생체 외에서 교양된 폐 포 상피 세포에서 할로겐화 가스의 농도 제어 하는 방법

요약

우리 소설을 테스트 하 고 상피 폐 상해에 관련 된 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 향상 sevoflurane 또는 isoflurane에서 생체 외에서 의 농도 정확 하 고 제어를 도달 하도록 특별히 설계 된 쉬운 프로토콜 설명 급성 호흡 곤란 증후군에 대 한 요법입니다.

초록

급성 호흡 곤란 증후군 (아즈)은 장애인된 치경 유체 허가와 심한 염증 확산 치경 상해의 증후군. 환자 실 (ICU) 환자의 진정 sevoflurane 등 isoflurane, 할로겐화 대리인의 사용은 가스 교환을 향상, 치경 부 종 감소 고 아즈 동안 염증 감소 수 있습니다. 그러나, 폐 손상을 방지 하거나 치료 중 환자 실에서 지속적인 진정에 대 한 흡입 제의 사용에 대 한 데이터 부족입니다. "생리" 조건 하에서 폐 포 상피 세포에 할로겐화 대리인의 효과 연구, 우리는 공기 액체 인터페이스에 문화 세포에 쉽게 시스템을 설명 하 고 정확한 제어 "공기" 분수를 제공 하는 할로겐화 요원에 게 노출 하 고 이러한 에이전트의 "매체" 농도 우리는 인간의 폐 포 상피 불멸 하 게 셀 접시 sevoflurane 또는 isoflurane 마 취 기계 회로 의해 제공 지속적인 가스 교류를 사용 하 여 정확한, 제어 부분에 노출 될 수 밀봉된 밀폐 챔버 개발. 세포는 24 시간 동안 sevoflurane의 4%와 isoflurane의 1%에 노출 되었다. 가스 질량 분석은 매체에 녹아 할로겐화 대리인의 농도 결정 하기 위해 수행 되었다. 후 첫 번째 시간, sevoflurane 및 매체에서 isoflurane 농도 했다 251 mg/L 및 25 mg/L, 각각. Sevoflurane와 isoflurane의 농도 나타내는 곡선 고원 노출 후 1 시간에 도달와 함께 시간이 지남에, 유사한 과정을 보여 중간에 녹아.

이 프로토콜은 sevoflurane 또는 isoflurane에서 생체 외에서 아즈 중 상피 폐 상해에 관련 된 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 개선 하 고 테스트에 대 한 새로운 치료의 농도 정확 하 고 제어를 도달 하도록 특별히 설계 된는 증후군입니다.

서문

급성 호흡 곤란 증후군 (아즈) 확산 치경 부상, 폐 부 종, 그리고 hypoxemic 호흡기 장애를 특징으로하는 임상 증후군 이다. 아즈 환자 실 (ICU) 입원의 10% 이상 및 기계 환기를 필요로 하는 중 환자 실 환자의 약 25%를 나타냅니다, 하지만 그것은 여전히 35-45¹의 병원 사망률과 임상에 대 한 인식 아래 도전. 강렬한 연구에도 불구 하 고 날짜는 효과적인 아즈 약리학 적인 치료 또는 예방의 식별 하지 못했습니다. 아즈에 있는 사망에 기여 하는 두 가지 주요 기능: 장애인 치경 유체 클리어런스 (AFC) (즉, 말 초 폐 일에서 치경 부 종 액체의 바꾸 인된 재흡수) 및 심한 염증². 이후 아즈 사망률 높은 유지, 현재 사업 또한 기본 예방;를 포함 해야 한다 그러나, 핵심 과제 아즈 개발 것입니다 누구에 아즈 했다 방해 하는 경우 도움이 될 것 이라고 누가 위험 환자를 식별 하는.

