창 자 호르몬 분 비는 격리를 사용 하 여 기본 메커니즘 끼얹는다 쥐 소장

요약

여기, 우리는 기본 창 자 호르몬 분 비 및 장내 흡수 분자 메커니즘 연구에 강력 하 고 생리 적 모델 제시-격리 끼얹는다 쥐 소장.

초록

용기는 식욕과 음식 섭취, 소화, 영양소의 흡수와 분포, 및 포스트 높은가격순 포도 여행 15 개 이상의 다른 펩 티 드 호르몬을 생산 하는 신체의 가장 큰 내 분 비 기관 이다. 창 자 호르몬 분 비를 조절 하는 분자 메커니즘을 이해 하는 것은 이해 하 고 소화 관 호르몬 생리학 번역에 대 한 기본적 이다. 전통적으로, 기본 창 자 호르몬 분 비 메커니즘 (실험 동물 또는 인간)에서 vivo에서 공부 하거나 또는 문화 셀 또는 셀 라인 점 막 창 자 호르몬 분 비 기본을 사용 하 여. 여기, 창 자 호르몬 분 비를 공부 하기 위한 대체 방법으로 격리 된 끼얹는다 쥐 소장을 소개 합니다. 이 모델의 미 덕은 그것은 생리 적으로 중요 한 매개 변수 vivo에서 학문, 점 막 분극, paracrine 관계의 노선 등에서 분 비에 대 한 책임의 대부분을이 의미 그대로 직감에 의존 관류/자극 노출입니다. 또한, 그리고 vivo에서 연구와는 달리 거의 완전 한 실험 제어 및 분 비의 직접 평가 대 한 격리 끼얹는다 쥐 소장 수 있습니다. 달리 생체 외에서 학문, 그것은 크기와 주소 중요 한 질문, 어떤 자극 원인 용기 (luminal 또는 혈관)의 측면에서 분 비는 다른 소화 관 호르몬의 분 비와 분 비의 역학을 공부 하 자극, 분 비 응답 기본 세부 분자 센서에서 분석 하 고. 또한, 준비 책임 전송기를 포함 하 여 장내 흡수의 역학에 관한 내용과 장내 흡수의 연구에 대 한 강력한 모델입니다.

서문

용기는¹식욕 조절 영양소의 흡수 및 영양 처리, 장 성장 규제 15 개 이상의 다른 펩 티 드 호르몬을 생산 하는 신체의 가장 큰 내 분 비 기관 이다. 창 자 호르몬, 따라서, 많은 기본적인 생리 적 과정에 참여 이며 분 비와 각 호르몬의 분 비를 제어 하는 분자 세부의 이러한 패턴을 이해 따라서 우리의 기본 생리에 대 한 중요 한 이해 하 고 소화 관 호르몬 작업;의 변환 측면을 해결 하기 위한 하지만 어떻게 하나 밑에 창 자 호르몬 분 비 분자 감지 메커니즘을 공부할 수 있습니다? 일반적으로, 호르몬 분 비 절연된 용기 준비 또는 창 자 호르몬 분 비 1 차 셀 문화에서 그대로 유기 체 (인간 또는 실험 동물), 공부 될 수 있다 또는 셀 문화^2,3, 를 불멸 하 게 ^{4 , 5 , 6}. 우리의 선호 모델은 격리 끼얹는다 쥐 소장, 최적의 시간 해상도 (분 비 속도 든 지도 결정 될 수 있다 자세히 공부 창 자 호르몬의 분 비를 허용 하는 생리 적으로 관련 모델 두 번째도 기본), 결과 가능성이 vivo에서 상황⁷양도. 여기, 우리이 절차를 수행 하는 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하지만 먼저 우리는 창 자 호르몬 분 비, 혜택 및 분리 끼얹는다 쥐 소장에 비해이 모델의 한계를 포함 하 여 공부를 위한 다른 방법을 논의할 예정 이다.

