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요약

자세한 프로토콜 분리, 식별 및 모 세관 지역 전기 이동 법-분무 이온화 탠덤 질량 분석 (CZE-ESI-MS/MS)를 사용 하 여 단백질 샘플에서 proteoforms의 특성에 대 한 설명 합니다. 프로토콜은 단순 단백질 샘플에서 proteoforms의 고해상도 특성화 및 복잡 한 프로테옴 샘플에서 proteoforms의 대규모 식별에 사용할 수 있습니다.

초록

모 세관 지역 전기 이동 법-분무 이온화 탠덤 질량 분석 (CZE-ESI-MS/MS) 복잡 한 proteomes에 proteoforms 하는 것을 목표로 내려 proteomics에 대 한 유용한 도구로 인정 받고 있습니다. 그러나, 대규모 내려 proteomics CZE-MS/MS의 응용 프로그램 낮은 샘플 로드 용량에 의해 장애가 되었습니다 고 분리 창 CZE의 좁은. 여기, 프로토콜 대규모 내려 proteomics microliter 규모 샘플 로드 볼륨과 90 분 분리 창 CZE-MS/MS를 사용 하 여 설명 합니다. CZE-MS/MS 플랫폼 기반으로 선형 polyacrylamide (LPA)-매우 낮은 electroosmotic 교류, 단백질 스태킹에 대 한 높은 효율으로 동적 pH 접합-기반 온라인 샘플 농도 방법으로 모 세관 코팅된 분리는 펌핑된 운동 전기 칼 흐름 CE MS 인터페이스 매우 높은 감도 높은 이온 트랩 질량 분석기 대량 해상도 스캔 속도. 플랫폼은 간단한 그대로 단백질 샘플의 고해상도 특성화 및 다양 한 복잡 한 proteomes에서 proteoforms의 대규모 특성에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 표준 단백질 혼합물의 고효율 분리 및 플랫폼을 사용 하 여 많은 불순물의 매우 민감한 검출은 설명 했다. 또 다른 예로,이 플랫폼은 500 proteoform를 생성할 수 있습니다 하 고 단일 CZE-MS/MS에는 대장균 의 프로테옴에서 190 단백질 식별 실행 합니다.

서문

탑-다운 proteomics (TDP) proteoforms는 프로테옴 내 대규모 특성에 대 한 목표로 한다. TDP에 높은 복잡성 때문에 분무 이온화 탠덤 질량 분석 (ESI-MS/MS) 분석 하기 전에 본래 단백질의 효과적인 액체 상 분리 및 프로테옴1,2의 큰 농도 동적 범위 사용 ,3,,45. 모 세관 지역 전기 이동 법 (CZE) 그들의 크기에 충전 비율6에 따라 생체의 분리에 대 한 강력한 기술입니다. CZE만 있는 오픈 관 융합 된 실리 카 모 세관, 배경 전해질 (BGE) 및 전원 공급 장치 요구는 상대적으로 간단 하다. 그대로 단백질의 샘플은 모 세관 압력 또는 전압를 사용 하 여 로드할 수 그리고 분리는 BGE에 모 세관의 양쪽 끝을 immersing 높은 전압을 적용 하 여 시작 됩니다. CZE 매우 높은 분리 효율을 접근할 수 있다 (> 1 백만 이론적 접시) 생체7의 분리에 대 한. CZE MS는 널리 사용 되는 반전 단계 액체 크로마토그래피 (RPLC) 보다 크게 높은 감도-그대로 단백질8의 분석에 대 한 MS. CZE MS 대규모 내려 proteomics에 대 한 큰 잠재력이 있다, 하지만 proteomics에 넓은 응용 프로그램 낮은 샘플 로드 용량, 좁은 분리 창 등 여러 문제로 장애가 되어 있다. CZE에 볼륨을 로드 하는 일반적인 샘플은 보통 100 미만 nL9,10,11에 해당 총 모 세관 볼륨의 약 1%입니다. CZE의 분리 창 일반적으로 강한 electroosmotic 교류 (EOF)9,10인 미만 30 분입니다. 이러한 문제는 CZE-MS/MS proteoforms 및 복잡 한 프로테옴에서 낮은 풍부한 proteoforms의 많은 수의 식별에 대 한 제한.

CZE 통해 온라인 샘플 농도 방법 (예를 들어, 고체 상 미 [SPME]12,13, 필드 강화 된 샘플 스택 [자 백]9 의 볼륨을 로드 하는 예제를 개선 하기 위해 많은 노력이 했다 , 11 , 14, 그리고 동적 pH 접속점15,16,,1718). 자 백 및 동적 pH 접합 SPME만 전도성 및 pH에 샘플 버퍼와는 BGE 사이의 중요 한 차이 요구 보다 간단 하 게 있습니다. 자 백 샘플 영역 및 모 세관에서 BGE 영역 사이 경계에 analytes의 스태킹 이끌어 BGE 보다 훨씬 더 낮은 전도도와 샘플 버퍼를 사용 합니다. 동적 pH 접합 기본적인 샘플 플러그인 (예, 50mm 염화 중 탄산염, pH 8) 샘플 플러그의 양쪽에는 산 성 BGE (예를 들어, [v] 5% 초 산, pH 2.4)을 활용합니다. 모 세관의 주입 후에 높은 긍정적인 전압의 응용 프로그램에 따라 기본적인 샘플 플러그인의 적정, CZE 분리를 겪고 전에 꽉 플러그에는 analytes을 집중 발생 합니다. 최근, 태양 그룹 체계적으로 비교 자 백 및 동적 pH 접합 그대로 단백질의 온라인 스태킹에 대 한 그 동적 pH 접합 그대로 단백질의 온라인 농도 대 한 자 백 보다 훨씬 더 나은 성능을 생산할 수 있는 시연 때 샘플 주입 볼륨 총 모 세관 볼륨19의 25% 이었다.

