N 맨끝 도메인의 Ryanodine 수용 체 이용한 배 xylostella 에서 결정 구조

요약

이 문서에서는, 우리는 다이아몬드 나 방 (이용한 배 xylostella)에서 ryanodine 수용 체의 N 맨끝 도메인의 단백질 식, 정화, 결정 화 및 구조 결정의 프로토콜 설명합니다.

초록

곤충 ryanodine 수용 체 (RyRs)를 대상으로 하는 강력 하 고 효율적인 살충제의 개발 농업 해충의 영역에 큰 관심의 되었습니다. 까지, 몇몇 diamide 살충제 RyRs 상용화 되었습니다 해충을 대상으로는 2 십억 미국 달러의 연간 수익을 생성 합니다. 그러나 RyR 타겟팅 살충제의 행동의 모드의 이해 구조 정보 곤충 RyR의 부족에 의해 제한 된다. 이 차례로 해충에 살충제 저항 개발의 이해를 제한합니다. 다이아몬드 나 방 (DBM) diamide 살충제에 저항을 표시를 보고도 전세계, 십자화과 작물 파괴 엄청난 해충 이다. 그러므로, DBM RyR, 특히 전통적인 diamide 바인딩 사이트에서 다른 영역을 대상으로 타겟팅 새로운 살충제를 개발 하는 실용적인 중요성의 이다. 여기, 선물이 구조적 특성 DBM에서 RyR의 N 맨끝 도메인 프로토콜. X 선 결정 구조 분자 교체는 해상도에 의해 해결 되었다 Å는 2.84의 베타-개미 자리의 접는 모티브와 측면에 서 알파 나선 보여줍니다. 이 프로토콜은 일반적으로 식, 정화와 다른 도메인 또는 단백질의 구조적 특성에 대 한 적응 될 수 있다.

서문

Ryanodine 수용 체 (RyRs)은 근육 세포에 sarcoplasmic 그물 (SR) 세포 막에 걸쳐 캘리포니아^{2 +} 이온의 투과 중재 하는 특정 이온 채널입니다. 따라서, 그들은 흥분 수축 연결 과정에서에서 중요 한 역할을 재생 합니다. 기능 형태의 RyR의 분자 질량을 가진 호모 tetramer로 조립 > ~ 5000 아미노산 잔류물의 구성 하는 각 소 단위와 2 MDa. 포유류에서 3 개의 isoforms는: RyR1 골격 근육 형, RyR2-심장 근육 유형 및 RyR3-다른 조직¹편 표현.

곤충에는 근육과 신경 조직²에서 표현 RyR의 한 유형이 있다.입니다. 곤충 RyR 비슷합니다 더 약 47%의 시퀀스 id 가진 포유류 RyR2³. 타겟팅 RyR의 나비목과 딱정벌레목 Diamide 살충제를 개발 하 고 바이엘 (flubendiamide), 듀 폰 (chlorantraniliprole) 및 Syngenta (cyantraniliprole) 같은 주요 기업에 의해 판매 되었습니다. 비교적 최근 출시 이후, diamide 살충제 살충제의 급성장 클래스 중 하나가 되고있다. 현재, 매년 이러한 세 가지 살충제의 판매는 2009 (Agranova) 이후 50% 이상의 성장 율을 가진 2 십억 미국 달러를 넘어 있다.

최근 연구 결과 이러한 살충제^4,,56,,78의 사용의 몇 세대 후에 곤충 저항 개발을 보고 있다. 저항 막 횡단 영역에서의 변이 RyRs 다이아몬드 나 방 (DBM), 이용한 배 xylostella (G4946E, I4790M)와 토마토 leafminer에 해당 위치에서 Tuta absoluta (G4903E, I4746M) 표시 하는 지역 로이 지역 채널^4,,89의 게이팅에 대 한 중요 한 것으로 알려져 있다 diamide 살충제 바인딩에 참여 수 있습니다. 이 지역에 광범위 한 연구에도 불구 하 고 diamide 살충제의 정확한 분자 메커니즘 애매 남아 있습니다. 또한, 그것은 하지 분명 여부 저항 돌연변이 영향을 diamides와의 상호 작용 또는 allosterically입니다.