만약 하나의 소원을 특정 화합물 특정 창 자 호르몬의 분 비 조절 여부 설정, 연구 인간의 궁극적인 목표는. 따라서, 화합물 비보 나 (perfusions)에 설치류에 하나 또는 여러 개의 창 자 호르몬의 분 비에 좋은 효과 보여줍니다 또는 호르몬에서 분 비 세포 (세포 선 또는 1 차 셀),이 효과만 의학 및 인간 생리학에 관련 된 경우 확인할 수 있습니다. 인간. 그러나, 인간에서 수행할 수 있는 연구의 유형에 대 한 명확한 한계가 있다 그리고 vivo에서 연구 실험 동물에는, 따라서, 종종 이러한 연구에 대 한 최고의 두 번째 옵션. 생쥐와 쥐가 그들의 편리한 크기, 저렴 한 비용 및 유전자의 구체적인 연구 질문에 참여 하 고 의심 하는 유전자를 변경 하는 옵션 때문에 아마도 가장 자주 사용 된 실험 동물 (예를 들어, 특정 전송 밖 노크 또는 수용 체)입니다. 일반적으로, vivo에서 모델 순수 그대로 되 혜택 하지만 몇 가지 제한이 있다. 가장 중요 한 것은, 작은 설치류, 특히 마우스의 크기가 제한 요소, 창 자 호르몬 정량화에 대 한 대부분의 분석 요구 20 µ L 플라즈마 (그리고 종종 훨씬 더), 적어도 의미의 혈액의 100 µ L 복제 철회 되어야 하는 정량화입니다. 따라서, 그건 단지 거의 샘플 해당 기준선 샘플 하 고 하나 또는 두 개의 후 자극 샘플 (20 g의 마우스에 총 혈액 량은 ~1.4 mL)을 얻을 수 있습니다. 따라서, 잠재적인 분 비 응답 (예를 들어, 빠르게 또는 늦게 발생 응답) 따라서 놓칠 수 있습니다.

관류 모델에서이 문제를 극복, 볼륨 큰 샘플으로 가져온 (유량: 7.5 mL/min) 컬렉션으로 빠르고 짧은 지속 응답은 보고 되지 보장 하기 위해 필요에 따라 조정 될 수 있다 (우리는 수집 모든 분 샘플)⁷ . 또 다른 문제 설치류에서 vivo 연구에서 대부분 소화 관 호르몬은 더욱 빠르게 제거 또는 보다 인간^8,9,10, 이후 생 화 확 적인 분석을 복잡 하 게 수 있는 대사. 예를 들어, 우리가 보여준 GLP-1은 인간에서 보다 더 빠른 속도로 쥐에서 물질 대사로 변화 (T_1/2 는 1-2 분¹¹)와, 더 중요 한 것은 N 맨끝 분열에 의해 뿐만 아니라 쥐에 GLP-1의 분열을 포함 하 dipeptidyl-peptidase-4 (DPP4) (이 인 간에 있는 주요 GLP-1 타락 효소), 효소 중립 endopeptidase 24.11¹²분열을 추가. 도 GLP-1 (7-36amide)의 그대로 isoform 또는 기반 DPP-4 죽 습 isoform (9-39amide), GLP-1의 정량화에 대 한 현재 상업적인 분석 훨씬 쥐 분 비 GLP-1를 과소 평가 하 고 결과 오해의 소지가 발생할 따라서, ¹². 격리 끼얹는다 쥐 소장에서 분 비 호르몬의 대사 대부분 제거 또는 현저 하 게 감소, 플라즈마 중재 저하를 피할 수 있기 때문에 (때문에 간/신장/폐 추출/저하를 방지 perfusate는 수집 용기를 떠날 때).

