기 전에 확인 하십시오.

5입니다. 수 분이 센서 카트리지

참고: 수화물 2 8 잘 세포 외 유출 분석기 카트리지.

1. 유틸리티 플레이트와 센서 카트리지를 분리 합니다. 거꾸로 실험실 벤치에 센서 카트리지를 놓습니다.
2. 각 채우기 200 μ calibrant와 유틸리티 플레이트의 잘. Calibrant의 400 μ로 각 굴 우물의 외부 주위를 채우십시오.
3. 이제는 calibrant를 포함 하는 유틸리티 접시에 센서 카트리지를 반환 합니다.
4. 습도, 비 CO₂, 37 ° C 배양 기 하룻밤 카트리지 어셈블리를 놓습니다.
5. 세포 외 유출 분석기를 켜고 하자 37 ° C에 따뜻한 하룻밤.

6. 시드 셀 셀 접착제 코팅 판에

참고: 분해 스트레스 테스트를 사용 하 여 분해 스트레스 테스트 매체. 셀 미토 스트레스 테스트를 위해 BSA와 셀 미토 스트레스 테스트 매체를 사용 합니다.

1. 씨 셀 분해 스트레스 테스트와 별도 접시에 셀 미토 스트레스 테스트에 대 한. 각 테스트에 대 한 숙박 문화 한 플라스 크에서 셀을 사용 합니다.
2. 실 온에서 5 분 동안 200 x g에서 셀 원심 Resuspend 적절 한 매체의 1 mL에 셀과 그들.
3. 4 x 10⁶ 라이브 셀 400 μ (사용 적절 한 매체)의 최종 볼륨을 추가 합니다.
4. B-G. 웰 스에 세포 현 탁 액의 50 μ 접시 500000 셀 한 잘에 시드는 확인 합니다.
   참고: 다른 정규화 수행 잘 당 정확 하 게 500, 000 셀을 시드하 결정적 이다. 그런 식으로 다른 환자에서 결과 비교할 수 있습니다. 여기 설명 대로 복제의 최적의 수 6,입니다. 적은 복제를 사용 하 여 이후 1 차 셀 잘못 행동 때로는 수 권장 하지 않습니다.
5. 웰 스 A와 H (이 웰 스 배경 수정 될 것입니다)에 적절 한 매체의 180 μ를 추가 합니다.
6. 1로 설정 하는 브레이크와 함께 실 온에서 5 분에 대 한 400 x g에서 격판덮개 원심.
7. 천천히, 그리고 신중 하 게 두 개의 8-잘 세포 외 유출 분석기 플레이트에 웰 스 B G에 적절 한 매체의 130 μ를 추가 합니다. 시각적으로 확인 하는 세포는 현미경에서 여 우물의 바닥에 안정적으로 준수는.
8. 30 분 동안 37 ° C 배양 기, 습도, 비 CO₂로 접시를 놓습니다.

7. 로드 센서 카트리지

1. 분해 스트레스 테스트에 대 한 각 포도 당 100 m m, 20 μ M Oligomycin A와 1 M 2-DG, 분해 스트레스 테스트 중간에 모두 250 μ를 준비 합니다.
2. 셀 미토 스트레스 테스트 준비 250 μ 각각 20 μ M Oligomycin A의 15 μ FCCP, 30 μ FCCP, 10 μ M의 혼합물으로 테 논 및 10 μ g/ml Antimycin A, BSA 없이 셀 미토 스트레스 테스트 중간에 모두.
   참고: FCCP 적정에 대 한 충분 한 환자의 자료 없기 때문에 좋습니다 FCCP의 한 분석 결과에 두 개의 농도 주입. 그럼에도 불구 하 고, 농도 연구원에 의해 결정 되어야 합니다.
3. 화합물의 카트리지 (표 1)을 다음과 같이 적절 한 인젝터 포트 로드:

8. 프로그램 설정

1. 표 2에 설명 된 대로 해당 분해 스트레스 테스트에 대 한 프로그램을 설정 합니다.
2. 표 3에 설명 된 대로 셀 미토 스트레스 테스트에 대 한 프로그램을 설정 합니다.
3. 프로그램을 시작 합니다. 분석 결과 플레이트 (나타나면) calibrant 플레이트를 교체 합니다.