Sevoflurane 등 isoflurane, 휘발성 할로겐화 마 취약 수술 실에서 전신 마 취를 제공 하기 위해 널리 사용 됩니다. 세계 전반, 주요 수술 시 매년 230 백만 이상 환자 전신 마 취와 기계 환기³, 필요 하 고 수술 후 폐 합병증 저하 임상 결과 의료 이용⁴ . Propofol 대신 sevoflurane 사용 하 여 향상 된 폐 염증 환자의 흉부 수술 및 수술 후 폐 합병증⁵아즈 등 부작용에 상당한 감소와 연관 되었다. 마찬가지로, 전처리와 isoflurane 아즈^6,7의 실험 동물 모델에서 호흡 역학, 산소, 그리고 hemodynamics 보호 효과 했다. 폐 합병증에 유사한 감소는 흡입 마 취 에이전트 보여주는 메타-분석, 최근 관찰 되었습니다 더 연구는 흡입 제의 noncardiac 수술에서 결과에 영향을 해결 하기 위해 보증 하 고, 비록-로 정 맥 마 취에 반대-심장 수술⁸에 대 한 사망률 감소와 크게 관련 있다.

중 환자 실 환자를 방지 하거나 치료 폐 손상의 진정에 대 한 휘발성 에이전트의 사용에 대 한 특정 예비 데이터 부족. 그러나, 여러 시련은 이제 흡입된 sevoflurane의 안전과 효능 중 환자 실 환자의 진정에 대 한 지원과 전 임상 연구 흡입된 sevoflurane 및 isoflurane^7,9 감소, 가스 교환 개선 치경 부 종, 그리고 아즈의 실험 모델에서 약하게 염증. 또한, sevoflurane isoflurane 꽉 접합 단백질¹¹의 변조를 통해 치경 모 세관 방 벽의 무결성을 유지 하는 반면 유형 II 상피 세포 손상¹⁰을 완화 합니다. 그러나, 더 연구는 어느 정도 흡입된 sevoflurane와 isoflurane 장기 보호의 실험적인 증거는 인 간에 게 번역 될 수 있는 확인 필요 합니다. 첫 번째 단일 센터 무작위로 제어-재판 (RCT) 우리 그룹에서 발견 아즈 환자에서 흡입된 sevoflurane의 초기 사용 향상 된 산소, 일부 프로-염증 성 마커 및 감소 된 폐 상피의 감소 된 수준에 연관 손상, 플라즈마와 치경 유체¹²고급 glycation 엔드 제품 (sRAGE)에 대 한 수용 체의 수용 성 형태의 레벨에 의해 평가.

함께 찍은, 폐 상해에 sevoflurane 및 isoflurane의 유익한 효과 여러 생물 학적 경로 또는 업무 프로세스 분노 경로에 종속 된 즉 치경 유체 클리어런스 (AFC), 상피 부상, 가리킬 수 있습니다. 핵 요인 (NF)의 전-κB, 및 대 식 세포 활성화. 또한, sevoflurane 분노 단백질 자체의 식 영향을 미칠 수 있습니다. 우리의 연구 팀과 다른 사람에 의해 이전 연구 아즈 동안 치조 염증과 폐 상피 부상/수리에 분노에 대 한 중추적인 역할을 지원, 하기 때문에 우리는 변환 메커니즘의 이해를 제공 하는 실험 모델 설계 폐 상해 및 복구^13,,1415sevoflurane. Sevoflurane 및 isoflurane의 생체 외에서 효과 주변 폐, hAELVi (인간 폐 포 상피 LentiVirus의 공기-혈액 장벽 공부 하도록 특별히 설계 된 새로운 인간의 폐 포 상피 1 차 셀 라인에 조사 했다 불후의 명작), 치경 유형-같은 특성 기능 단단한 접속점¹⁶를 포함 하 여.