물론, 중요 한 통찰력은 유전자 변형된 동물, 예를 들어, 나트륨 포도 당 운송업 자 1 녹아웃 쥐¹³의 사용에 의해 생성 될 수 있습니다 하지만 종종 분 비에 관여 하는 분자 센서의 상세한 평가 필요 이온 채널 분자 전송기 및 다른 G 단백질 결합 된 수용 체 세포내 단백질에 이르기까지 여러 분자 사이트의 고려 사항. 예를 들어, 우리는 9 다른 분자 사이트의 활동 분자 센서 GLP-1 분 비 포도 당 자극⁷에 대 한 책임을 탈피 할 때 대상. 유사한 조사 가능한 vivo에서 사용 하는 화합물 중 일부는 불특정 또는 유해한 치명적인 효과 않을 것 이다. 예를 들어, perfused 용기를 사용할 때는 가능 했다의 역할 뿐 아니라 2-4-dinitrophenol^7,14 ATP 형성을 차단 하 여 neurotensin GLP-1의 분 비에 대 한 세포내 포도 당 대사의 역할을 평가 하 담 즙 산에 대 한 전압 개폐 칼슘 채널 자극 GLP-1, NT 및 PYY 분 비³. 실제로, 높게 유독한 나트륨 채널 차단제 테트로도톡신 관류 연구에 성공적으로 적용할 수 있습니다. 마지막으로, 관류 모델에 그것 평가 될 수 있다 직접 어디에 특정 화합물 자극 특정 호르몬의 분 비로 탐정 수 있습니다 간단 하 게 선택 하 고 perfuse, 원하는 영역을 준비 하 고 동시에 그것은 조사 수 있습니다. 여부는 자극 분자 센서의 활성화에 의해 내장^3,,1516의 luminal 또는 혈관에서 분 비를 발생합니다.

기본 창 자 호르몬 분 비에 의해 공부 또한 수 분 비 메커니즘 사용 (인체 조직 포함), 창 자 조직 조각의 불후의 명작 (쥐)에서 일반적으로 기본 장 문화 호르몬 셀 라인 (마우스 또는 인간의 기원), 창 자에 의해 은닉 조직은 Ussing 약 실에서 또는 organoids (마우스에서 가장 자주 둘 다)^{2,3,,45,6,,1718}거치. 장 perfusions에 비해, 인간의 직감 조각, 기본 세포 배양 및 세포에 대 한 연구 수행을 기술적으로 쉽게 데이터를 생성 하는 빠르고 저렴 방법 하지만 직감 조각의 연구 신선한 인간의 창 자에 대 한 액세스를 필요로 하는 물론 표본입니다. 그러나,이 모델에는 정상 세포의 양극 화 현상이 용기 분자 센서의 정상적인 활성화를 평가 하기 위해이 모델을 사용할 수 없습니다 고 흡수 프로세스 또한 공부 될 수 있는 본질적으로 손실 됩니다. 또한, 이러한 연구 결과 일반적으로 정적 외피 고용 (에 대 한 여러 h)는 매우 비 생리 적 이며 상관이 세포의 정상적인 분 비 역학, secreted 제품 제거 되지 않습니다 및 따라서 피드백 영향을 미칠 수 있기 때문에 호르몬의 분 비 반면, perfused 소장에서 분 비 및 흡수 분자는 효율적으로 제거 점 막 미세 혈관에 의해 vivo에서, transmucosal 그라디언트 흡수와 분 비는 정상 속도로 발생할 수 있습니다 그래서 유지 됩니다 보장은. 또한, 셀 문화 그들의 네이티브 enteroendocrine 셀 근원, 그들은 여전히 수 있지만 그들은 더 이상 펩 티 드 콘텐츠 측면에서 네이티브 셀의 대표 분자 센서, 표현의 의미에서 dedifferentiated 할 수 없습니다. 질문에 호르몬 분 비. 이것은, 예를 들어, GLP-1 은닉 세포 라인¹⁹에 대 한 경우입니다.