중립으로 코팅된 분리 모세 혈관 (예를 들어, 선형 polyacrylamide [LPA])을 줄이기 위해 감속 CZE 분리 하 고 분리 창20,21확대는 모 세관에서 EOF 고용 있다. 최근, Dovichi 그룹 개발, 모세 혈관의 내부 벽에 안정적인 LPA 코팅의 준비에 대 한 간단한 절차 암모늄 persulfate (AP)를 활용 하 여 시작자 및 자유 래 디 칼 생산 및 합22에 대 한 온도 (50 ℃) . 아주 최근에, 태양 그룹 고용 모 세관 LPA 코팅 분리 및 동적 pH 접합 방법 그대로 단백질, CZE 분리에 대 한 로드 볼륨 및 90 분 분리 창19microliter 규모 샘플에 도달. 이 CZE 시스템 대규모 내려 proteomics에 대 한 CZE-MS/MS를 사용 하 여 문을 엽니다.

CZE MS 몇 ms CZE 매우 강력 하 고 중요 한 인터페이스를 필요합니다. 3 CE MS 인터페이스 잘 개발 하 고 상용화 CE-MS의 역사에 있었고 그들은 co-칼 집 기류 인터페이스23, ESI 미터24, 다공성 팁을 사용 하 여 sheathless 인터페이스와 전기 접착 펌핑된 칼 집 인터페이스25,26흐름. 전기 접착 펌핑된 칼 집-흐름-인터페이스 기반 CZE-MS/MS는 낮은 zeptomole 펩 티 드의 탐지 한계9에 도달 했습니다, 그리고 10000 이상의 펩 티 드 식별 (Id)는 헬러에서14, 빠른 특성화를 실행 하는 단일에서 프로테옴 그대로 단백질11, 및 생체26의 매우 안정적이 고 재현 가능한 분석. 최근, LPA 코팅 분리 모 세관, 동적 pH 접합 방법 및 전기 접착 펌핑된 칼 흐름 인터페이스는 대장균 (대장균) 프로테옴19의 대규모 내려 proteomics에 사용 되었다 ,27. CZE-MS/MS 플랫폼 접근 500 proteoform Id19 고 거의 6000 proteoform Id를 통해 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)와 커플링을 실행 하는 단일-RPLC 분별 법27. 결과 명확 하 게 대규모 내려 proteomics CZE-MS/MS의 기능을 보여준다.

여기, CZE-MS/MS를 사용 하 여 대규모 내려 proteomics에 대 한 자세한 절차는 설명 되어 있습니다. CZE-MS/MS 시스템 사용을 줄이기 위해 모 세관, 단백질, ms, 한 orbitrap CZE 커플링에 대 한 펌핑된 운동 전기 칼 흐름 인터페이스의 온라인 농도 대 한 동적 pH 접합 방법에에서 EOF LPA 코팅 모 세관 질량 단백질, 및 proteoform ID 통해 데이터베이스 검색에 대 한 TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform 식별 및 특성화) 소프트웨어의 MS 및 MS/MS 스펙트럼의 컬렉션에 대 한 분석기.

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프로토콜

1. 분리 모 세관의 안 벽에 LPA 코팅의 준비

  1. 모 세관의 전처리
    1. 1 M 수산화 나트륨, 이온된 수, 1 M 염 산, 이온된 수, 및 LC MS 학년 메탄올 주사기 펌프를 사용 하 여 500 µ L로 연속적으로 용융 실리 카 모 세관 (내경 [아이디], [마약] 외경에서 360 µ m에에서 50 µ m, 길이 120cm) 플러시.
    2. 질소 가스 (≥ 12 h 10 psi) 모 세관을 건조 하 고 50% (v/v) 3-(trimethoxysilyl)는 모 세관 채우기는 주사기 펌프를 사용 하 여 메탄올에 틸 메타 크 릴 산. 실리 카 고무를 가진 모 세관의 양쪽 끝을 밀봉 하 고 24 시간 이상 실 온에서 품 어.
      참고:이 단계는 모 세관의 내벽은 기능성 c = C. 이상 보육 자세한 반응 더 나은 모 세관 코팅.
    3. Cleaving 돌과 양쪽 끝에서 모 세관의 작은 부분 (~ 5 m m)를 잘라. Unreacted 시 약을 정리 하는 주사기 펌프를 사용 하 여 메탄올 (500 µ L)으로 모 세관을 씻어. 건조 질소 가스 (10 psi, ≥12 h) 모 세관.
  2. LPA 코팅의 준비
    참고:이 절차 기반 주 외. 22 사소한 수정입니다.
    1. 아크릴 솔루션 (물의 1 mL에서 아크릴의 40 밀리 그램) 및 암모늄 persulfate (AP) 솔루션 (5% [w/v] 물에서)를 준비 합니다.
    2. APS 솔루션의 2-3 µ L 아크릴 솔루션, 소용돌이, 혼합물의 500 µ L을 추가 하 고 솔루션에는 산소를 제거 하 5 분에 대 한 질소 가스와 드.
    3. 진공을 사용 하 여 청소용된 모 세관으로 혼합물을 로드 하 고 실리 카 고무, 모 세관의 양쪽 끝을 밀봉 일 분 50 ° C에서 물 욕조에 그것을 품 어.
    4. Cleaving 돌과 양쪽 끝에서 모 세관의 작은 부분 (~ 5 m m)를 제거 합니다. 주사기 펌프를 사용 하 여 물 (200 µ L), 모 세관에서 unreacted 솔루션을 밀어.
      참고: 모 세관의 밀어 폴리머는 agarose 젤 같은 일관성 확인 하십시오. 더 이상 보육 단계 (45 ~ 50 분 최대) 더 나은 모 세관 코팅에 발생할 수 있습니다. 긴 반응 기간, 모 세관 차단 될 수 있습니다와 높은 압력 물으로 폴리머를 밀어 하는 데 필요한. HPLC 펌프는이 목적을 위해 사용할 수 있습니다.