포유류 종에서 여러 RyR 도메인의 구조와 전장 포유류 RyR1 및 RyR2의 구조 엑스레이 결정학 그리고 cryo 전자 현미경 검사 법, 각각^{10,11에 의해 이전 연구 보고가 12,13,14,15,,1617,18,19,20,21} . 하지만 지금까지, 아니 구조 곤충 RyR의 보고 되었습니다,이 이해는 분자의 복잡 한 수용 체 기능 뿐만 아니라 살충제 행동의 분자 메커니즘 및 살충제 저항의 개발에서 우리를 금지.

이 원고에서 선물이 다이아몬드 나 방, 파괴적인 해충 감염 십자화과 작물 전세계²²에서 ryanodine 수용 체의 N 맨끝 β-개미 자리의 도메인의 구조적 특성에 대 한 일반화 된 프로토콜. 게시 된 토끼 RyR1 NTD 크리스탈 구조^23,24및 곳을 알아내는-그들 구조 모델^16,17,,1819, 는 구조 설계 되었다 ^{20 , 21}. 이것은 최초의 고해상도 구조 곤충 RyR 채널 게이팅 메커니즘을 밝혀 고 구조 기반 약물 설계를 사용 하 여 종의 살충제의 개발에 대 한 중요 한 서식 파일을 제공 합니다에 대 한 보고. 구조 설명, 우리 사용 엑스레이 결정학, 원자 해상도 근처에서 단백질 구조 결심을 위한 ' 골드 표준 '으로 간주 됩니다. 결정 화 과정은 예측할 수 없는 노동 집약, 비록이 단계별 프로토콜 표현, 정화 및 곤충 RyR 또는 다른 단백질의 다른 도메인의 일반적 특성 연구를 도울 것 이다.