그것은, 그러므로, 우리의 의견 1 차 셀 문화 또는 셀 라인 연구는 심사 목적 및 수행 vivo에서 수 없는 형식 실험을 수행 하기 위한 또는 고립 된 perfused에 가장 적합. 예를 들어, 기본 세포 배양 및 세포 선 문화의 진정한 힘은 그 세포내 이차 메신저 (예: 캘리포니아^{2 +}, 캠프, NAD(P)H)는 실시간으로 모니터링할 수 있습니다 그리고 수 있습니다 세포를 은닉 하는 호르몬의 전기 신호 ^20,,2122조사. 또한, siRNA 최저 할 수 있습니다, 특정 억제제 사용할 수^{20,,2122,,2324}없는 경우에 특히 유용. 창 자 조직 Ussing 챔버에 장착 하는 쥐에서 최근 사용 되었습니다 담 즙 산 자극된 GLP-1 분 비, 장 organoids (쥐)에서 동안 기본 분자 메커니즘을 공부 하 고 인간의 직감 조각 또한 공부에 대 한 사용 되었습니다는 창 자 호르몬 분 비^17,25의 분자 세부 사항. 반면 되 전 혜택 편광² 이러한 모델의 모든 정적 외피를 포함 한다. 그러나 인간의 직감 조각에 대 한 연구는, 설치류, 보다는 오히려 인간, 조직 7TM 수용 체의 조직 식에서 종 차이부터 중요 한을 사용 하 여 혜택 및 분자 운송업 자 다른 분자 감지 경로 사이 발생할 수 있습니다. 종입니다. 사실,이 분야에서 대부분 데이터 돼지, 쥐 또는 쥐에 대 한 연구에 의해 생성 되었습니다 하 고 이러한 연구 결과 인 간에 게 전송 될 수 있습니다 여부 애매 남아. 그러나 그것은,, 기초가 GLP-1 분 비를 자극 하는 포도 당 분자 감지 메커니즘 마우스, 쥐, 사람, 사이 비슷한 것 처럼 안심 하 고 transcriptomic 및 마우스 및 인간의 L-셀 프로 파일링 peptidomic 공개 강한 글로벌 2 개의 종의^7,18,,2627사이의 유사성.

그러나 끼얹는다 고립 된 쥐 작은 창 자,, 또한 고려해 야 하는 몇 가지 제한이 있다. 가장 중요 한 것은, 주어진된 분 비 응답 결과에서 대상된 호르몬 생성 세포의 시험 물질에 의해 직접 활성화 또는 오히려은 인해 발생 하는지 확인 간접 메커니즘 수 아니다. 예를 들어, KCl는 즉시 perfused 내장⁷, GLP-1의 분 비를 증가 하지만 알 수 없는 남아 여부이 직접 도발은 L 셀의 결과 또는 L-세포 주변 신경의 도발은 또는 효과의 결과 paracrine 자극/저 해제를 동시에 발표 했다. Perfused 내장을 사용 하 여 기본 분 비 하는 분자 메커니즘을 명료 하 게 하는 연구에서 발생, 따라서 항상 넣을 수 컨텍스트 설정 하는 기능을 증가 하기 위하여 다른 더 구체적인 모델에서 얻은 데이터와 인과 관계입니다. 예를 들어, 포도 당 자극 GLP-1 분 비 및 기본 마우스 L 세포 GLP-1 은닉 셀 라인 GLUTag^,2829 에서 포도 당 운송업 자 (SGLT1 및 GLUT2)의 활동에 따라 달라 집니다. 분 비²⁰, GLP-1 분 비 포도 당 자극은 크게 L 셀에 포도의 직접 행동에 의해 중재 가능성이 다는 것을 의미를 약하게 또한 끼얹는다 쥐 소장에이 전송기를 차단. 격리 perfused 내장의 또 다른 중요 한 한계 지질 중 일부 그들의 hydrophobicity 인해 공부 하기 어려운 것입니다. 지질 소화 (지방산, diacyl glycerols, lysophosphatidylglycerols, 등)의 최종 제품을 조사 하 고 준비 다시 esterify 수 있습니다 있지만 지질 intra-cellularly 그리고 아마도 그들을 팩을로 chylomicrons, 세포와 그들의 후속 글귀는 villi의 lacteals에 의해 chylomicrons 전송 중단 됩니다 때문에 격리 된 림프 흐름을 보안 수 없습니다. 대부분, 따라서 지질 흡수 중단 됩니다 일단 흡수 제품 셀에 축적 하는 시작. 생체 외에서 셀 시스템은 지질 연구에도 덜 적합 분극의 그들의 부족 때문에. 물론,이 제한만 흡수 되 고는 lacteals 통해 전송 하는 지질에 대 한 관련, 그 창 자 혈관을 통해 흡수 하는 반면 정상적으로 처리 될 가능성이 있다.