2. 소산과 모 세관의 에칭

주의: 적절 한 안전 절차를 사용 하 여 화 수 소산 (HF) 솔루션을 처리 하는 동안. 모든 HF 관련 작업 화학 후드에서 할 필요가 있다. HF 관련 작업, 전에 2.5% 칼슘 글 루 콘 산 젤 노출의 경우 사용 하기 위해 사용할 수 있는지 확인 합니다. 이중 장갑 필요, 밖에 서 안으로 전형적인 니트 릴 장갑 및 무거운 네오프렌 장갑. 실험실 외 투 및 화학 안전 고글을 착용. HF 작업 후 유해 폐기물 액체와 고체를 별도 유지. 액체 HF 폐기물 폐기물 픽업 하기 전에 임시 저장을 위한 고 농도 수산화 나트륨 솔루션으로 즉시 무력화 해야 합니다. 단단한 HF 폐기물은 늘어서 두 개의 두꺼운 플라스틱 1 갤런 Ziploc 가방 뚜껑 플라스틱 용기에 일시적으로 저장 될 필요가 있다. 둘 다 고체와 액체 폐기물은 제대로 표시 해야 합니다.

  1. 굽기 부드러운 불꽃을 사용 하 여 모 세관의 부분 (예를 들어, 포켓 라이터) 제거는 구체의 외부 코팅 (길이 1 cm)는 모 세관의 한쪽 끝에서 약 4 cm를. 부드럽게 닦아 구체의 완전히 코팅을 제거 하 여 모 세관의 탄된 부분을 청소.
    참고: 진행 주의 모 세관의 부분으로 구체의 코팅 조금 약 해 없이.
  2. 이 구멍을 통해 스레드는 일단 충분히 장소에 모 세관을 잡아 모 세관 외부 직경으로 같은 크기 주위 200 µ L 튜브의 끝에 작은 구멍을 드릴 합니다. 스레드 때까지 튜브에 탄 부분은 구멍을 통해 탄된 부분에 가깝다 모 세관의 끝.
    참고: 그것은 깨지기 쉬운 모 세관의 탄된 부분으로 정확한 크기를 보장 하기 위해 탄된 부분에서 모 세관의 끝 구멍의 크기를 테스트 하 고 좋습니다.
  3. HF 솔루션에 대 한 중간 모 세관에 탄된 부분을 200 µ L 튜브를 HF (물에 48%-51% 솔루션)의 ~ 150 µ L를 추가 합니다. 90-100 분 동안 실 온에서 HF 솔루션에 모 세관을 품 어.
    참고: 다른 구멍은 튜브의 뚜껑에 만들어집니다 및 일부 작은 물체 (예를 들어, 작은 피 펫 팁)는 부 화 수행 하는 동안 튜브를 잡고 하는 것이 좋습니다. 피 펫 팁 펑크 거품 또는 일부 다른 견고한 플랫폼 반응 약 실에서 놀 수 있는 안전한 환경을 만들어 사용할 수 있습니다. HF 포함 된 튜브 아래 종이 수건 놓고 유출의 경우 적절 한 절차를 따라 합니다.
  4. 모 세관 튜브에서 제거 하 고 모든 잔여 HF 제거 하 이온된 물으로 외부를 씻어.
    참고: 탄된 부품의 좁은 부분에 모 세관의 외경 인지 확인 이제 100 µ m 보다 작은 있어야 합니다.
  5. 한쪽에서 마약에 100 미만 µ m와 분리 모 세관을 생성 하 cleaving 돌을 사용 하 여 가장 좁은 부분의 중간에서 모 세관의 에칭된 부분을 잘라. 1 m 분리 모 세관을 모 세관의 에칭 비 끝을 잘라.
    참고: 제도 정해진된 프로토콜에 따라 HF 폐기물의 처분.

