Polyethyleneimine 코팅 된 산화 철 나노 입자 작은 간섭 RNA의 세포에 배달 하는 수단으로 생체 외에서 그리고 Vivo에서

요약

Polyethyleneimine (페이)를 사용 하는 방법 설명-siRNA와 transfecting 세포에 대 한 superparamagnetic 산화 철 나노 입자를 코팅. 이러한 나노 입자 세포 생체 외에서 그리고 vivo에서 및 침묵 대상 유전자 발현을 효율적으로 siRNA를 제공할 수 있습니다.

초록

면역 반응 조절에 그들의 중요 한 역할 때문에 세포 지속적으로 집중적인 연구의 대상이 되고있다 하 고 자가 면역 질환, 동맥 경화, 암 등 여러 질환에 유망한 치료 대상 대표. 프로브; 대 식 세포 기능을 조작 하는 선택의 귀중 한 접근은 RNAi 중재 한 유전자 침묵 그러나, siRNA와 대 식 세포의 transfection 종종 기술적으로 도전으로 간주 하 고, 현재, 대 식 세포를 siRNA 전송에 전념 하는 몇 가지 방법론을 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 siRNA의 세포 타겟된 배달에 대 한 차량으로 polyethyleneimine 코팅 superparamagnetic 철 산화물 나노 입자 (페이-SPIONs)를 사용 하 여 프로토콜을 제시. PEI SPIONs 바인딩 및 Fe: siRNA 무게 비율에 도달 하면 4 완전히 siRNA를 콘 덴 싱의 고 위에 할 수 있다. 생체 외에서이러한 나노 수 효율적으로 제공 siRNA transfection에 대 한 최적의 복용량에서 손상 세포 생존 능력 없이 대 식 세포와 같은 RAW 264.7 세포 라인에 뿐만 아니라 기본 세포로 하 고, 궁극적으로, 그들은 유도 siRNA 중재 대상 유전자 침묵입니다. SiRNA transfection 생체 외에서 사용 되 고, 떨어져 페이 SPIONs 세포에서 vivo에서를 siRNA를 제공 하기 위한 유망한 도구 있습니다. 자기적 성질 및 유전자 침묵 능력의 결합된 기능에 비추어 체계적으로 관리 페이-스파이/siRNA 입자 뿐만 아니라 대 식 세포 기능 조절 뿐만 아니라 몇 군데를 추적 세포 활성화 예상 된다. 페이-SPIONs 대 식 세포를 siRNA 전달, 안전, 간단 하 고 효과적인 nonviral 플랫폼을 대표 하는 본질적으로, 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서.

서문

대 식 세포는 다른 금액에도 불구 하 고 모든 신체 조직에 배포 하는 타고 난 면역 세포의 유형입니다. 생산 함으로써 다양 한 cytokines 및 다른 중재자, 그들은 중요 한 역할을 재생 하는 미생물 병원 체 침입에 대 한 호스트 방어, 다음 부상, 조직 복구 및 조직의 항상성¹를 유지 하. 그들의 중요성 때문에 세포 지속적으로 집중적인 연구의 주제 되었습니다 합니다. 그러나, 유전자 조절 및 기능 연구에 있는 그것의 보급에도 불구 하 고 중재 하는 siRNA 유전자 침묵은 대 식 세포 때문에 성공 가능성이 이러한 셀-특히, 주 대 식 세포-는 종종 transfect 어렵다. 이 독성 연관 있는 세포 막 화학은 가장 잘 설립 transfection 접근 (예를 들면, 고분자와 지질)의 상대적으로 높은 수준의 관찰 작용 수 있다 또는 육체적으로 (예를 들어, electroporation 여 고 유전자 총) 교차 하는 그로 인하여 크게 줄이고 세포의 생존^2,3막 siRNA 분자를 방해 합니다. 또한, 대 식 세포는 전용된 phagocytes degradative 효소 풍부. 이러한 효소 siRNA, 유전자 특정 siRNA의 셀^3,4로 전달 하는 경우에 그 입을 효율성 약화의 무결성을 손상 수 있습니다. 따라서, 효과적인 macrophage 대상으로 siRNA 전달 시스템 납품⁴siRNA의 안정성과 무결성을 보호 하기 위해 필요 합니다.