우리의 체 외에서 조사 설계를 준비 하는 동안 (예를 들어, "흡입된" sevoflurane 또는 isoflurane 노출 공기 액체 인터페이스에서 폐 포 상피 세포의 문화, 우리가 이해에서 이전에 게시 하는 연구 sevoflurane의 분수는만 "공기" 인터페이스^17,,1819 표준 모니터 (임상 설정에서 사용 되는 유사한)을 사용 하 여 평가 되었습니다. 할로겐화 에이전트 농도 일반적으로 최소 치경 농도 (MAC) 값에 따라 선택 되었다 (예를 들어, 인간, sevoflurane에 대 한 0.5, 1.1, 및 2.2 vol %, 0.25, 0.5, 및 1 맥 대표 isoflurane, 0.6, 0.8, 각각;에 대 한 고 1.3 vol % 각각 0.25, 0.5, 및 1 맥 대표)²⁰. 실제로, sevoflurane 및 isoflurane 농도 문화 매체 자체, 따라서 이전 실험 모델/계기의 타당성을 제한에서 조사 적 있다. 또한, 대부분 실험 후 공기 혼합 포함 sevoflurane 내부 플러시 했다 밀봉 했다 혐 기성 병 사용. 우리의 목표는 "생리" 조건 하에서 폐 포 상피 세포를 공부 하는, 우리는 같은 혐 기성 상태가 최적의 않을 수 있습니다 및 긴 실험 기간와 호환 되지 않을 것 이라고 믿 었 다. 따라서, 우리 공기 액체 인터페이스에 문화 세포에 우리의 자신의 시스템을 개발 하 고 정확한 제어 "공기" 분수 및 이러한 에이전트에 대 한 "중간" 농도 제공의 목표로 할로겐화 대리인 (sevoflurane 및 isoflurane)에 그들을 노출. 우리의 의견에 보고 하지 않은 문학에 날짜,이 실험 단계 이전에 어떤 더 생체 외에서 조사 sevoflurane 및 isoflurane 필수입니다.

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프로토콜

1. 폐 포 상피 세포 (hAELVi)의 문화

1. 녹고
   1. 15 mL 플라스틱 튜브에 재배 준비-사용 인간의 폐 포 상피 (huAEC) 매체의 4 mL를 플라스틱 하 고 신속 하 게 따뜻한 물 목욕 (37 ° C)에 유리병을 녹여.
   2. 5 분 동안 200 x g에서 튜브 centrifuging 전에 매체의 4 mL를 포함 하는 15 mL 플라스틱 튜브에 해 동된 세포 현 탁 액을 전송.
   3. 상쾌한 발음 하 고 재배 매체의 5 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend. 다음, T25 플라스 크에 세포를 전송.
   4. (5% CO₂, 95% 습도 공기, 37 ° C) 표준 조건 하에서 세포를 배양
2. 분
   1. 현미경으로 세포의 상태를 확인 합니다. 셀 80-90% 합칠 때, 단계 1.2.2 1.2.10 통해 셀 분할.
   2. 살 균 피 펫 셀의 재배 미디어 발음
   3. 셀 4 mL의 Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 분 (DPBS)을 한 번 세척 하 고는 DPBS 발음.
   4. 세포 분리; 시작 될 때까지 3 분 동안 37 ° C에서 배양 하는 이전 세포를 트립 신/EDTA 솔루션 (테) 1 mL를 추가 현미경 분리를 확인 합니다.
   5. 문화 매체의 2 mL로 세포를 resuspend 하 고 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심. 그리고, 발음은 상쾌한 재배 매체의 3 mL와 함께 다시 셀 펠 릿 resuspend.
   6. Trypan blue 염료 배제 분석 결과 사용 하 여 세포의 생존 능력을 결정 하. 세포 현 탁 액의 30 µ l 고 trypan 블루 튜브에서의 0.4% 솔루션의 30 µ l을 추가. 그 후, 효과적으로 3-5 회 100 µ l 피 펫을 사용 하 여 솔루션을 혼합. 솔루션의 10 µ l를가지고 고는 hemocytometer의 coverslip에서.
   7. 계산 실행 가능한 세포의 총 수와 죽은 세포의 수 (파란색)는 hemocytometer의 지역에서. 그런 다음 계산 하는 방정식을 사용 하 여 셀 생존 [%]: 세포 생존 능력 = 100-(100 / 총 셀 개수 x 죽은 세포의 수)
   8. 새로운 셀 문화 T25 플라스 크 또는 6 잘 플레이트 resuspended 셀 펠 릿으로 약 수를 전송 합니다. T25 플라스 크에서 재배 매체의 5 mL 또는 6 잘 플레이트의 각 잘 1 mL의 총을 달성 하기 위해 셀에 재배 매체를 추가 합니다.
   9. 표준 조건 (5% CO₂, 95% 습도 공기, 37 ° C)에서 인큐베이터에서 세포를 배양
   10. 일단 세포가 완전히 confluent, 그들은 실험에 대 한 준비가 되었습니다.

