NETQUANT를 사용한 호중구 세포외 트랩의 자동 이미지 기반 정량화

요약

여기에서는 면역형광 이미지에서 NET를 정량화하기 위한 완전 자동 소프트웨어 옵션인 NEUTrophil 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 NETQUANT를 운영하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

호중구 세포 외 트랩 (NETs)은 DNA와 과립 유래 항균 단백질로 구성된 웹과 같은 항균 구조입니다. 면역형광 현미경 검사법 및 이미지 기반 정량화 방법은 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하는 중요한 도구로 남아 있습니다. 그러나, 현재 NET를 정량화하기 위해 이용 가능한 면역형광 기반 방법에 대한 주요 제한사항이 있다. 이미지 기반 NET 정량화의 수동 방법은 종종 주관적이며 오류가 발생하기 쉽고 사용자, 특히 경험이 없는 사용자에게는 지루합니다. 또한 현재 사용 가능한 정량화 소프트웨어 옵션은 반자동이거나 작동 전에 교육이 필요합니다. 여기서, 우리는 NETQUANT라고 불리는 NET 형성을 평가하기 위해 자동화된 면역형광 기반 이미지 정량화 방법의 구현을 입증한다. 이 소프트웨어는 사용하기 쉽고 사용자 친화적 인 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)를 가지고 있습니다. 그것은 표면적 및 DNA의 증가와 같은 생물학적으로 관련된 매개 변수를 고려합니다: NET 마커 단백질 비율 및 핵 변형은 NET 형성을 정의합니다. 또한,이 도구는 자유롭게 사용할 수있는 응용 프로그램과 함께 내장되어 있으며, 단일 셀 해상도 정량화 및 분석을 할 수 있습니다.

서문

호중구는 다양한 미생물 병원균에 대한 선천적 숙주 방어 반응의 중요한^중재자1. 그들은 항균 단백질^2의넓은 배열을 포함하는 그들의 과립을 풀어 놓음으로써 그들의 항균 기능을 실행합니다 2, 반응성 산소 종 (ROS) 및 hypochlorite^1을일으키고, 식세포증^3를통해. 또한, 브링크만 외. ⁴ 호중구 세포 외 트랩 (NETs)을 호중구가 침입 병원체를 트랩하고 제거하는 새로운 메커니즘으로 기술했습니다. 그들의 발견 이십 년 전 조금 10 년 전^{부터 4,}NETs는 감염성^5,6 및 비 감염성⁷ 이환의 다양한에서 연루되었습니다. NET 형성은 과립 유래 항균 단백질로 코팅된 염색질 DNA의 압출을 초래하는 활성 과정 및^8. NET 형성과 관련된 세포 및 핵 형태학의 주요 변화 중 일부는 핵 형태, 크로마틴 데톤 덴션의 손실, 세포질에서 핵으로의 과립 단백질의 동원 및 핵 및 세포 직경의 증가를 포함한다^8,9.

상기 웹형 NET는 세포보다 약간 큰 확산 구조또는 단일 호중구보다 몇 배 더 큰 구조로서 나타날 수 있는 NETosis^5,10의지표로 간주된다. 형광 현미경 검사법을 사용하여, NET는 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 같은 형광 프로브로 DNA를 조사하고 호중구 엘라스타아제와 같은 순 결합 단백질에 대한 면역 형광 염색에 의해 검출될 수 있습니다. DNA 및 NET 결합 단백질에 대한 염색의 중첩 영역의 정량화는 이미지^11에서NETs 아래의 전체 영역을 결정한다.