3입니다. 샘플의 준비

  1. 표준 단백질 혼합물의 준비
    1. 시 토 크롬 c (Cyto.c, 12 kDa, 0.1 mg/mL), lysozyme (14.3 kDa, 0.1 mg/mL), β-카 세 인 (24 kDa, 0.4 mg/mL), myoglobin (16.9 kDa, 0.1 mg/mL), 탄산 탈수 (CA, 29 kDa, 0.5 mg/mL), 소 혈 청 알 부 민 (BSA, 66.5 kDa을 포함 하는 표준 단백질 혼합물을 준비 1.0 mg/mL) LC-MS에서 학년 재고 솔루션으로 물.
      참고: 재고 솔루션 aliquoted 및 사용-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
    2. CZE MS 분석에 대 한 LC MS 학년 물에 50 m m 염화 중 탄산염 해결책 (pH 8.0) 10의 요인에 의해 재고 솔루션을 희석.
      참고: (예를 들어, 셀 루 로스 질 산 막과 직경에서 50 mm의 0.2 µ m) 멤브레인 필터와 함께 사용 하기 전에 염화 중 탄산염 해결책을 필터링.
  2. 대장균 샘플의 준비
    1. OD600 값 0.7에 접근 될 때까지 225 rpm에서 흔들어 동안 37 ° C에서 파운드 매체에 문화 대장균 (K-12 MG1655) 세포. 대장균 세포를 통해원심 분리 (3,283 x g, 10 분)를 수집 하 고 인산 염 버퍼 염 분 제거 매체 (PBS)와 여러 번 그들을 씻어.
    2. 대장균 세포 세포의 용 해 버퍼 8 M 요소, protease 억제제, 그리고 100 m m 염화 중 탄산염 (pH 8.0)에서 일시 중지 하 고 완전 한 세포 세포의 용 해에 대 한 컵 경적 초음파 셀 방해를 사용 하 여 15 분 동안 얼음에 ultrasonicate.
      1. 50 듀티 사이클 (%)를 설정 하 고 초음파 세포 방해에 대 한 7 출력 제어 를 설정 합니다.
    3. 원심 lysate 18000 x g 10 분 수집에는 상쾌한 고 펠 릿을 삭제. 상쾌한의 작은 약 수를 사용 하 여 bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과 함께 단백질 농도 측정에 대 한.
      참고: 희석 lysate 필요 이상 우 레 아 농도 줄이기 위해 3의 요인에 의해 보다 낮은 3 M BCA 분석 결과와 호환 되려면. BCA 분석 결과 제조업체의 절차에 따라 수행 됩니다.
    4. 믹스 1 밀리 그램 찬 아세톤과 대장균 단백질의 볼륨 비율 1:4 및 유지-20 ° c 하룻밤 침전 단백질 혼합물의.
      참고: 모든 실험 화학 후드에 아세톤을 사용 하 여 수행 합니다.
    5. 침전 된 단백질 (12000 x g, 5 분) 아래로 회전 시키십시오 그리고 제거는 상쾌한. (동일한 볼륨 전에) 다시 찬 아세톤으로 펠 릿을 세척 하 고 다시 스핀 다운.
    6. 제거는 상쾌한 고 몇 분 동안 화학 후드에서 건조 하는 펠 릿.
      참고: 단백질 펠 릿을 overdry 하지 않습니다.
    7. 분해는 침전 된 100 m m 염화 중 탄산염 (pH 8.0)에서 8m 우 레 아의 200 µ L에서 대장균 단백질 (1 mg).
    8. 변성, 감소, 그리고 샘플을 알.
      1. 단백질 변성을 30 분 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.
      2. 샘플으로 1 M DTT 솔루션 (100 m m 염화 중 탄산염)에서 2 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 샘플을 배양 하 여 dithiothreitol (DTT)으로 줄일.
      3. 샘플 (100 m m 염화 중 탄산염)에서 1 M IAA 솔루션의 6 µ L을 추가 하 여 iodoacetamide (IAA)으로 단백질을 알 고 어둠 속에서 실 온에서 20 분에 대 한 샘플을 품 어.
      4. DTT와 초과 IAA 1 M DTT 솔루션의 2 µ L을 추가 하 여 담금질 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어. 포 름 산 (FA) 1% (v/v)의 최종 전 농도 얻으려면 샘플을 시 어 지 다.
        참고: 감소 및 알 다운스트림 조각화에 대 한 단백질의 전개를 돕기 위해 수행 됩니다. 이러한 단계는 이황화 결합의 정보를 잃게 됩니다. 목표에 단백질 이황화 결합을 공부 하는, 그 단계를 하지 마십시오. 화학 두건에 모든 집중된 산 성 솔루션을 처리 하도록 하십시오.
    9. HPLC 시스템 c 4 트랩 열 (예:아이디의 4mm, 3 µ m 입자 300 Å 모 데 포장 길이 10 m m)를 사용 하 여 샘플 desalt 254의 파장에 UV 검출기를 사용 하 여 검색에 대 한 nm.
      1. 모바일 단계 유량 1 mL/분 활성화를 열 설정 80% (v/v) 이기 (ACN), 0.1%로 홍 조 하 여 10 분 동안 물에서 FA 2% (v/v) ACN, 0.1%로 홍 조에 의해 equilibrate와 10 분 동안 물에 빠.
      2. 500 µ g 단백질은 열에 로드 하 고 2% (v/v) ACN, 0.1%로 내리는 의해 desalt 물 1 mL/min 흐름 속도로 10 분 동안에 FA.
      3. 80% (v/v) ACN, 0.1% 단백질을 elute 1 mL/min 흐름 속도로 3 분 물에 빠. eluate 수집 하 고 진공 집중으로 lyophilize.
        참고: c 4 트랩 열 desalt 대량의 단백질 하지만 가능한 샘플 손실로 인해 단백질의 하지 낮은 ㎍를 사용할 수 있습니다. 제한 된 단백질 재료 단백질 담 대 한 C4 미디어와 피 펫 팁을 사용 하 여 고려 하십시오. 샘플을 lyophilizing 때 단백질 overdry 조심 해야.
    10. CZE MS 실험을 위한 50mm 염화 중 탄산염 (pH 8.0)의 250 µ L에 단백질 (샘플 준비 하는 동안 샘플 손실 가정)의 500 µ g을 용 해.