2. 밀폐 챔버의 준비

참고: 밀폐 챔버에 대 한 건설 계획은 그림 1. 에 그려져

1. 신비한 폴 리 프로필 렌 상자를 사용 하 여 6.5 l.의 용량 길이, 너비, 및 높이 30 x 20 x 15.5 c m, 각각입니다. 상자의 볼륨은 둥근된 모서리 때문에 이론적인 볼륨 보다 낮은 note 하시기 바랍니다.
2. 측면 벽의 하단 측면에 2.5 cm 직경 구멍을 드릴 합니다.
3. 가스 공기 혼합물 입력된 파이프 역할을 하 고 실리콘 물개는 녹색 마크와 골 판지 튜브를 삽입 합니다.
4. 반대 측면 벽의 위쪽에 있는 두 번째 2.5 cm 직경 구멍을 드릴 합니다.
5. 빨간색 표시와 함께 또 다른 골 판지 튜브를 삽입 하 고 가스 공기 혼합물 출력 파이프 역할을 하 고 실리콘 밀봉 숯 필터와 연결.
6. 상자의 평균 벽의 중심에 꽉 4 m m 직경 구멍을 드릴 합니다.
7. 회전 남성 루어-자물쇠, 가스 분석기에 연결 하 고 실리콘 밀봉 매니폴드에 연결 된 짧은 주입 튜브를 삽입 합니다.
8. 밀폐 챔버 내부 디지털 온도계/습도 계를 배치 합니다.

3. 노출 할로겐화 대리인 (Sevoflurane Isoflurane)를 폐 포 상피 세포

참고: 장치의 그리기 회로도 그림 2. 에 묘사 된다

주의: 동물 연구 태아 손상 또는 장애 불 임의 증거가 밝혀졌다 그리고 cesarean 섹션 중 아주 작은 연구는 어머니 또는 태아에 어떤 형편이 나쁜 효과 보여주지 않았다, 비록 사용 하 여 안전 할로겐화 대리인 (예를 들어, sevoflurane 또는 isoflurane) 노동 및 배달 증명 되지 않았습니다 날짜. 또한, 제어 데이터 인간의 임신 동안 수집 된 했다. 따라서, 수행 하는 동안 임신 해야 좋습니다 sevoflurane 또는 isoflurane를 사용 하 여 실험.

1. 실험실 용 추출기 후드 작동 합니다.
2. 이산화탄소 (CO₂)에 의해 질소 산화물의 가스 라인을 전환 하는 마 취 기계 회로 사용자 지정 합니다.
3. 사용자 지정 된 마 취 기계 회로에 녹색 표시, 골 판지 튜브와 밀폐 챔버를 연결 합니다. 마 취 기계와 따뜻한 약 37 ° C에 가스 흐름 혼합 밀폐 챔버 사이의 파이프에 삽입 (예: ICU 통풍 기에 사용)가 열된 가습기
4. 난방을 제공 하는 뜨거운 접시에 밀폐 챔버를 설치 온도 37 ° c.의 접시
5. 6 잘 플레이트 포함 하는 공기-꽉로 hAELVI 셀 챔버 및 뚜껑 밀봉 넣어.
6. CO₂ 의 5% 및 95% 습도 공기의 표준 상태를 신속 하 게 가스 유량 (즉, 공기, CO₂의 혼합물)을 조절 합니다.
7. 할로겐화 에이전트 증발을 열고 원하는 비율을 선택 (현재 연구에 sevoflurane 및 isoflurane 시험된 농도 4%, 1%, 각각).
8. 가스 혼합물 및 sevoflurane isoflurane 농도의 외부 가스 분석기로 측정 하 고 표시로 화면에 구성 note
9. 일단 대상 값, 달성 1 L/min에 신선한 가스 흐름 율을 줄일 수 있습니다.
10. 이 가스 유량과 실험에 필요한 만큼 밀폐 챔버를 유지할 수 있습니다.