다양한 이미지 분석 옵션을 사용하여^NET1,12의형광 이미지 기반 정량화를 수행할 수 있습니다. 그러나 이러한 소프트웨어 옵션은 사용자 친화적이거나 완전히 자동화되지 않는 데 한계가 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 NETQUANT^13의작동을 보여줍니다, 편견 완전 자동화 된 면역 형광 현미경 현미경 이미지 기반 의 NET 정량화를 수행 할 수있는 자유롭게 사용할 수있는 응용 프로그램. 이 앱은 사용자 친화적인 그래픽 인터페이스(GUI)를 가지며 단일 셀 분석을 수행할 수 있습니다. 이 소프트웨어는 DNA-NET 결합 마커, 염색질 데톤 데톤 형성 관련 변형 및 DNA의 증가:NET 결합 단백질 비율의 영역에서 형태학적 변화를 검출함으로써 이미지에서 NETosis를 정량화합니다. 종합하면 여러 NET 정의 기준을 통해 여러 데이터 세트에 대해 공정한 방식으로 엄격한 NET 정량화를 수행할 수 있습니다.

프로토콜

룬드 대학의 윤리위원회는 헬싱키 선언 (2013/728)에 따라 건강한 자원 봉사자로부터 정맥 혈액의 수집을 승인했다. 모든 자원봉사자들은 서면으로 동의를 구했습니다.

1. 밀도 그라데이션 원심분리를 사용하여 말초 혈액 호중구의 분리

1. 헤파린을 포함하는 관에 있는 인간적인 정맥 혈액을 수집하고 관이 실온에 도달할 수 있도록 하십시오.
   참고: 건강한 기증자로부터 최소 16 mL의 혈액은 충분히 큰 세포 펠릿을 산출하는 데 필요합니다.
2. 식염수 (0.9 % NaCl)에 2 % 덱스텐의 한 부피와 혈액을 혼합하고 멸균 50mL 원추형 원심 분리 튜브에서 30 분 동안 실온에서 침전을 허용하십시오.
3. 상급체를 멸균 50 mL 원유 원심분리기 튜브 및 원심분리기를 200 x g에서 4°C에서 10분 동안 흡인한다.
4. 이 단계부터 는 4 °C 또는 얼음에서 계속 격리됩니다.
5. 멸균 된 15 mL 원추형 원심 분리 튜브에 5 mL의 얼음 차가운 식염수와 백혈구 격리 구배 (9.1 % 나트륨 디아트리조에이트 5.7 % dextran, w / v)의 상단에 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
6. 4 °C에서 400 x g에서 30 분 동안 원심 분리기.
7. 상급자 흡입하고 폐기하십시오.
8. 30s에 대한 얼음 차가운 물 3 mL에 펠릿을 다시 중단하여 적혈구를 용해. 즉시 3.6 % NaCl의 1 mL을 추가 한 다음 얼음 차가운 식염수 10 mL로 채웁니다.
9. 350 x g에서 10 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리합니다.
10. 상급체를 제거하고 세포 펠릿을 수집하고 식염수 1 mL에서 다시 놓습니다. 뷔르커 챔버에서 트라이판 블루를 사용하여 세포 수와 생존 가능성을 평가하기 위해 마이크로 원심 분리튜브에 10 μL을 따로 둡니다.
11. 0.4% 트라이판 블루 용액의 90 μL에 10 μL의 셀 서스펜션을 추가합니다. 뷔르커 챔버에서 셀 서스펜션 10 μL을 복용하십시오. 챔버의 각 모서리에 3 줄로 바인딩 된 4 사각형의 셀을 계산합니다. 염료의 섭취에 진한 파란색으로 나타나는 세포는 실행 불가능한, 총 세포 수에서 그들을 제외.
12. 아래 방정식에 정의된 대로 셀/mL로 셀 번호를 표현합니다.
    
    참고 : 여기 챔버 계수는 10,000, 희석 계수는 10이고 총 사각형 수는 4였습니다.
13. 최종 세척 단계를 위해 나머지 셀 현탁액을 10 mL로 희석합니다.
14. 200 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
15. RPMI-1640에서 2 mg/mL 열 불활성화 인간 혈청 알부민 (HSA)의 농도에서 5 x 10⁵ 세포 /mL의 호중구를 다시 중단하십시오.