프로토콜

모든 연구는 덴마크 동물 실험 검사자 (2013-15-2934-00833)와 덴마크 입법 동물 실험 (1987 년)와 국가 통치의 지침에 따라 지역 윤리 위원회 허가 실시 했다 건강 (출판물 번호 85-23)의 학회.

1. 실험 동물

1. 남성 Wistar 쥐 (250 g)와 가져오고, ad libitum 액세스 표준 차 우와 물를 가진 감 금 소 당 2 집 12시 12분에 유지 h 빛 어두운 주기에. 우리의 동물 시설 처리 비 물 및 Alrtromin 설치류 차 (1319 크고, Brogaarden, Lynge, 덴마크)를 사용 합니다.
   참고: 수 동물 순응의 최소한 1 주일.

2. 수술 전 준비

1. 관류 버퍼 확인: Krebs 벨소리 중 탄산염 버퍼 보충 0.1 %BSA (분수 V), 5% dextran T-70, 3.5 mmol/L 포도 당, 및 5 mmol/L pyruvate, 롤, 그리고 조미료 (필요한 경우); 산도 7.4입니다.
2. 필터의 적절 한 크기를 통해 필터링 하 여 적절 한 양의 관류 버퍼를 준비 하 고 5 M HCl의 dropwise 추가 의해 ~7.5에 pH를 조정.
3. 추가 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (필요한 경우) 버퍼에 직접 10 µ M의 최종 농도에 연구의 날에.
   참고: IBMX [캠프]_나 증가 및 그로 인하여 감도 및 응답성의 분 비 자극 호르몬을 분 비 하는 점에서 용기를 복원 포스 억제제 이다.
4. 테스트 솔루션을 준비 합니다. 필터링 된 및 pH 조정 관류 버퍼에 원하는 최종 농도 보다 높은 농도 x 20에 혈관 자극을 준비 합니다. 최종 농도 isotonic 식 염 수에 luminal 테스트 자극을 준비 합니다.
5. 100% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 쉽게 녹는 화합물을 녹이 고 희석 관류 버퍼 또는 isotonic 식 염 수에 추가. 혈관 자극에 대 한 1%에서 최종 DMSO 농도 유지 또는 아래, 위의 농도로이 소장 손상 난다 창 자 호르몬 분 비로 이어질 수 있습니다. PH를 측정 하 고 필요 하다 면 ~7.5를 조정 합니다.

3. 운영 및 관류

참고: 관류 설치의 그림은 그림 1에 제공 됩니다.