4. 측정 Sevoflurane 또는 크로마토그래피에 의해 Isoflurane

1. 샘플의 준비
   1. 다른 시간 지점에서 아주 짧게 공부 샘플을 챔버 열 (현재 연구에 우리 6 잘 플레이트 사용) 뚜껑을 닫습니다. 상자에 다른 샘플을 유지. 그런 다음, 다중 볼륨 조절 micropipette와 각 샘플에 포함 된 매체의 1 mL 발음.
   2. 테 플 론 밀폐 캡으로 단단히 밀폐 망 한다 10 mL headspace 크로마토그래피 튜브에 매체를 넣어. 당신은 즉시 그들을 사용 하지 않는 경우-20 ° C에서 크로마토그래피 튜브를 고정 합니다.
   3. Sevoflurane의 재고 솔루션 및 isoflurane의 다른 재고 솔루션 메탄올에 50 g/L에서 모두 준비 합니다. 동시에, 클로 프롬 (내부 표준, IS) 메탄올에서 2 g/L에서의 재고 솔루션을 준비 합니다. -20 ° c.에 모든 표준 솔루션 저장
   4. 작업 솔루션 sevoflurane 및 isoflurane 50, 500, 및 초순 수/디 메 틸 sulfoxyde에 5000 mg/L에서의 준비 (50: 50; v/v). 내부 표준화에 대 한 작업 솔루션 메탄올에서 100 mg/L에 고정 됩니다.
2. 분석의 세포 샘플
   참고: 추출 절차는 가스 크로마토그래피 및 질량 분석 Bourdeaux 외 에서 이전 확인된 방법에 따라 ¹ 그리고 감 성과 특이성의 동일한 매개 변수를 사용 하 여. Sevoflurane와 클로 프롬 (IS)이이 프로토콜에 사용 되었다 그리고 isoflurane multiparametric 분석 방법와 연결 했다. 간단히, 질량 분석 수집 방법 순수 솔루션 주입 후 개발 되었다. 다음, m/z 기준 및 문학 데이터 확인 됐다. 3 m/z (IS)를 제외 하 고 각 분석에 대 한 선정 됐다: 풍부, 정량화에 대 한 곡선 아래의 영역을 통합 하 여 계산 되었다 (가장 풍부 하 고 높은), 정량화에 대 한 한 m/z 및 확인에 대 한 두 개의 m/z. 3 m/z를 사용 하 여, analytes 수 수 특별히 확인 때문에 모든 m/z 동일한 보존 시간 뿐만 아니라 모든 m/z 금액 (이온 확인 대 부 량의 친척) 때문에 순수한 표준 및 모든 샘플에서 동일한. 이 인수 모드 analytes 식별 고 좋은으로 계량 될 수 있습니다.
   1. 0.5-400의 농도 범위 보정 8 포인트 곡선 생성 mg/L 및 여러 품질 컨트롤 (0.5, 1, 5, 10, 20, 75, 200, 및 400 mg/L).
      참고: 각 교정의 유효성을 검사 하려면 4 개의 품질 컨트롤 사용 되었다: 정량화의 하한값 (C1 = 0.5 mg/L), 두 중간 수준 (C2 = 20mg/L 및 c 3 = 75 mg/L)와 최종 수준 (400 mg/L에 C4; 부 량의 상위 레벨). 모든 표준 및 컨트롤 매트릭스 효과 피하기 위해 교양된 셀 행렬에 분석 되었다. 각 보정 곡선에 대 한 빈 매트릭스 배양 세포 및 내부 표준 아무 방해 이었다 유효성을 분석 했다.
   2. Sevoflurane의 재고 솔루션 및 isoflurane의 다른 재고 솔루션 메탄올에 50 g/L에서 모두 준비 합니다. 동시에, 클로 프롬 (내부 표준, IS) 메탄올에서 2 g/L에서의 재고 솔루션을 준비 합니다. -20 ° c.에 모든 표준 솔루션 저장 그런 다음 작업 솔루션 혼합된 sevoflurane/50, 500, 및 초순에 5000 mg/L에서 isoflurane에의 준비 / 디 메 틸 sulfoxyde (50/50; v/v). 대 한 작업 솔루션은 100 mg/l 메탄올에 희석.
   3. 보정 곡선 및 컨트롤, 세포 샘플 매트릭스의 1 mL에 IS (100 mg/L)의 사용률이 50 µ L에 의해 샘플을 준비 합니다.
   4. 10 mL headspace 튜브, 테 플 론 밀폐 캡으로 단단히 밀폐 망 포화 나트륨 염화 물 솔루션의 200 µ L 사용 하 여 샘플 솔루션을 준비 합니다.
3. 가스 크로마토그래피 및 질량 분석
   1. 샘플 분석, 가스 크로마토그래피, 대량 검출 방법으로 결합에서 headspace 주사를 사용 합니다.
   2. 80 ° C에서 10 분 동안 headspace 튜브 히터 통 수행. 그런 다음, 철수 하 고 가스 크로마 토 그래프에 주입 가스 샘플의 1.5 mL. 크로마토그래피 실행의 시작에서 2 분 동안 100 mL/min에서 분할 흐름 260 ° C에서 인젝터의 매개 변수를 설정 합니다.
   3. 캐리어 모드에서 프로그래밍 된 압력으로 분할/splitless 인젝터를 사용 합니다. 첫째, 0.15 분 40 kPa에서 가스 압력을 유지. 다음, 5 분 동안 300 kPa 압력 16 kPa/min의 속도 설정 하기 전에 125 kPa/분 150 kPa 속도 프로그램 압력 증가.
   4. 동시에 사출, 시작 1 분 및 증가 대 한 60 ° C의 오븐 온도 20 ° C/min의 속도로 140 ° C의 온도 도달할 때까지. 250 ° C를 얻을 때까지 다시 온도 증가 다음. 실행의 총 시간은 7 분입니다.
   5. 융합 된 실리 카 모 세관 칼럼 (30 m x 1.4 µ m, 0.25 m m ID)를 사용 하 여 크로마토그래피 분리를 실시 합니다. 단일 이온 감시 (SIM) 조건, 대량 실험을 수행 하 고 이온 정량화 m/z 181, 및 이온 자격 m/z 151과 51 sevoflurane, m/z 149에 2.30 분의 보존 시간 (RT)에 동시에 (이온 정량화), m/z 115와 87 (이온을 모니터링 자격) RT 2.8 분, m/z 83 (이온 정량화) 클로 프롬에 대 한 실시간 3.70 분에서 isoflurane에 대 한.
   6. 무게 이차 적합을 사용 하는의 그들의 지역 비율에 의해 sevoflurane와 isoflurane 세포 배양에서의 농도 결정 합니다. Sevoflurane 및 isoflurane 정량화 (LLOQ)의 하한값 0.5 mg/l 이었고 정량화 (ULOQ)의 상 한계는 400 mg/l.