프로토콜

1. 유전자 복제, 단백질 표정과 정화

1. PCR 증폭 관심사의 단백질에 해당 하는 DNA (DBM RyR, 은행의 잔류물 1-205 없음 acc.. AFW97408) 및 결 찰 독립적인 복제 (LIC)²⁵애완 동물-28a-HMT 벡터에 클론. 이 벡터 포함 히스티딘 태그, MBP 태그와 N-말단에 TEV protease 분열 사이트¹⁵.
   1. LIC 호환 5' 확장명을 가진 대상 유전자의 증폭에 대 한 디자인 LIC 뇌관:
      LIC 뇌관을 전달:
      5 ' 3' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG
      역방향 LIC 뇌관:
      5 ' 3' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC
   2. 결합 반응 구성 요소 (50 μ): DNA 템플릿 (100 ng/μ), 앞으로 뇌관 (10 μ M), 역방향 뇌관 (10 μ M), DNA 중 합 효소 (코), 10 x 반응의 5 μ의 0.5 μ의 1 μ의 1 μ 1 μ 버퍼, dNTP (25 mM)의 1 μ RNase의 40.5 μ 무료 ddH₂o.
      1. PCR 기계에 반응 혼합물을 놓고 다음 프로그램을 실행 합니다.
      2. 3 분 동안 95 ° C에서 품 어와 다음의 30 주기 실행 (95 ° C 30에 대 한 s, 58 ° C 15에 대 한 s, 1 분에 72 ° C). 5 분 동안 72 ° C에서 품 어와 다음 4 ° c.에서 개최
      3. 2 %agarose 젤에 전체 반응 혼합 (50 μ)을 실행 하 고 젤 추출 키트와 함께 추출. 제조 업체의 프로토콜을 따릅니다.
   3. 결 찰 독립적인 복제 (LIC)
      1. SspI 소화 (60 μ)를 수행: 벡터 DNA의 20 μ (50 ng/μ), 반응 버퍼, SspI, 4 μ 그리고 ddH₂오 품 전체 반응 실행 3 h. 위해 37 ° C에서 30 μ x 10의 6 μ 1 %agarose 젤에 혼합 하 고 젤 추출 키트와 함께 추출. 제조 업체의 프로토콜을 따릅니다.
      2. 벡터의 T4 DNA 중 합 효소 처리를 수행 하 고 DNA를 삽입 합니다. 다음 결합: 벡터 또는 삽입 DNA의 5 μ (50 ng/μ), 10 x T4 DNA 중 합 효소 버퍼, 벡터 또는 삽입 dna, DTT (100 m m), 0.4 μ의 T4 DNA 중 합 효소 (LIC 한정)의 1 μ dCTP (25 m m)의 1 μ에 대 한 dGTP (25 m m)의 1 μ의 2 μ 그리고 20 분 동안 75 ° C에서 40 분 열 비활성화 효소에 대 한 실 온에서 ddH₂오 품 반응의 9.6 μ.
         참고: LIC 벡터 및 삽입 DNA는 별도 반응에서 처리 되어야 합니다.
      3. LIC 반응 어 닐 링을 수행 합니다. 다음 결합: T4 치료 삽입 DNA, LIC T4 치료의 2 μ의 2 μ 벡터 DNA. 10 분 동안 실내 온도에 반응을 품 어.
2. 변환 BL21 (DE3) E. 콜라 이 재조합 플라스 미드와 셀.
   1. 유능한 세포 (마이크로 원심 튜브에서 50 μ) 얼음에 녹여
   2. 추가 약 1 μ (50 기) 튜브에 플라스 미드의. 부드럽게 터치 튜브 2-3 번 하 여 세포와 DNA를 혼합. 20 분 동안 얼음에 튜브를 놓습니다.
   3. 다시 2 분 추가 1 mL 튜브에 실내 온도 파운드 미디어에 대 한 얼음에 튜브 40 s. 위 42 ° C에서 충격을 열.
   4. 장소는 250 rpm 흔드는 37 ° C에서 45 분에 혼합 튜브 150-200 µ L 선택 접시에 혼합물의 확산. 접시를 반전 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어
3. 단일 식민지와 문화 100 mL 2YT 매체 하룻밤 37 ° C에서 50 µ g/mL 대를 포함 하는 셀 선택 합니다. 다음날 아침, 접종 1 L 2YT 매체의 숙박 문화 10 mL와 함께 50 µ g/mL 대를 포함 하 고 OD₆₀₀ ~ 0.6에 도달할 때까지 250 rpm에서 37 ° C 흔드는 인큐베이터에서 품 어. 그 후 0.4 m m의 최종 농도에 IPTG로 문화를 유도 하 고 또 다른 5 h 30 ° c.에 대 한 성장
4. 4 ° C에서 10 분 동안 8000 x g 에서 원심 분리 하 여 세포를 수확, 셀을 수집 하 고 모든 10 g 셀 40 mL 세포의 용 해 버퍼 (10 mM HEPES pH 7.4, 250 m m KCl, 10mm β-mercaptoethanol, 25 μ g/mL lysozyme, 25 μ g/mL DNase resuspend 1 밀리미터 PMSF).
   1. 1 8 분 65% 진폭에서 쥡니다에 의해 방해 s에서 및 1 s. 4 ° c.에 30 분 동안 40000 x g 에서 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거 0.22 μ m 필터를 통해 전달 하 여는 상쾌한 필터 및 샘플 루프에 그것을 로드.
5. 융해 단백질 정화, 태그를 쪼개 고 다시 대상 단백질 정화.
   1. Ni NTA 열을 사용 하 여 융해 단백질 정화 (바인딩 버퍼: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 m m KCl; 차입 버퍼: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 m KCl, 500mm 이미 m) 20-250 m m 이미의 선형 그라데이션으로 정화 시스템에 의해 정화.
   2. TEV protease와 eluted 대상 단백질을 쪼개 다 (1시 50분 비율) 4 ° c.에서 하룻밤
   3. Amylose 수 지 열을 사용 하 여 분열 반응 혼합물을 정화 (바인딩 버퍼: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 m m KCl; 차입 버퍼: 10 mM HEPES pH 7.4, 250 m m KCl, 10mm 糖)과 Ni NTA 열 태그 및 TEV protease 제거 하. 대상 단백질이 두 열 흐름을 통해 일부 있을 것입니다.
   4. 투 석 버퍼 (10 mM Tris HCl 산도 8.8, 50 m KCl, 10mm β-mercaptoethanol을 소금 농도 줄이기 위해 m에 대 한 샘플 dialyze. 음이온 교환 칼럼에 샘플을 정화 (바인딩 버퍼: 10 mM Tris HCl pH 8.8, 10 m m β-mercaptoethanol; 차입 버퍼: 10 mM Tris HCl pH 8.8, 1 M KCl, 10mm β-mercaptoethanol) 차입 버퍼에 20-500 m m KCl의 선형 그라데이션에 의해.
   5. 정화 과정에서 마지막 단계로, 원심 집중 (10 kDa MWCO) 장치를 사용 하 여 단백질을 집중 하 고는 동질성을 확인 하는 Superdex 200 26/600 젤 여과 열을 삽입 합니다.
6. 15 %SDS 페이지에 그것을 실행 하 여 단백질의 순도 확인 합니다.
   참고: 모든 열 바인딩 유량 2 mL/min, 및 4 mL/min 1 mL/min에서 젤 여과 제외에 차입 유량 단백질 정화 시스템에서 실행 됩니다.