4. 설정 CZE-MS/MS 시스템 및 샘플 분석

  1. CZE 시스템의 설정
    1. 5% 또는 10% (v/v) 초 산을 포함 하는 BGE 준비 (pH ~2.4 또는 ~ 2.2) LC-MS에서 학년 물. CZE autosampler의 버퍼 트레이와 일치 하는 BGE 유리병에는 BGE의 ~1.5 mL를 넣어.
      참고: 확인 신선한 BGE 모든 주 및 변경 BGE 솔루션 유리병에 매일 어떤 오염 든 지 피하기 위하여.
    2. 삽입 튜브를 샘플 솔루션 (5-200 µ L)를 추가 하 고 샘플 유리병 thatmatches CZE autosampler의 샘플 트레이와 삽입 튜브를 넣어.
    3. 샘플, BGE, 그리고 모 세관 분리 CZE autosampler 로드.
      참고: 한 특정 autosampler 사용을 반영 하는 가장 정확 하 게이 프로토콜에 사용 되는 언어 ( 재료의 표참조), 하지만 다른 autosamplers에 원칙을 적용할 수 있습니다.
      1. CZE autosampler의 수동 제어 페이지에서 샘플 로드 를 선택 합니다. BGE 유리병 버퍼 트레이에 위치 지적 autosampler의 버퍼 트레이 로드. 샘플 트레이에 위치 지적 autosampler의 샘플 쟁반으로 샘플 유리병을 로드 합니다.
        참고: 악기 수에서 동작할 수 수동 제어 장치 모니터 에 대 한 주요 악기 페이지 악기의 그림에 클릭 하 고 다음 수동으로 직접통제를 선택 하 여.
      2. 분리 모 세관 CZE autosampler, 모 세관의 에칭 비 끝을 사용 하 여 로드. 수동 제어를 사용 하 여 정렬 위치는 autosampler 넣어. 모 세관의 비 에칭 끝 잡고 분리 모 세관 물리적 스레드 수 없을 때까지 추가 하는 데 사용 되는 구멍에 스레드.
        참고:이 경우에, 모 세관의 끝은 거의에 전극의 끝으로 같은 높이 그리고 모 세관의 끝은 주입 동안 샘플에 몰입 되도록 샘플 유리병에 필요한 샘플의 적어도 50 µ L. 샘플 볼륨이 낮은 (즉, 5 µ L), 단계 4.1.3.2.1에서에서 설명한 대로 조정 모 세관 요구의 주입 끝의 높이.
        1. 샘플 볼륨은 50 µ L (즉, 5 µ L) 보다 낮은 경우 모 세관의 주입 끝의 높이 조정 합니다. autosampler 대기 수동 제어를 사용 하 여 전환 합니다. 시스템에서 샘플 위치를 입력 하 고 샘플을 모 세관을 이동. 모 세관 더 도달 샘플 유리병의 바닥 아래로 주입 끝을 밀어.
          참고:이 경우에, 샘플 주입 수행할 수 있습니다 유리병에만 5 µ L의 샘플.
      3. 수동 제어를 사용 하 여, 20 분, BGE 20 psi의 압력을 사용 하 여 함께 모 세관을 플러시를 계속.
  2. CZE MS 인터페이스의 설정
    1. 마약에 20-40 µ m의 구멍으로 두 명의 분무 미터에 붕 규 산 유리 모 세관 (마약, 아이디, 길이 10 m에서에서 0.75 m m에서에서 1 m m)를 당겨
      참고: 4-5 cm로 분무 미터의 길이 유지 하 고 필요한 경우 cleaving 돌과 그것을 잘라. 모든 유리의 처분 sharps 용기에 폐기물. 20-40 µ 도움말 설정을 아래와 같습니다. 498 하 열, 5 풀, 10 속도, 지연, 150 그리고 200 압력 설정. 사용 하기 전에 현미경으로는 미터의 크기를 확인 합니다. 필요한 경우 매개 변수를 약간 조정 합니다.
    2. 마운트 상업 전기 접착 펌핑된 칼 흐름 인터페이스 ( 재료의 표참조) 질량 분석기의 앞에. 칼 집 버퍼 저수지를 10% (v/v) 메탄올 및 0.2% (v/v) LC MS 학년 물에 FA 포함 하는 버퍼에 채워 넣어 라.
    3. 칼 집 버퍼를 통해 주사기와 압력을 수동으로 적용 하는 방법으로 인터페이스에 T 를 플러시. 스레드 1-m m-마약 끝 소매 튜브를 통해 분무 미터의 고 미터는 T통해 피팅의을 한 포트 연결. 단순히 플러시 T 수동으로 다시 칼 집 버퍼와이 미터를 채우기 위해 주사기.
    4. 미터 오리 피스와 인터페이스와 함께 제공 된 카메라의 도움으로 ~ 2 m m 질량 분석기 입구 사이의 거리를 조정 합니다. 분무의 칼 집 버퍼 유리병에 2 k-2.2 v 전압을 적용 합니다. 안정적인 분무 도달 스프레이 전압을 조정 합니다.
      참고: 아무 분무 또는 불안정 한 분무, 관찰 하는 경우 더 큰 거품 미터, T, 그리고 칼 집 버퍼 유리병 T를 연결 하는 데 사용 되는 튜브는 되도록 인터페이스를 확인 합니다. 미터 오리 피스와 질량 분석기 입구 사이의 거리는 미터의 1 mm 마약에 비교 하 여 대략 추정 될 수 있습니다. 스프레이 전압 미터의 크기에 따라 달라 집니다. 20-40 µ 미터, 2 2.2 kV은 충분히 좋다. 항상 높은 전압을 사용 하는 경우 조심 하도록 하십시오.
    5. 끄고 스프레이 전압을 더 밀어 수 없을 때까지 미터에 T 를 통해 모 세관 분리의 에칭된 끝을 부드럽게 스레드. 이 과정에서 모 세관에 있는 아무 거품 다는 것을 확인 하는 모 세관의 주입 후에 낮은 압력 (즉, 5 psi)를 적용.
      참고: 모 세관을 통해 T 에 연결 되어 슬리브 배관 및 피팅. 500 µ m 이내에 카메라의 도움으로이 미터에는 모 세관의 에칭된 끝의 위치를 조정 합니다. 거리는 미터의 1 mm 마약에 비교 하 여 대략 추정 될 수 있습니다.
    6. 모 세관의 주입 후에 낮은 압력을 중지 합니다. 칼 집 버퍼와 약간 미터를 플러시. 다시, 스프레이 테스트 스프레이 전압의 2 2.2 kV 적용 됩니다.
  3. 샘플 주입, 분리, 모 세관 홍 조, 및 데이터 수집을 위한 질량 분석기의 트리거링을 위한 CZE 방법의 설정