9. 평가 및 결과의 해석

1. 분해 스트레스 테스트 결과에 다른 모든 ECAR 값에서 2-DG 주입 후 최저 ECAR 값을 뺍니다.
   참고:이 값이 낮은 비 glycolytic 산성화를 나타냅니다. 일반적으로, 가장 낮은 값은 4^회 측정에서.
2. 기저 산성화, 분해, 최대한 분해 및 glycolytic 함수 (그림 2A)에서 Glycolytic 예약 매개 변수를 계산 합니다. 첫 번째 3 개의 측정 지점에서 ECAR의 의미로 기저 산성화 ECAR 최소값을 뺀 후 계산 (생략 첫 번째 ECAR 값 크게 다른 2에서와 다른 경우), 3 측정에서 ECAR의 뜻으로 분해를 계산 포도 당 주입 후 포인트와 최대한 분해 ECAR의 3 측정에서 평균 포인트 Oligomycin 후 주사를 계산. 계산 Glycolytic 분해 마이너스 최대한 분해로 예비.
   참고: 또는, 최대한 분해 계산에 대 한 3 점 측정에서 가장 높은 ECAR 값을 사용 합니다.
3. 셀 미토 스트레스 테스트 결과에 다른 모든 OCR 값에서로 테 논/Antimycin A 주입 후 최저 OCR 값을 뺍니다.
4. 기초 호흡, ATP 생산, 최대한 호흡 및 미토 콘 드리 아 기능 (그림 2B)에서 예비 용량 매개 변수를 계산 합니다. 뺀 후 OCR 최소값, 첫번째 3 개의 측정 지점에서 OCR의 뜻으로 기저 호흡을 계산 합니다.
   참고: 최대한 호흡 FCCP 주입 후 가장 높은 OCR 값입니다.
5. ATP 생산 계산, 기초 호흡에서 Oligomycin A 주입 후 3 OCR 측정 포인트의 평균을 뺍니다. 기초 호흡 마이너스 최대한 호흡으로 예비 용량을 계산 합니다.
   참고: 항상 사용 FCCP 농도 상관 없이 높은 OCR 값에서 최대한 호흡을 계산 합니다.

결과

그림 3 BCP-모든 (B 세포 선구자 급성 림프 구성 백혈병)과 급성 골수성 백혈병 (급성 골수성 백혈병) 환자에서 분해 스트레스 테스트 및 leukemic 돌풍의 셀 미토 스트레스 테스트 측정 후 곡선을 보여준다. 이 측정에서 대사 매개 변수 계산도 표시 됩니다. 잘 당 500000 셀 시드 했다 그리고 모든 측정 hexaplicates에서 수행 했다.

토론

(모두) 급성 림프 구성 백혈병 환자에서 파생 하는 기본 leukemic 돌풍에 OCR 및 ECAR 값으로 평가 하는 신진 대사 활동의 측정에 대 한 상기 설명 된 프로토콜 허용 또는 급성 골수성 백혈병 (AML). 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 측정의 장점은 실시간으로 살아있는 세포에서 대사 프로 파일의 검색 수 있습니다. 기본적으로 제공 된 프로토콜에서 모든 단계 하나 공부 계획 셀 유형에 따라 조정 될 수 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco, ThermoFisher Scientific	61870-010
Fetal Bovine Serum	Biosera	FB-1001/100
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco, ThermoFisher Scientific	15240-062
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761-500G
D-(+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-100G
Oligomycin A	Sigma-Aldrich	75351-5MG
2-Deoxy-D-glucose	Sigma-Aldrich	D8375-1G
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920-10MG
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-100ML
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875-1G
Antimycin A from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	A8674-25MG
Seahorse XF Base Medium, 100 mL	Agilent Technologies	103193-100
L-glutamine solution, 200 mM	Sigma-Aldrich	G7513-100ML
HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6	Sigma-Aldrich	H0887-100ML
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280-25G
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A2153-10G
Ficoll-Paque Plus	Sigma-Aldrich	GE17-1440-02	Density gradient medium
Seahorse XFp FluxPak	Agilent Technologies	103022-100
Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive	ThermoFisher Scientific	CB40240
Seahorse Analyzer XFp	Agilent Technologies	S7802A
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate	Agilent Technologies	103025-100