2. 단백질 준비 및 결정 화

1. 순화 된 단백질 샘플 10 mg/ml-80 ° c.에 저장 하기 전에 원심 집중 (10 kDa MWCO) 및 결정 화 버퍼를 버퍼 exchange를 사용 하 여 집중
2. 결정 화 심사 수행 (1:1 비율, 200 단백질 및 200의 nL 저수지 버퍼의 nL) 기에 의해 드롭 증기 확산 방법 96 잘 형태로 로봇 시스템을 처리 하는 자동화 된 액체를 사용 하 여 여러 결정 화 장비 295 K에서.
   참고: 우리 분자 크기와 햄튼 연구에서 키트를 사용 하 고 Gryphon 자동 액체 처리 시스템.
3. 증발을 방지 하기 위해 활성화 단백질 드롭 저수지 버퍼의 평형 96 잘 결정 화 접시를 봉인. 다음 18 ° c.에 크리스탈 인큐베이터에 접시를 유지
4. 96 잘 접시 크리스탈 형성 및 성장 모니터링 하 가벼운 현미경을 사용 하 여 주기적으로 확인 합니다.
5. 소금 결정에서 단백질 결정을 차별화, 단백질 염료를 사용 합니다. 대상 드롭 염료의 1 µ L를 추가 합니다. 약 1 시간 기다립니다 고 현미경 관찰 합니다. 단백질 결정 블루 돌 것 이다.
6. 긍정적인 결정 화 조건 (황산 암모늄 1.5 M, 0.1 m M Tris pH 8.0)를 사용 하 여 교수형을 사용 하 여 결정을 더욱 최적화 증기 확산 방법 24-잘 접시에 놓습니다.
   1. PH 7.0에서 0.5 pH 단위 간격 8.5 모든 단계를 최적화 합니다. 모든 단계 0.1 M 간격 1.2 M에서 1.7 m 황산 암모늄의 농도 최적화 합니다. (우리의 경우 대형 접시 모양의 크리스탈 생산 최고의 조건이 0.1 m M HEPES pH 7.0 및 1.6 M 황산 암모늄)

3. 크리스탈 장착, x-선 데이터 수집 및 구조 결정

1. cryoloop에서 결정과 플래시-멋진 곳을 알아내는-막는으로 20% 글리세롤을 포함 된 저수지 솔루션을 사용 하 여 액체 질소에 탑재 합니다. 저장과 수송에 대 한 unipuck에 크리스탈을 놓습니다.
2. 전 단백질 결정 리가 사내 x 선 diffractor를 사용 하 여 화면. (우리의 데이터 집합 상해 싱크 로트 론 방사선 시설에서 BL17U1에서 수집 된) 싱크 로트 론 시설에서 데이터 컬렉션에 대 한 높은 해상도 함께 최고의 것 들을 선택 하십시오.
   1. BluIce²⁶ beamline 제어 소프트웨어를 사용 하 여 탑재 하 고 자동 또는 수동 중심 기능에 의해 결정 가운데. 시작 각도, 노출 시간, 검출기 거리, 프레임 너비와 숫자를 포함 하 여 데이터 수집 전략을 결정 하기 위해 테스트 노출 수행 합니다.
   2. 따라서 데이터 집합을 수집 (우리가 수집 1 s 노출 시간, 1 ° 프레임 폭 350 mm의 발견자 거리와 180 프레임).
3. 색인, 통합 및 HKL2000 스위트²⁷을 사용 하 여 데이터 집합을 확장. 먼저 찾을 회절 반점, 피크 검색 기능을 수행 하 고 관광 명소 다음 색인 오른쪽 공간 그룹을 선택 합니다. 피크 통합 후 적절 한 오류 모델과 데이터 집합을 확장 하 고 출력.sca 파일을 저장 합니다.
4. 분자 교체 피닉스²⁹페이저²⁸ 을 사용 하 여 위상 문제를 해결.
   1. Xtriage³⁰여 비대칭 단위에서 단백질 분자의 가능한 복사본 수를 계산 합니다.
   2. 문학 또는 Phyre2³¹ 같은 구조 예측 서버에 의해 생성 된 모델에서 알려진된 구조를 사용 하 여 대상 단백질으로 정체성과 구조적 유사성을 높은 시퀀스와 적절 한 구조 서식 파일에 대 한 보고 (토끼 RyR1 NTD 사용으로 검색 모델, PDB ID 2XOA).
   3. 페이저는 해결책을 찾기 위해 회절 데이터 파일, 서식 파일 구조 파일 및 단백질 시퀀스 파일을 사용 하 여 실행 합니다.
5. 빌드³² 피닉스²⁹ 페이저에서 출력 파일에서 대상 단백질 시퀀스 파일을 사용 하 여 초기 모델을 생성 하기 위해 수행 합니다.
6. 수동으로 쿳³³ 를 사용 하 여 수정 된 실험적인 전자 밀도에 구조를 구축 하 고 반복 되는 주기에서 phenix.refine³⁴ 를 사용 하 여 수정.
7. 피닉스¹⁸에서 유효성 검사 도구를 사용 하 여 최종 모델을 확인 합니다.