    1. 새로운 메서드를 시작 하는 주요 악기 화면에 파일 드롭 다운 메뉴에서 새 메서드 를 선택 합니다.
    2. 95로 0, 및 기간 으로 SV/EV, 샘플으로 트레이 , 압력 으로 5 psi, KV 로 입구 를 선택 샘플 주입에 대 한 s.
      참고: 샘플은 모 세관을 통해 압력으로 주입 됩니다. 샘플 주입 볼륨 Poiseuille의 법률을 사용 하 여 압력 및 주입 시간에 따라 계산할 수 있습니다. 95-s 샘플 주입에 대 한 5 psi 약 500에 해당 하는 예를 들어 1 m 길이의 분리 모 세관 (50 µ m 아이디)에 대 한 샘플 로드 볼륨의 nL.
    3. CZE 분리에 대 한 매개 변수를 선택 하 고 데이터 수집을 트리거링에 대 한 매개 변수를 설정 합니다.
      1. 4200으로 30, 및 기간 으로 인보이스, 버퍼 트레이 , 압력 0 psi로, KV 로 입구 를 설정 표준 단백질 혼합 샘플의 분리에 대 한 s. 6, 600으로 20, 및 기간 으로 인보이스, 버퍼 트레이 , 압력 0 psi로, KV 로 입구 를 설정 대장균 프로테옴 샘플의 분리에 대 한 s.
        참고: 분리에 대 한 적용 전압 조정할 수 있습니다 샘플 복잡성에 따라. 단순 단백질 샘플, 30 kV 분석을 빠르게 적용할 수 있습니다. 복잡 한 샘플, 20 kV 분리를 감속 하 고 취득 proteoform Id에 대 한 더 많은 MS/MS 스펙트럼에 적용 됩니다.
      2. 타임 이벤트에서 데이터 수집을 트리거링에 대 한 매개 변수를 설정 합니다. 1; 단계에서 활성화 시간 (s) 0.0 및 릴레이 1 종류 설정 2 단계에서 비활성화 에 대 한 1.0 및 릴레이 1 종류 시간 (s) 설정 합니다.
    4. 600으로 30, 및 기간 으로 인보이스, 버퍼 트레이 , 압력 10 psi로, KV 로 입구 를 선택 모 세관 홍 조에 대 한 s.
    5. CZE MS 및 MS/MS 실험 방법 파일을 저장 합니다.
  4. MS와 MS/MS의 설정
    1. 4 극 자 이온 함정 질량 분석기를 사용 하 여 그대로 단백질 분석에 대 한 MS와 MS/MS 매개 변수 설정 ( 재료의 표참조).
      참고: 긍정적인 이온 모드와 조각화에 대 한 높은 에너지 collisional 분리 (HCD) 채택 된다.
      1. 조정 파일 설정 조정: 그대로 단백질 모드 를 켜고, 0.2의 트랩핑 압력을 사용 하 여. 55 이온 전송 모 세관 온도 320 ° c와 s 렌즈 RF 레벨 설정 합니다.
      2. MS와 MS/MS 방법 파일을 빌드하십시오.
        1. 전체 MS 1E6, 50 ms 최대 주입 시간을 스캔 범위 600-2000 m/z3 microscans, 해상도 ( m/z 200)에서 240, 000, 자동 이득 제어 (AGC) 대상 값의 수를 설정 합니다.
      3. MS/MS, 전체 MS 스펙트럼에서 8 가장 강렬한 이온에 대 한 데이터 종속 수집 (DDA) 사용 합니다. 격리 창 4 m/z 와 정규화 collisional 에너지 (후부 터) 20%를 설정 합니다. 1 microscans, 해상도 ( m/z 200)에서 120, 000 번호, 1E5, AGC 대상 값 및 최대 주입 시간 200 ms을 설정 합니다.
      4. 1E5 조각화 트리거링을 위한 강도 임계값을 설정 하 고 조각화에 대 한 격리 5 보다 높은 충전 상태와 이온을 설정 합니다. 동위 원소를 제외 켜고 설정 동적 제외 30 s.
        참고: MS/MS에 대 한 microscans의 수는 3으로 늘릴 수 있습니다. 이 경우에, Top3 DDA 메서드 사이클 시간을 줄이기 위해 사용할 수 있습니다.
    2. CE autosampler와 데이터 수집의 자동 발생을 위한 질량 분 서 계 사이의 유선된 연결을 설정 합니다. 릴레이 1 접점 A 와 CE autosampler의 뒤에 1 접촉 B를 릴레이 하는 와이어의 한쪽 끝을 연결 합니다. 에 시작- 연결의 다른 쪽 끝을 연결 하 고 에서 시작 + 질량 분석기의 측면.
  5. CZE-MS/MS 실험 및 샘플 분석
    1. 적용 30 kV 샘플 주입 끝과 모 세관 분리 및 분무 테스트 하는 외부 전원 공급 장치를 사용 하 여 칼 집 버퍼 유리병에 2 2.2 kV CE 수동 제어를 사용 하 여.
      참고: 현재, 분리가 경우에, 주위는 8-9 µ A는 BGE로 5% (v/v) 초 산을 사용 하는 경우.
    2. 새 시퀀스를 선택 하 여 질량 분석기 컴퓨터에 데이터 수집 시퀀스를 설정 합니다.
      1. 알 수 없는 샘플 형식으로 선택한 파일 이름과 경로 지정 합니다. 계기 방법에서 실행 하는 각 샘플에 사용할 MS 메서드를 나타냅니다.
        참고: CE autosampler를 제어 하기 위한 별도 컴퓨터 이므로 샘플 위치 여기 지정할 수 필요 하지 않습니다.
    3. 버퍼 위치, 샘플 위치, CZE 메서드를 나타내는 CE 컴퓨터에 CZE 분리 순서를 설정 합니다. 새 시퀀스를 시작 하려면 주요 악기 페이지의 분석 드롭-다운 메뉴에서 시퀀스 를 선택 합니다.
    4. 데이터 수집 방법 질량 분석기 컴퓨터 처음 시작 시퀀스를 실행 (또는 단일 실행에 대 한 샘플 실행 )를 선택 하 여. 그런 다음 CE autosampler 컴퓨터에 CE 시퀀스를 시작 합니다.
      참고: 분리 전압 샘플 주입 후에, 신호 전송 됩니다 CE autosampler에서 데이터 수집을 트리거링을 위한 질량 분 서 계에. 현재 분리 동적 pH 접합 샘플 스택 인해 분리 하는 동안 처음에 줄일 것 이다. 그런 다음, 현재 점차적으로 복구합니다.