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결과

Sevoflurane 시간이 지남에 매체에 녹아, isoflurane의 농도 각각 표 1 과 표 2에 보고 됩니다.

매체에서 sevoflurane 및 isoflurane 농도의 과정 동안 유사 했다. 할로겐화 대리인의 필요한 농도 설정 된 후에 즉시 농도 1 시간 동안 상승 했다. 고원 다음에 도달 했다는 할로겐화 에이전트의 중지 될 때까지 유지. 관리...

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토론

우리의 프로토콜 sevoflurane isoflurane 등 할로겐화 마 취 에이전트의 정확한 분수를 셀을 노출 하는 쉬운 방법을 설명 합니다. 또한, 우리가 여기에 보고-처음으로-가스 분수와 sevoflurane와 문화 매체 자체 내부 isoflurane의 농도 사이의 엄격한 상관 관계. 지금이 근본적인 단계 안전 하 게 우리의 밀폐 챔버를 사용 하 여 인간의 폐 포 상피 세포의 경작된 단층에 이러한 할로겐화 대리인의 효과 연구 하도?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sevoflurane	Baxter		Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane	Virbac		Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells	InScreenex	INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use)	InScreenex	INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit	Drager	Fabius
Gas analyzer	Drageer	Vamos Plus
Anesthetic gas filter	SedanaMedical	FlurAbsord
Heated Humifier	Fisher&Paykel	MR850
Chamber	Curver	00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection	Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA	Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 μm, 0.25 mm ID)	Restek, Lisses, France	Rxi-624Sil MS