1. 수술 마 취와 진통 Hypnorm/Midazolam에 의해 30-40 분 동안 지속할 수 있는 마 취 처방 사용 하 여 쥐를 anesthetize (ml 당 0.3 ml/100 g 체중: Hypnorm: 0.08 밀리 그램 펜타닐, 2.5 mg fluanisone, 0.45 mg 메 틸 Parahydroxybenzoate, 0.05 mg 틸 Parahydroxybenzoate, Midazolam: 1.25 mg, 매트릭스 제약, 헬 레 루프, 덴마크)
2. 반사 (발가락 핀치) 부족 확인 하 고 온수 운영 테이블에 쥐를 놓고 내장을 노출에 피부 절 개를 수행.
3. 소장 가능한 만큼 옆으로 이동 하 여 콜론의 터미널 부분을 노출 합니다. 콜론, 작은 창 자 쪽으로 이동의 터미널 부분에서 시작 하 고 점차적으로 그것은 콜론 및 소비 세를 맥 관 구조를 공급의 넥타이.
   1. 단지 소장의 특정 부분을 관류 (윗부분)에 필요한 경우, 맥 관 구조를 공급을 묶는 후 비 필요한 세그먼트를 삭제할. 조직 피해를 최소화 하기 위해 보습 isotonic 식 염 수와 함께 소장 하 고 면봉을 사용 하 여 제거 하는 결합 조직.
4. 플라스틱 튜브를 삽입 (길이: ~ 15 cm, 외경: ~0.4 cm) 봉합 제대로 사용 하 여 (근 부분)에서 창 자 루멘에 넥타이. Chyme 루멘을 isotonic 식 염 수 (실내 온도)와 신중 하 게 플러시.
5. Perfuse 0.25 mL/min의 흐름에서 isotonic 식 염 수와 루멘, 주사기 펌프에 연결 된 10 mL 주사기를 사용.
6. 그래서 위 mesenteric 동맥은 소장을 옆으로 이동 하 고 노출 동맥을 연결 하 고 지방 조직을 제거.
7. 좋은 포인트 집게;를 사용 하 여 mesenteric 동맥에서 장소 2 봉합 하나는 봉합의 제어는 동맥을 자르고 다른 동맥에 배치 하는 카 테 터 고정입니다 일단 출혈 동맥을 해제입니다. 하지 동맥을 꿰뚫기 위하여 주의 가져가 라.
8. 금속 테 관류 폐수의 수집에 대 한 정 맥에 배치 하는 것을 보호 하기 위한 포털 정 맥 아래 두 봉합을 배치 합니다.
9. Mesenteric 동맥에 구멍을 절단 하기 전에에 삽입 된 동맥으로 카 테 테 르 air embolus 형성을 방지 관류 버퍼 가득 확인 합니다.
10. 수술가 위를 사용 하 여 mesenteric 동맥에 작은 구멍을 삭감 하 고 플라스틱 카 테 터를 삽입 후 즉시.
11. 카 테 터를 확보 한 후에 바로 롤러 펌프를 시작 하 여 소화 관의 재 관류를 시작 (유 속 = 7.5 mL/min).
12. 몇 초 이내에 혈관 차례 창백한 포털 정 맥 회전 창백한 확인 합니다.
13. 적절 한 관류 포털 정 맥에 구멍을 뚫고 설정 된 후에 즉시 금속 카 테 터를 삽입 하 고 봉합을 확보.
    참고: 카 테 터는 곳 하지만 정 맥 가장 인접 봉합 도움이 됩니다 조심 스럽게 당겨서 해제 어려울 수 있습니다.
14. 일단은 카 자리에 관류 출력은 만족, 횡 경 막의 구멍 뚫 기, 되는 카 테 터를 찾아다니면서 하지 않도록 주의 하 여 쥐를 죽 일.
15. 1 분 동안 관류 출력을 수집 하 고 볼륨을 측정. 클릭 실행 실험 압력 레코딩 프로그램에 의해 관류 압력 수집/녹음을 시작 합니다.
16. 실험 기간 동안 밖으로 건조에서 그것을 방지 하기 위해 moistened 조직으로 용기를 커버.
17. 내장의 선단부 luminal 방류 수 종료, 그렇지 않으면 창 자 팽창 것입니다, 부 종 개발, 관류 압력 증가, 고 관류 출력 떨어질 것 이다 차단 되지 않습니다 확인 하십시오.
18. 실험을 시작 하기 전에 약 30 분 동안 준비를 둡니다.
    참고: 창 자 호르몬의 분 비 출력 되므로 하지 관류의 첫번째 15 분에 대 한 집념이 평형 단계 꾸준한 기준선을 얻을 하는 데 필요한.