역 기능 세포 개시와 자가 면역 질환, 동맥 경화, 고 암 같은 특정 일반적인 임상 질환의 진행에 연루는 점점 더 분명 하다. 이러한 이유로, 대 식 세포 기능을, 예를 들어, siRNA, 변조 치료 이러한 장애^5,,67에 대 한 매력적인 방법론으로 신흥 되었습니다. 많은 진행 했다, siRNA 기반 치료 전략의 주요 과제는 체계적으로 관리 siRNA와 대 식 세포, 따라서 원치 않는 부작용으로 이어질에 의해 부족 한 siRNA 통풍 관의 불 쌍 한 세포 특이성. 일반적으로 최적의 셀 선택도 부족 하 고 종종 오프 대상 부작용, 약물 로드 (NPs), 나노의 reticuloendothelial 시스템에 의해 점령 되 고 그들의 자발적인 성향 때문으로 이어질 무료 핵 산 치료제와 비교 수동 타겟팅 세포에 vivo에서, 최소한의 부작용⁸향상 된 치료 효능에 대 한 수 있도록 설계 될 수 있다. 현재 NPs RNA 분자의 배달에 대 한 탐험 등 무기 nanocarriers, 다양 한 리, 고분자⁹. 그 중 polyethyleneimine (페이), 양이온 고분자 바인딩 및 안정된 NPs로 집 광 하는 핵 산의 종류 용량^9,10를 제공 하는 가장 높은 RNA를 보여줍니다. 페이, 세포 막에 걸쳐 그들의 전송을 중재 및 그들의 세포내 방출 촉진 효소와 nonenzymatic 저하에서 핵 산을 보호 한다. 비록 처음 DNA 배달 시 약으로 도입, 페이 이후에 로컬 하나 siRNA 전달 vivo에서 또는 체계적으로^9,10매력적인 플랫폼으로 시연 했다.

Superparamagnetic 산화 철 나노 입자 (SPIONs) 생물의 약, 그들의 자기 특성, 생체 적합성, 생물학으로 중요 한 개체, 높은 표면 지역에 양 비율에 비해 크기 때문에 큰 약속을 보여왔다 고 쉽게 적응 표면 bioagent 첨부 파일¹¹. 예를 들어, 그들의 잠재적인 유틸리티 대조 대리인 및 대 식 세포에 의해 급속 한 통풍 관으로, 때문에 SPIONs 이미지 조직 대 식 세포¹²좋아하는 임상 도구로 떠오르고 있다. 문학에 대 한 캐리어로 SPIONs의 몇 가지 보고서가 포함 되어 동안 SPIONs 또한 광범위 하 게 연구 핵 산 배달 차량^11,13,,1415, 우리의 지식, 대 식 세포를 대상으로 siRNA 전달입니다. SPIONs에 의해 유전자 배달에 대 한 그들의 표면은 일반적으로 친수성 양이온 폴리머는 부정적으로 위탁 된 핵 산 정전 끌었다 고 수 곁의 층으로 입힌 다. 여기, 우리가 그 표면 낮은 분자-무게 (10 kDa), 분기 페이 (PEI SPIONs) 수정 됩니다 SPIONs을 합성 하는 방법을 제시. 이러한 자기 nanoplatforms 다음 셀에 siRNA 전송 수 있도록 페이-스파이/siRNA 복합물을 형성 하는 siRNA를 압축 하는 채택 된다. 우리 reticuloendothelial 시스템¹⁶의 세포에 의해 SPIONs의 자발적인 먹어서 그 이유, 바인딩의 강한 능력이 함께 하 고 페이 SPIONs를 siRNA에의 효율적인 전송에 적합 렌더링 응축 핵 산 페이, 여 대 식 세포입니다. 여기에 제시 된 데이터 지원으로 문화 뿐만 아니라 vivo에서세포에 페이 스파이/siRNA-중재 된 유전자 침묵의 타당성.

프로토콜

관련 된 동물 동물에 따라 수행한 모든 방법을 조심 하 고 동남 대학, 중국의 지침을 사용 하 여.