5. 데이터베이스 검색 TopPIC 소프트웨어와 함께 수집 된 Raw 파일의

  1. 데이터베이스 검색 전용 컴퓨터에 질량 분석기 컴퓨터에서 MS와 MS/MS 데이터를 포함 하 여.raw 파일을 전송 합니다.
    참고: 이러한.raw 파일 큰 하 고 빠른 데이터베이스 검색에 도달 하기 위해 강력한 컴퓨터가 필요 수 있습니다.
  2. 데이터베이스 검색 전용 컴퓨터에 ProteoWizard 및 TopPIC 제품군을 다운로드 합니다.
    참고: ProteoWizard 및 TopPIC는 오픈 소스 소프트웨어와 온라인 찾을 수 있습니다 (ProteoWizard: http://proteowizard.sourceforge.net; TopPIC 스위트: http://proteomics.informatics.iupui.e.,u/software/toppic/). UniProt 데이터베이스 데이터베이스 검색에 사용 되 고 UniProt 웹사이트에서 찾을 수 있습니다.
  3. Msconvert와.mzML 파일, ProteoWizard28에서 MS 파일 포맷 변환 도구에.raw 파일을 변환 합니다. Msconvert (MSConvertGUI.exe)의 GUI에서 찾아보기 버튼을 클릭 하 고.raw 파일을 변환할 선택. 출력 형식으로 mzML를 선택 하 고 기본값에서 다른 모든 옵션을 유지. GUI의 우측 하단에 시작 버튼을 클릭 합니다.
  4. TopPIC 스위트29에서 TopFD 도구와.msalign 파일을.mzML 파일을 변환 합니다.
    1. GUI의 TopFD (topfd_gui.exe), 파일 클릭 하 고 이전 단계에서 만든.mzML 파일을 선택 합니다. 매개 변수의 기본 값을 유지 하 고, 다음, GUI의 우측 하단에 시작 버튼을 클릭 합니다.
      참고: TopFD 전조와 조각 동위 클러스터 monoisotopic 질량으로 변환 하 고 비슷한 monoisotopic 질량 및 가까운 마이그레이션 시간 선구자 동위 클러스터를 결합 하 여 MS1 데이터에 가능한 proteoform 기능을 식별 합니다. 3 개의 파일 ms1.msalign 파일, ms2.msalign 파일 및.feature 파일을 포함 하 여 TopFD에서 생성 됩니다. Ms1.msalign 및 ms2.msalign 파일 MS1 및 MS/MS 스펙트럼의 deconvoluted monoisotopic 질량을 각각 포함 되어 있습니다. .Feature 파일 가능한 proteoform 기능을 포함.
  5. TopPIC 스위트30TopPIC (버전 1.1.3)와 데이터베이스 검색을 수행 합니다.
    1. TopPIC GUI (toppic_gui.exe)에서 데이터베이스 파일 을 클릭 하 고 검색에 대 한 적절 한 데이터베이스를 선택 합니다.
    2. 스펙트럼 파일 에 클릭 하 고 단계는 입력으로 5.4.1에서 생성 된 ms2.msalign 파일을 선택 합니다. MS1 기능 파일 을 선택 하 고 단계 5.4.1에서에서 생성 된.feature 파일을 선택 합니다.
    3. IAA 처리 때문 고정된 수정으로 시스테인 carbamidomethylation (C57)를 설정 합니다.
      참고: 텍스트 파일 또한 만들 수 있습니다 다양 한 고정 수정 텍스트 편집기로. 그런 다음, TopPIC GUI에서 고정된 수정 옆의 파일 단추를 사용 하 여 텍스트 파일을 선택할 수 있습니다.
    4. 미끼 데이터베이스 기능을 선택 하 고, 차단 설정에서 스펙트럼 수준옆에 있는 드롭 다운 메뉴에서 루즈벨트 (틀린 발견 비율)을 선택 합니다. Proteoform 수준에서 스펙트럼 수준 0.05에서 0.01는 루즈벨트 설정.
      참고: TopPIC는 결과 필터링에 대 한 여러 옵션을 제공 합니다: 스펙트럼 레벨 루즈벨트, 루즈벨트 proteoform 수준, 또는 둘 다. 루즈벨트는 대상 미끼 접근31에 따라 평가 됩니다.
    5. 생성 함수 15 오류 허용 오차 (ppm)를 설정 및 선택 취소를 남겨 주세요.
    6. 고급 매개 변수2 대량 교대의 최대 수에 대 한 드롭 다운 메뉴에서 선택 합니다. 최대 질량 이동 (다) 의 알 수 없는 수정 500 설정 검사 다른 모든 매개 변수는 기본값 두고 GUI의 오른쪽 하단에 시작 버튼을 클릭 합니다.
      참고: TopPIC 소프트웨어는 두 개의 결과 텍스트 파일을 생성합니다. 접미사는 파일. OUTPUT_TABLE 확인된 proteoform-스펙트럼 일치 (PrSMs), 및 접미사가 있는 것의 목록을 포함합니다. FORM_OUTPUT_TABLE 확인 된 proteoforms의 목록을 포함합니다. 각 PrSM에 대 한 소프트웨어 일치, 관찰된 조각화 패턴 일치 파편 이온에 일반적인 정보를 제공 하 고 검색 된 질량 이동.