4입니다. 실험

1. 관류의 약 30 분, 후 분수 수집기를 사용 하 여 첫 번째 기준선 샘플을 수집 하 여 실험을 시작 합니다. 원하는 시간 간격에서 샘플을 수집 (예를 들어, 모든 분, 6.5-7.5 mL 보통 수집) 얼음 몇 분 이내에 그들을 배치.
2. 거품 트랩을 정기적으로 검사 하 고, 비우지 관류 버퍼와 그것을 리필.
   1. 바로 전에 그것은 기관 및 기관 metabolically 활성 상태 인지 확인 하는 문맥에서 (후에 그것은 장기를 통해 끼얹는다 되었습니다) 삽입 카 테 터에서 3 방향 수 탉-밸브를 통해 버퍼를 수집 합니다. 시작 하 고 실험을 통해 생존 능력을 평가 하는 실험의 끝에 샘플을 수집 합니다.
   2. 측정 샘플 신속 하 게 자동화 된 혈액 가스 분석기와 함께 가장 플라스틱 포함/주사기는 완전히 밀폐 기한 대기 공기와 교환 하.
3. 기준 컬렉션의 10-15 분, 후 첫 번째 테스트 물질 자극. 3-방법으로 자 지를 통해 주사기 펌프 내부 동맥 stimulations를 관리 (흐름 = 0.350 mL/min).
4. 초기 bolus 주사 (2.5 mL/min 첫 번째 5 분 동안), isotonic 식 염 수를 대체 하기 위하여 루멘, 테스트 솔루션 낮은 유량 (0.5 mL/min)의 뒤에 이미 있는 luminal stimulations를 수행 합니다.
5. 일단 luminal 자극 기간 끝나면 시험 물질의 루멘 비운 신속 하 게 보장 하기 위해, 위와 같은 흐름 율을 적용 하 여 isotonic 식 염 수와 창 자 루멘을 플러시.
6. 다음 시험 물질 투여 전에 15-30 분에 대 한 초기 샘플을 수집 합니다. 프로토콜에 따라 2-3 시험 자극 보통 실험 당 포함할 수 있습니다. 실험 프로토콜에 주어진된 간접적인의 관리와 동시에 주어진된 분자 사이트의 활성화/저해 있으면 항상 미리 자극 활성/억제 물에 간접적인 관리 하기 전에 10-15 분 간접적인 주입의 바로 처음부터 분자 사이트 저해입니다 확인 하십시오.
7. 프로토콜의 끝에, 자극 기간 후 테스트 하는 준비의 응답에 대 한 고 10-15 분 기준 샘플을 수집 (5-10 분) 적합 한 긍정적인 제어를 관리 합니다.
   참고: 여러 테스트 물질 예: 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다, 자극 증가 [캠프]_나 (예: foskolin 또는 IBMX), [캘리포니아^{2 +}]_나 예: bombesin (neuromedin C), depolarizing 에이전트 (예:, 30-50 m m KCl) 이상 macronutrients 같은 순수 관련 자극: 포도 당, 유도체, 아미노산, 등등. 그러나, 긍정적인 제어의 실험 결과에 따라 달라 집니다. 포도 당은 이다 예를 들어 가난한 cholecystokinin (CCK) 간접적인 bombesin은 포도 당 의존 insulinotropic 펩 티 드 (GIP) 분 비³⁰에 대 한 강력한 간접적인 반면.
8. 실험 종료 후 perfused 용기를 삭제할 하 고 그것의 무게의 길이 측정 한다. 그것 paraformaldehyde에 넣고 저장 (4 ° C) 잠재적인 나중 조직화 학적인 분석을 위한 조직 무결성/손상, 예를 들어 H & E 염색에 의해.