2. 호중구의 커버립과 자극의 준비

1. 12웰 플레이트의 각 웰에 1개의 커버슬립(10mm, #1)을 놓고 0.01% 폴리-L-리신 용액 200 μL을 추가하여 커버슬립을 코팅하고 밤새 37°C에 둡니다.
2. 300 μL 인산 완충염 염수 (PBS)로 입술을 한 번 씻어 내고 건조하게 하십시오.
3. 400 μL 의 5 x 10⁵ 호중구/mL을 각 우물에 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
4. 호중구를 함유한 플레이트를 37°C에서 인큐베이터로 옮기고 5%_CO2를 15분 동안 이동한다.
5. 상급체를 제거합니다. 400 μL의 미리 따뜻해진 RPMI-1640 배지를 2 mg/mL HSA로 컨트롤에 추가합니다. 자극을 위해 20 nM 포르볼 12-마이리스테이트 13-아세테이트(PMA)로 300 μL 미리 온데낸 RPMI를 첨가합니다.
6. 5%_CO2로37 °C에서 150 분 동안 호중구를 자극하십시오.

3. NET의 시각화

1. 상급체를 제거하고 200 μL의 PBS로 샘플을 2배 세척합니다.
2. 37°C에서 20분 동안 PBS에 4% 파라포름알데히드(PFA)의 200 μL을 첨가하여 시료를 수정합니다.
   참고: PFA는 독성이 있으며 주의하여 취급해야 합니다.
3. PBS 200 μL로 샘플을 3배 세척합니다.
4. 30s에 0.5% 트리톤 X-100의 50 μL을 추가하여 샘플을 투과화합니다.
5. 샘플을 200 μL의 PBS로 3배 세척합니다.
6. 37°C에서 1시간 동안 PBS에서 5% 염소 혈청으로 시료를 차단합니다.
7. 37°C에서 90분 동안 1:500의 희석으로 차단 용액에 1차 토끼 항인간 호중구 엘라스타아제 300 μL을 첨가합니다.
8. 샘플을 300 μL의 PBS로 세척합니다.
9. 37°C에서 90분 동안 1:1000의 희석으로 이차 염소 항토끼 형광 항체 300 μL을 첨가한다.
10. PBS 의 300 μL로 커버립슬립을 3배 씻습니다.
11. 웰에서 커버슬립을 제거하고 DAPI가 포함된 10 μL 장착 매체로 커버슬립을 장착합니다. 샘플을 건조하기 위해 어두운 실내 온도에서 하룻밤 보관하십시오.
    참고 : DAPI로 DNA를 염색하는 것은 확실히 이 방법의 중요한 단계입니다. 사용자는 또한 2\u20123 분 동안 0.1\u20120.5 μg/mL의 최종 농도 범위에서 외인성 DAPI 솔루션을 추가한 다음 300 μL PBS로 3개의 세척 단계를 추가하여 문제를 해결할 수 있습니다.
12. 20X 대목표를 사용하여 광시야형 현미경으로 이미지를 수집합니다.

4. 넷퀀트를 이용한 NET의 분석 및 정량화

참고: NETQUANT는 제노도 Github 아카이브 또는 Nordenfelt Lab 웹사이트(https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34)에있는 설치 파일을 클릭하여 다운로드할 수 있습니다.