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결과

그림 1 실험에 사용 된 동적 pH 접합-기반 CZE-ESI-MS 시스템의 다이어그램을 보여 줍니다. 기본 버퍼에서 샘플의 긴 플러그는 LPA 코팅 분리 모세는 산 성 BGE 가득에 주입 됩니다. 높은 전압을 적용 한 후 I 및 II, analytes 샘플 영역에 집중을 통해 동적 pH 접합 방법 있을 것입니다. CZE MS 시스템의 성능을 평가 하는 표준 단백질 혼합물 (시 토 크롬 c, lyso...

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토론

여기 우리는 간단한 단백질 샘플에서 proteoforms의 고해상도 특성 및 복잡 한 프로테옴 샘플에서 proteoforms의 대규모 식별 CZE-MS/MS를 사용 하 여 상세한 프로토콜을 제공 합니다. CZE-ESI-MS/MS 시스템의 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다. 프로토콜에는 4 개의 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 분리 모 세관의 안 벽에 높은-품질 LPA 코팅의 준비는 매우 중요 하다. LPA 코팅 분리 모 세?...

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공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

저자 친절 하 게 제공 대장균 세포 실험을 위한 미시간 주립 대학, 화학과에서 Heedeok 홍의 그룹을 감사 합니다. 저자 (L. Sun X. Liu)를 일반 의료 과학의 국립 연구소, 국립 보건원의 건강 (NIH) 그랜트 R01GM118470 (X. Liu)을 통해 부여 R01GM125991에서 지원을 감사합니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Fused silica capillaryPolymicro Technologies106815001750 µm i.d. 360 µm o.d.
Sodium hydroxide pelletsMacron Fine Chemicals7708-10Corrosive
LC-MS grade waterFisher ScientificW6-1
Hydrochloric acidFisher ScientificSA48-1Corrosive
MethanolFisher ScientificA456-4Toxic, Health Hazard
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylateSigma-AldrichM6514Moisture and heat sensitive
Hydrofluoric acidAcros Organics423805000Highy toxic
AcrylamideAcros Organics164855000Toxic, health hazard
Ammonium persulfateSigma-AldrichA3678Health hazard, Oxidizer
lysozymeSigma-AldrichL6876
Cytochrome CSigma-AldrichC7752
MyoglobinSigma-AldrichM1882
ß-caseinSgma-AldrichC6905
Carbonic anhydraseSigma-AldrichC3934
Bovine serum albuminSigma-AldrichA2153
UreaAlfa Aesar36428-36
DL-DithiothreitolSigma-AldrichD0632Health Hazard
IodoacetamideFisher ScientificAC122270250Health Hazard
Formic AcidFisher ScientificA117-50Corrosive, Health Hazard
C4 trap columnSepax Technologies110043-4001C3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long
AcetonitrileFisher ScientificA998SK-4Toxic, Oxidizer
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich1066-33-7
Nalgene rapid-flow filtersThermo Scientific126-00200.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter
E. coli cellsK-12 MG1655
Dulbecco's phosphate-buffered salineSigma-AldrichD8537
BCA assayThermo Scientific23250
AcetoneFisher ScientificA11-1
HPLC system for protein desaltingAgilient1260 Infinity II
Acetic AcidFisher ScientificA38-212
CE autosamplerCMP ScientificECE-001
Electro-kinetically pumped sheath flow interfaceCMP Scientific
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass SpectrometerThermo Fisher Scientific
Sutter flaming/brown micropipette pullerSutter InstrumentsP-1000
Ultrasonic cell disruptor for cell lysisBranson101063196Model S-250A
Vaccum concentratorThermo Fisher ScientificSPD131DDA-115

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