1입니다. 페이 SPIONs의 준비

1. 올레산 수정 SPIONs의 준비
   1. FeCl₃•6H₂O와 FeSO₄•7H₂O N₂의 보호 아래 물에 용 해.
      1. 비 커에 FeCl₃•6H₂O의 28 g와 FeSO₄•7H₂O 이온된 물 80 mL에 20 g을 추가 합니다. 유리 도관을 통해 물에 N₂ 를 소개 하 고 고체 물질 해산 했다 때까지 저 어.
      2. 반응 혼합물 암모니아 물 (28%)의 40 mL의 추가 의해 따라 800 rpm의 교 반 속도로 72 ° C에가 열. 5 분 동안 저 어.
   2. 위에서 언급 한 솔루션에 dropwise 올레산의 9 mL를 추가 하 고 3 h 72 ° C에서 그것을 저 어.
   3. 차가운 실내 온도 (RT) 결과 솔루션. 자력 분리를 통해 솔루션을 침전.
   4. SPIONs 3를 포함 하는 침전 물은 세척 절대 에틸 알코올로 x, N-헥 산 100 mL에 침전을 분산 하는 고.
2. 산 수정 dimercaptosuccinic SPIONs의 준비
   1. 올레산 (OA)의 800 밀리 그램을 추가-수정 SPIONs N-헥 산, 200 mL에 분산 및 dimercaptosuccinic 산 (DMSA)의 400 밀리 그램 60 ° c.에 물 욕조에 3 목 플라스 크에 아세톤, 200 mL에 분산
      참고: 이전 단계에서 얻은 OA 수정 스파이의 농도 결정 하기 위해 스파이 분산의 작은 볼륨 (예: 1 mL)을 받아, N-헥 산 volatilize와 무게 결과 분말.
   2. 1000 rpm으로 교 반 환류와 위에서 언급 한 솔루션에 dropwise triethylamine의 200 µ L를 추가 합니다.
   3. 5 h 교 반 및 환류, 후 자력 분리 하 여 검은 침전을 얻을.
   4. 균질 하거나 수산화를 사용 하 여 솔루션의 pH를 조정 하 여 이온을 제거 된 물에서 친수성 SPIONs를 분산.
3. 페이-SPIONs의 준비
   1. 기계적 교 반 2 h 1000 rpm에서 500 mL 3 목 플라스 크에서 페이 솔루션 (10 kDa)에 dropwise DMSA 수정 스파이 콜 로이드 솔루션을 추가 (승_철: W_페이 = 1:3).
      참고: 충전 및 페이 SPIONs의 크기 W W_페이Fe 의 비율에 따라 다릅니다. 승_철: W_페이 비율 1: 3의 합성 siRNA 전달에 적합 페이 SPIONs에 대 한 좋은 출발점이 될 수 있습니다.
   2. 100 kDa의 분자량 컷오프 및 15 mL;의 콘텐츠는 한 튜브에 결과 솔루션 추가 다음, 원심 분리기 5400 x g에서 10 분 때까지 나머지 솔루션은 1 mL. 이온된 수 볼륨 15 mL를 다시 만들고 10 위의 과정을 반복을 솔루션에 추가 최종 제품을 얻기 위해 x. 그런 다음, 솔루션 0.22 μ m 필터를 통해 필터링 하 고 4 ° c.에서 최종 제품을 저장
   3. Phenanthroline¹⁷를 사용 하 여 색도계 방법으로 페이-SPIONs의 Fe 농도 결정 합니다. 페이-SPIONs 1mg Fe/mL의 농도에 이온된 살 균 수 희석 및 4 ° c.에 그것을 저장합니다
   4. 10 μ 페이 스파이 솔루션 (1 mg Fe/mL)의 이온을 제거 된 물; 1 mL를 희석 그런 다음 동적 빛 산란 장치에 의해 유체역학 크기와 제타 잠재적인 테스트.
      참고:에 대 한의 범위에서 페이 SPIONs 준비 30-50 nm. 이 크기 범위에 siRNA 바인딩 및 세포질 통풍 관에 NP 크기의 효과 중요 하다 표시 되지 않습니다. 페이 SPIONs 베어링 평균 제타 잠재력 이상 +37 mV transfection, 복용량 범위에 유독 할 수 있다 그리고 세포 독성 분석 실험 안전을 보장 하기 위해 수행 되어야 합니다. 표면 충전 및 유체역학 크기는 나노 입자의 페이 콘텐츠를 조정 하 여 원하는 범위 내에서 제어할 수 있습니다.