1. 분석, 채널 이름 지정 및 이미지 변환을 위한 데이터 집합 가져오기
   1. NET퀀트에서 설정 탭을 엽니다.
   2. 소스 메뉴에서 경로 받기 옵션을 클릭하여 분석할 소스 폴더를 선택하고 분석할 이미지 시퀀스가 포함된 폴더를 선택합니다.
   3. 대상 메뉴에서 경로 받기 옵션을 클릭하고 이미지 분석 다음에 데이터를 저장할 폴더를 선택합니다.
   4. "DNA 채널"이 DNA염색(예를 들어,DNA 또는 DAPI)에 해당되도록 채널의 이름을 지정하고 "NET 채널"은 이미지에서 NET-bound 단백질 염색(예를들어,NET, 호중구 엘라스타제)을 묘사한다. 소프트웨어의 원활한 작동을 위해 컨트롤 이미지 파일이 포함된 폴더의 이름을 "컨트롤"로 지정합니다.
      참고: NET 채널은 NET-바운드 과립 단백질 마커 염색만을 지칭한다.
   5. 이미지 정보 하위 메뉴의 이미지 정보 로드 단추를 클릭하여 이미지 메타데이터를 소프트웨어에 공급합니다.
   6. 채널 순서 하위 메뉴의 이미지에 포함된 올바른 채널 순서를 선택합니다. 이 옵션은 우발적인 불일치를 방지하기 위해 페일 세이프로 포함되었습니다.
   7. 원시 데이터에서 기본 이미지 속성을 가져오고 데이터 준비 단추를클릭하여 이미지를 변환합니다. 변환된 이미지는 샘플 유형 하위 메뉴에 나타납니다. 분석을 위해 수집된 모든 데이터 집합을 표시하고 선택하려면 샘플 유형 메뉴를 클릭합니다.
   8. 샘플 유형 하위 메뉴에서 이미지를 선택하고 이미지 표시 데이터 버튼을 클릭하여 각각 DNA 및 NET 채널로 분할된 이미지를 표시합니다.
2. DNA 채널 및 NET 채널에 있는 세포의 분할
   1. DNA 채널과 NET 채널 모두에서 방법 하위 메뉴를 클릭하여 세분화 방법을 선택합니다.
      참고: 기본 세분화 방법은 가변으로 설정되어 권장되는 설정입니다. 글로벌, 에지, 찬베스 등의 다른 옵션도 있습니다. 밀접하게 배치된 셀 또는 NET를 구별하는 데 도움이 되는 유역 옵션도 포함되어 있습니다.
   2. 세그먼트 제어 샘플 옵션을 클릭하여 두 채널모두에서 먼저 분할 제어 셀을 세그먼트로 하는 세분화 탭을 입력합니다.
   3. 샘플 유형 하위 메뉴에서 PMA를 선택하고 배치 옵션(권장)을 클릭하여 데이터 세트에 포함된 모든 이미지의 세분화를 시작합니다. 샘플 유형 메뉴에서 이미지를 선택하고 이미지 표시 데이터 버튼을 클릭하여 생성된 후 세분화에서 생성된 이진 이미지 마스크(DNA 마스크 및 NET 마스크)를 시각화하고 유효성을 검사합니다.
3. 식별 가능한 특성의 단일 셀 분석
   1. 분석 탭을 입력하고 임계값 결정 버튼을 클릭하여 제어 샘플을 분석합니다.
   2. 샘플 유형을 PMA로 변경하고 셀 속성 얻기 버튼을 클릭하여 자극된 샘플 분석을 완료합니다.
   3. 샘플 유형 하위 메뉴에서 이미지를 선택하고 이미지 표시 데이터 버튼을 클릭하여 이미지에 셀 및 NET 형성 셀의 오버레이와 수를 표시합니다.
4. NET 형성 세포를 식별하기 위한 셀 특성 비교
   1. 샘플 유형 하위 메뉴에서 샘플을 선택하고 NET 분석 버튼을 클릭하여 분석을 완료합니다. 개별 이미지는 분석을 위해 샘플 유형 하위 메뉴에서 선택할 수 있으며 배치 옵션(권장)을 선택하여 전체 이미지 배치를 분석할 수 있습니다.
   2. NET 기준을 수동으로 조정하여 지정된 샘플에 대한 최적의 결과를 산출합니다. 식별된 NET를 원본 이미지와 비교하여 식별 품질을 평가합니다.
      참고: NET 기준은 데이터 세트의 모든 이미지에서 사용할 수 있습니다. NET 기준의 모든 변경 사항은 모든 제어 샘플에 동시에 적용됩니다. 이렇게 하면 NET 매개 변수의 과다 피팅으로 인해 발생할 수 있는 잠재적인 차이가 발생할 수 있습니다. NET 기준의 설정은 사용자의 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다. 거짓 발견 비율과 NET퀀트 사이의 관계는 이전에^13을탐구했습니다. 면적 증가에 대한 일반적인 범위는 2\u20124, 순환은 0.7\u20120.9이고 DNA/NET 비율은 0.6-2.0입니다.
   3. 이미지 개수, 이미지당 셀 수 및 이미지당 NET 비율이 표시되는 셀 데이터 하위 메뉴의 데이터 요약을 검사합니다.
      참고: 전체 데이터 집합의 총 NET 백분율은 "NET 게이지"로 표시됩니다. 총 이미지 수, 셀 수, 샘플의 NET 백분율(NET%) 및 제어 샘플의 NETS%는 NET 게이지 아래의 요약 통계 표에 표시됩니다. 자극된 샘플에서 얻은 데이터와 함께 제어 데이터를 보고하는 것이 좋습니다.
5. 결과 출력
   1. 출력 탭을 입력하여 결과 출력을 선택하고 봅니다.
   2. 출력의 형태를 선택하고 출력 결과 버튼을 클릭하여 제어 및 PMA 분석에서 생성된 다양한 데이터 출력을 탐색하고 비교합니다.
      참고: 컨트롤과 자극모두에 대해 생성된 모든 데이터는 대상 하위 메뉴에서 선택한 대로 분석 폴더에 저장됩니다. 데이터는 .csv 또는 .pdf 형식으로 저장됩니다.
   3. 메서드 파일을 시작하여 분석에 사용되는 소프트웨어 및 NET 기준의 버전을 가져옵니다(게시 목적으로 메서드 섹션에 포함됨).
   4. 결과 데이터 테이블을 클릭하여 지정된 샘플의 개별 데이터 포인트를 시각화합니다.
   5. 샘플에서 NET 영역 분포 및 DNA:NET 비율을 시각화합니다. 빨간색 선은 그래프의 임계값을 나타냅니다.
   6. 양변량 분포 파일을 클릭하여 DNA의 NET 영역과 모양을 결정합니다.
6. 이전 분석 및 모든 단계 배치 로드
   1. 이전에 성공한 분석 설정을 이전 분석 로드 단추를 사용하여 NETQUANT에 로드합니다.
   2. 설치 메뉴에 포함된 모든 단계 일괄 처리 단추를 사용하여 단계 5\u201212(그림 1, 그림 2, 그림3, 그림4, 그림 5)를실행하여 최종 출력을 직접 가져옵니다.