5. 생 화 확 적인 측정

1. 사내 또는 상용 방사 (RIA)의 사용에 의해 분 비 정 맥 유출에 펩 티 드의 농도 정량 또는 ELISA 분석 실험. 장 흡수를 조사 하는 연구에 대 한 관심, 예:, 포도 당 이나 아미노산, 정 맥 유출에의 분자 계량.
   참고: Perfusate는 일반적으로 (예: glucoseoxidase 메서드에 의해 포도의 정량화) 효소 반응에 의존 하는 분석 실험을 포함 한 대부분의 분석에 대 한 좋은 기초 버퍼입니다.

6. 데이터 분석

1. 다른 방법으로, 예를 들어 실제 분 비 출력을 보여주는 시간 농도 그래프로 데이터를 제시 (흐름 농도 x) 및 총 분 비 기준 및 응답 기간 (보통 10-15 시간 점) 동안 출력을 묘사한 열 플롯.
2. 농도 단위는 해당 호르몬의 실제 측정 된 농도 플롯 합니다. (pmol/L),
   참고: Vivo에서 학문, 달리이 모델 획득된 값이 (관류 유출의 일정 한 수집) 때문에 실제 분 비 출력 때문에 대신 출력 (fmol/min)으로 데이터를 표현 하는 것이 바람직합니다.
3. 통계적으로 분석 하는 그룹의 수에 따라 사용 양측 쌍 t-검정 (2 개 그룹) 또는 반복된 측정 (두 개 이상의 그룹)에 대 한 단방향 ANOVA 뒤 여러 비교에 대 한 적절 한 게시물-특별 시험.

결과

주어진된 자극 하면 관심의 창 자 호르몬의 분 비 여부를 결정 하는 기능 꾸준한 기준선 분 비에 의존 합니다. 또한, 자극에 대 한 응답이 관찰 되는 경우 긍정적인 통제에 대 일 분 비 응답 분명 테스트 자극에 응답의 부족 응답의 일반적인 부족을 반영 하지 않는다는 것을 제외 하 여야 합니다. 그림 2A 와 2B 좋은 품질 데이터;의 예를 보?...

토론

격리 된 끼얹는다 쥐 소장 역학과 분자 메커니즘을 자세히 공부 하는 창 자 호르몬 분 비를 기본 허용 하는 강력한 연구 공구 이다. 이 모델을 사용 하 여 데이터의 성공적인 생산을 위한 가장 중요 한 단계는 수술입니다. 용기의 처리는 필연적으로 내장에 손상을 발생 하 고 그러므로 지켜져야 한다 절대 최소. 심지어 더 중요 한 것은, 작업의 속도 mesenteric 동맥에 카 테 테 르 배치에 대 한 시간에 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals for perfusion buffer
Bovine serum albumin (BSA)	Merck	1.12018.0500
Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O)	Merck	102382
Dextran 70	Pharmacosmos	40014
Fumaric acid disodium salt (C44H2Na2O4)	Sigma Aldrich	F9642
Glucose (C6H12O6)	Merck	108342
Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4)	Merck	105886
Potasium chloride (KCl)	Merck	104936
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Merck	104873
Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4)	Merck	106619
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck
Sodium chloride (NaCl)	Merck	106404
Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O)	Merck	106445
Name	Company	Catalog Number	Comments
Perfusion equitment
Universial perfusion system	Harvard Bioscience, Inc.	732316
BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834	Harvard Bioscience, Inc.
Roller Pump, with four channels	Harvard Bioscience, Inc.	730100
Windkessel	Harvard Bioscience, Inc.	732068
Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz	Harvard Bioscience, Inc.	730125
Operating table, heated on tripod stand, type 873	Harvard Bioscience, Inc.	733776
Cannula with basked, OD = 2.0 mm, ID = 1.0 mm	Harvard Bioscience, Inc.	733313