2. 준비 및 페이-스파이/siRNA NPs의 Agarose 젤 전기 이동 법

1. SiRNA RNase 무료 20 μ M (0.26 μ g/μ)의 최종 농도를 물으로 희석.
2. 5 RNase 무료 microcentrifuge 튜브 0, 1, 2, 4, 및 8 개를 준비 합니다. 레이블을 다른 Fe: siRNA 무게 비율을 나타냅니다. 피펫으로 3 모든 튜브 (~0.8 μ g siRNA/튜브)에 siRNA 솔루션의 μ.
3. 3.2, 1.6, 0.8, 0을 추가 하 고 관에 페이-SPIONs의 형태로 Fe의 6.4 μ g 표시 0, 1, 2, 4, 및 8, 각각. 20 μ 각 튜브의 전체 샘플 볼륨을 유지. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 혼합.
4. 페이-스파이/siRNA 복잡 한 형성 수 있도록 30 분 RT에 혼합물을 품 어. 이 기간 동안 3 %agarose 젤 높은 순도 agarose로 확인 합니다.
   참고: 추가 페이-스파이/siRNA 단지 다른 Fe: siRNA 비율 (예를 들어, 5 또는 6) 준비 및 테스트 될 수 있습니다.
5. 6 x 5 μ 샘플 당 DNA 로딩 버퍼 1 μ를 추가 하 고 신중 하 게 혼합. 모든 샘플을 로드 하 고 bromophenol 블루 젤의 길이의 2/3까지 마이그레이션합니다 때까지 5 V/cm에서 전기 이동 법을 실행 합니다. Ethidium 평범한 사람 (EB) 15-20 분와 젤 얼룩.
   참고: 갓된 전기 이동 법 버퍼와 EB 솔루션 사용 되어야 한다.
6. 자외선 이미징 시스템에서 siRNA 밴드를 시각화 합니다. 페이-SPIONs와는 siRNA 양식 단지에 Fe: siRNA 비율을 확인 하 고, 그 결과, 무료 siRNA를 대표 하는 밴드는 저 능 아 또는 하지 감지.

3. transfection RAW264.7 세포에서 생체 외에서 의

1. DMEM을 사용 하 여 10 cm 접시에 문화 마우스 대 식 세포와 같은 RAW264.7 세포 완료 중간 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 100 U/mL 페니실린 5% CO₂ 배양 기에서 37 ° C에서 100 μ g/mL 스 당 당 합니다.
2. 한 전날 transfection, 세포에서 중간 발음 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (pH 7.4)와 함께 그들을 씻어. 10 cm 접시에 0.25 %trypsin 1 mL를 추가 합니다. 5% CO₂ 배양 기에서 37 ° C에서 약 5-10 분 RAW264.7 세포 trypsinize
3. 세포의 대부분은 (5-10 분) 후 분리 했으면 때 비활성화 된 트립 신을 접시 DMEM 완전 한 매체의 5 mL를 추가 합니다. 단일 셀에 셀 클러스터 분산을 위아래로 피펫으로.
4. 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 원심은 실시간 제거에서 3 분에 대 한 300 x g에는 상쾌한.
5. Resuspend 신선한 DMEM 완전 한 매체의 5 mL와 셀과 셀.
6. 접시 9 x 10⁴ 셀 당 완전 한 DMEM 매체의 2 mL와 함께 6 잘 플레이트에 고 약 24 시간 5% CO₂ 배양 기에서 37 ° C에서 품 어.
   참고: 서로 다른 크기의 접시를 사용 하는 경우 세포 transfection 시 80 %confluency 도달 되도록 상대 면적에 비례하여 도금된 셀 밀도 조정 합니다.
7. 셀 confluency 80% 이면 세포에서 매체를 제거 하 고 잘 당 DMEM 완전 한 매체의 1 mL와 함께 그것을 대체. 페이-스파이/siRNA 단지 준비 된 사용 (약 30 분)에 대 한 준비가 될 때까지 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
8. 페이-스파이/siRNA 단지 준비: 페이-스파이/siRNA 단지 transfection 실험에 필요한 금액을 계산. 1.5 mL RNase 무료 microcentrifuge 튜브, 주어진된 Fe: siRNA 비율로 siRNA와 페이-SPIONs의 적절 한 금액을 믹스. 예를 들어, 4의 Fe: siRNA 비율로 Fe의 100 µ g를 포함 하는 페이-스파이/siRNA NPs를 준비 하려면 추가 100 µ L (1 mg Fe/mL) 페이-SPIONs의 siRNA (0.26 μ g/μ)의 96 μ에는 micropipette 부드럽게 그것을 혼합 하 여 다음. 실시간에서 30 분 동안 품 어
   참고: 페이-스파이/siRNA 복잡 한 부수적 손해에 대 한 계정 총 최종 질량 초과 10%의 볼륨을 준비 합니다. 낮은 철: siRNA 비율는 siRNA 분자는 페이 SPIONs에 완전히 로드 된 및, 따라서, 적은 양의 페이 SPIONs 잠재적인 세포 독성을 최소화 하기 위해 사용할 수 있습니다에서 페이-스파이/siRNA 단지를 확인 합니다. Fe: siRNA 비율의 최적화에 대 한 파일럿 실험 (젤 지체 분석 결과)가 필요 합니다.
9. 인큐베이터 (단계 3.7)에서 6-잘 접시를 꺼내. 각 우물에 dropwise 페이-스파이/siRNA 복합물의 필요한 볼륨을 추가 하 고 동등한 배급을 보장 하기 위해 신중 하 게 접시에 소용돌이. 세포질 통풍 관 또는 유전자 최저 효율 (1-3 d)의 평가까지 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
   참고: ~ 15 μ g Fe/mL의 농도에서 페이-스파이/siRNA와 Transfecting 세포 잠재적인 세포 독성을 최소화 하면서 transfection 효율을 극대화할 수 있습니다.