결과

정화

DBM RyR의 N 맨끝 도메인 TEV protease 분열 사이트, MBP 태그와 hexahistidine 태그 융합 단백질으로 표현 했다. 우리는 매우 순수한 단백질 결정 화 목적에 적합을 얻기 위해 5 단계 정화 전략을 따 랐 다. 처음에, 융해 단백질 Ni NTA 열 (HP HisTrap)에 의해 세포 lysate의 녹는 분수에서 순화 했다. 다음으로, TEV protease 분열 융해 단백질은 대?...

토론

이 문서에서 우리는 recombinantly 익스프레스, 정화, 구체화 및 DBM RyR NTD의 구조를 결정 하는 절차를 설명 합니다. 결정 화에 대 한 중요 한 요구 사항이 높은 용 해도, 순도와 균질 단백질을 얻을 것입니다. 우리의 프로토콜에서 우리는 hexahistidine 태그와 MBP, 둘 다 더 높은 배 순도를 정화에 대 한 활용 될 수 포함 되어 애완 동물-28a-HMT 벡터를 사용 하기로 결정 했다. 또한,는 MBP 태그 에이즈 대상 단백?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET-28a-HMT vector			This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)
E. coli BL21 (DE3) strain	Novagen	69450-3CN
HisTrapHP column (5 mL)	GE Healthcare	45-000-325
Amylose resin column	New England Biolabs	E8021S
Q Sepharose high-performance column	GE Healthcare	17-1154-01
Amicon concentrators (10 kDa MWCO)	Millipore	UFC901008
Superdex 200 26/600 gel-filtration column	GE Healthcare	28-9893-36
Automated liquid handling robotic system	Art Robbins Instruments	Gryphon
96 Well CrystalQuick	Greiner bio-one	82050-494
Uni-Puck	Molecular Dimensions	MD7-601
Mounted CryoLoop - 20 micron	Hampton Research	HR4-955
CryoWand	Molecular Dimensions	MD7-411
Puck dewar loading tool	Molecular Dimensions	MD7-607
Nano drop	Thermo Scientific	NanoDrop One
Crystal incubator	Molecular Dimensions	MD5-605
X-Ray diffractor	Rigaku	FRX
PCR machine	Eppendorf	Nexus GX2
Plasmid mini-prep kit	Qiagen	27104
Gel extraction kit	Qiagen	28704
SspI restriction endonuclease	NEB	R0132S
T4 DNA polymerase	Novagen	2868713
Kanamycin	Scientific Chemical	25389940
IPTG	Genview	367931
HEPES	Genview	7365459
β-mercaptoethanol	Genview	60242
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall LYNX 6000
Sonnicator	Scientz	II-D
Protein purification system	GE Healthcare	Akta Pure
Light microscope	Nikon	SMZ745
IzIt crystal dye	Hampton Research	HR4-710
Electrophoresis unit	Bio-Rad	1658005EDU
Shaker Incubator	Zhicheng	ZWYR-D2401
Index crystal screen	Hampton Research	HR2-144
Structure crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-01
ProPlex crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-38
PACT premier crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-29
JCSG-plus crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-37