결과

5 x 10⁵ 호중구/mL을 12웰 플레이트에 놓은 커버슬립에 시드하고 20 nM PMA로 자극하거나 150분 동안 자극되지 않은 상태로 방치하였습니다. 샘플은 1 차 토끼 항 인간 호중구 엘라스타아제 항체, 이차 염소 항 토끼 불소 공화 항체 및 DAPI-DNA를 얼룩지게 하는 형광 표지된 염료를 사용하여 염색하였다(자세한 내용은 물질 표 참조). 최소 5개의 심상을 epifluorescen...

토론

NET 형성은 다양한 호중구 armamentarium^4에 비교적 최근에 첨가되어 있으며 광범위한 연구 영역^{5,7,14,15에서}NET의 의미를 연구하는 데 관심이 눈에 띄게 급증하고 있다. 면역형 광현미경 검사법 및 후속 이미지 기반 정량화를 사용하여 이미지를 획득하는 것은 NET를 정량화하는 데 널리 사?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer Heparinised plastic tubes	BD Biosciences	367885
Lymphoprep	Axis-Shield	114547
RPMI-1640 with L-Glutamine	Gibco	11835-030
50mL conical flasks	Sarstedt	62.547.004
15mL conical flasks	Sarstedt	62.554.002
12-well Tissue culture plates	Falcon	10626491
#1 Coverslips 10mm	Menzel Glaser	CS10100
Glass slides	Menzel Glaser	631-0098
Primary anti-human elastase	DAKO	DAKO rabbit 1373, contract immunization
Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit	Life technologies	A-11072, A-11070
PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI	Life technologies	P36930	Mounting medium
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	79346
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Nikon Ti-E Epifluorescence microscope	Nikon
CCD camera	Andor Zyla
Plan Apochromat 20x, 40x objectives	Nikon
Windows 10	Microsoft		Operating system
macOS Sierra 10.12	Apple		Operating system
MATLAB	Mathworks