4. 조직 배달 siRNA의 쥐 실험 관절염 세포

1. 특정 병원 체-무료 남성 Wistar 쥐 7 주 오래 된 얻을. 7 사용 전에 d 쥐를 길 들 하 고 충분 한 음식과 물을 함께 그들을 제공 합니다. 앞에서 설명한¹⁸로 쥐에서 보조 관절염 (AA)를 유도.
2. 페이-스파이/siRNA 단지 3.8 단계에서 설명한 대로 준비 합니다.
3. 페이-스파이/siRNA NPs (siRNA/kg의 0.3 m g)는 AA 쥐를 통해 꼬리 정 맥에 주사. 평가는 세포질 통풍 관을 통해, 예를 들어, cytometry, 조직 biodistribution 통해, 예를 들어, 이미징 시스템, 실시간 형광 또는 치료 효과에 따라, 예를 들어, 임상, 조직학, 방사선 원하는 시간에 분석¹⁸점.
   참고: 휴대 및 조직 biodistribution 연구, 치료 원하는 NPs;의 단일 주사와 쥐 치료 연구, 세 연속 주 동안 일주일에 x 테스트 1 nps 쥐를 주사.

결과

크기와 제타 페이-SPIONs이이 프로토콜을 사용 하 여 준비의 잠재력 29-48 nm의 범위에 있었다 (증가할수록 인덱스: 0.12-0.23) 및 30-48 mV, 각각. 그들은 분명 집계 없이 12 개월 동안 4 ° C에 물에서 안정 되어 있었다. 능력을 바인딩 그들의 siRNA를 평가 하려면 페이 SPIONs 다양 한 Fe: siRNA 무게 비율에 siRNA와 혼합 했다. 그림 1 는 Fe: siRNA 무게 비율에 도달 하면 4 ?...

토론

대 식 세포는 일반적으로 사용 되 nonviral 접근, electroporation, 양이온 리 등 지질 종에 의해 transfect 내 화물. 여기 우리 transfect siRNA와 대 식 세포를 안정적이 고 효율적인 방법을 설명 합니다. 현재 프로토콜을 사용 하 여, 이상 대 식 세포와 같은 RAW 264.7 세포 (그림 2B)와 쥐 복 막 대 식 세포¹⁸ 의 90% 수 수 페 세포 생존 능력의 중요 한 장애 없이 siRNA와. 이 메서?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	C11995500BT	Warm in 37°C water bath before use
Fetal bovine serum	Gibco	A31608-02
Penicillin/streptomycin (1.5 ml)	Gibco	15140122
Tetrazolium-based MTS assay kit	Promega	G3582	For cytotoxicity analysis
RAW 264.7 cell line	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China	TCM13
Tissue culture plates (6-well)	Corning	3516
Tissue culture dishes (10 cm)	Corning	430167
RNase-free tubes (1.5 ml)	AXYGEN	MCT-150-C
Centrifuge tubes (15 ml)	Corning	430791
Trypsin	Gibco	25200-056
Wistar rats	Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences
Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder	National Institutes for Food and Drug Control, China		for inducing adjuvant arthritis in rats
siRNA	GenePharma (Shanghai, China)
Cy3-siRNA	RiboBio (Guangzhou, China)
Polyethyleneimine (10 kDa)	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	E107079
Ammonia water	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	A112077
Oleic acid	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	O108484
Dimethylsulfoxide	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	D103272
FeSO4•7H2O	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10012118
FeCl3•6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10011918
Dimercaptosuccinic acid	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	D107254
ultrafiltration tube	Millipore	UFC910096
Tetramethylammonium hydroxide solution	Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.	T100882
Particle size and zeta potential analyzer	Malvern, England	Nano ZS90