형광 현미경과 초음파 자극에 초점을 맞춘 멀티플렉싱

요약

낮은-강도 펄스 초음파 자극 (LIPUS)은 높은 공간 및 시간적 해상도 생 또는 조작 셀의 비-침략 적 기계적 자극에 대 한 양식 적임 이다. 이 문서는 피 형광 현미경 LIPUS를 구현 하는 방법 및 원치 않는 기계적 유물을 방지 하기 위해 초음파 경로 따라 음향 임피던스 불일치를 최소화 하는 방법에 설명 합니다.

초록

집중 함으로써 부드러운 조직에 침투 하는 저 강도 초음파 펄스, LIPUS 원격으로 그리고 안전 하 게 신경 발포, 호르몬 분 비 및 유전으로 재설정 셀을 조작 하는 유망한 생물 의학 기술을 나타냅니다. 그러나,에 의해 의료 응용 프로그램에 대 한이 기술의 번역 방해 현재는 생물 메커니즘의 부족 및 대상 조직 감각 LIPUS에 응답. 이러한 메커니즘을 식별 하는 적당 한 접근 LIPUS와 함께에서 광학 바이오 센서를 사용 하 여 기본 신호 경로 결정 하는 것입니다. 그러나, LIPUS를 구현 하는 형광 현미경에 물리적 인터페이스를 반영 하 고, 흡수 하 고 청각 파의 굴절의 존재로 인해 원치 않는 기계적 유물을 발생할 수 있습니다. 이 문서 음향 경로 따라 물리적 인터페이스의 영향을 최소화 하면서 상용 직 립 피 형광 현미경에 LIPUS를 통합 하는 단계별 절차를 제공 합니다. 단일 요소 초음파 트랜스듀서를 운영 하 고 객관적인 초점으로 변환기의 초점 영역을가지고 간단한 절차를 설명 합니다. LIPUS 사용 하 여 칼슘 이미징 사용 하 여 측정 하는 교양된 인간 세포종 세포에서 칼슘 LIPUS 유도 과도의 예를 보여 줍니다.

서문

많은 질병 침략 적 의료 개입의 일종이 필요합니다. 이 절차는 자주 비싼, 위험, 회복 기간을 필요로 하 고 따라서 의료 시스템에 부담을 추가 합니다. 비-침략 적 치료 modalities 기존의 수술을 안전 하 고 더 싼 대안을 제공 하 가능성이 있다. 그러나, 현재 비-침략 적 접근 pharmacotherapy 또는 transcranial 자석 자극 등 종종 조직 침투, spatiotemporal 해상도 및 원치 않는 오프 대상 효과 간에 의해 제한 됩니다. 이러한 맥락에서 집중 된 초음파 구성 하는 생물 학적 기능을 조작 하는 잠재력을 가진 유망한 비-침략 적 기술 제한 대상에서 효과 높은 spatiotemporal 정확도와 조직 깊숙한.

집중 된 초음파 자극 정확한 위치에서 음향 에너지를 제공 구성 생물 깊숙한. 음향 펄스 매개 변수에 따라이 에너지는 다양 한 의료 사용을 할 수 있습니다. 예를 들어, 식품 및 의약품 안전 청은의 사용을 승인 고 강도 집중 초음파 (장내) 전립선 종양, 뇌 영역 떨림 발생, 자 궁 fibroids 및 통증을 일으키는 뼈 전이^{1 신경 엔딩의 열 제거에 대 한} . 장내 중재 microbubble 현상 또한 체계적으로 관리 치료²의 대상된 배달에 대 한 혈액-뇌 장벽 정도 여는 데 사용 됩니다. 공간-피크 펄스 평균 강도 (내가_sppa)와 공간-피크 시간 평균 강도 (내가_spta) 장내 응용 프로그램은 일반적으로 몇 kW cm^-2 위 및 펄스 압력 MPa의 몇몇 10의 생산에 사용. 이러한 강도 값은 멀리 위에 FDA 승인 난_sppa 고_spta 진단 초음파, 190 W c m^-2 720 mW cm^-2,³각각에 대 한 제한. 반면, 최근 연구 또는 진단 초음파 강도 한계 (LIPUS)의 범위에 가까운 수 수 효과적으로 그리고 안전 하 게 원격으로 조작 신경 발사^{4는 그 비 파괴적인 펄스 초음파 자극 5,6,7,8}, 호르몬 분 비^9,10 및 bioengineered 세포¹¹. 그러나, 세포질이 고 분자 기계 장치는 셀 감지 및 초음파에 응답 유지 불분명, LIPUS의 임상 번역 제외. 따라서, 지난 몇 년 동안, 인공 막, 배양된 세포 및 동물 초음파 자극된의 연구 생물을 기세를 얻고 있다 및 생리 적 프로세스 LIPUS^{12,13, 변조 , 1415}.

물리적 매체를 통해 전파 진동 소리에 의하여 이루어져 있다. 초음파는 이상 인간의 가청 범위 (즉, 20 k h z) 주파수를 가진 소리 이다. 실험실 환경에서 초음파 파도 일반적으로 특정 높은 주파수 대역폭에서 진동 전기 필드에 대 한 응답에서 진동 하는 물자를 포함 하는 압 전 트랜스듀서에 의해 생산 됩니다. 변환기의 두 가지 유형의 존재: 요소 변환기 및 변환기 배열. 단일 요소 압 전 트랜스듀서는 초점 렌즈 역할을 하며 따라서 음향 에너지를 집중 하 고 초점 영역 이라고 정의 된 지역으로 곡선된 표면 소유. 단일 요소 변환기는 훨씬 저렴 하 고 변환기 배열 보다 운영 하기가 있습니다. 이 문서는 단일 요소 변환기에 집중할 것 이다.

집중 된 단일 요소 변환기의 초점 영역의 크기에는 음향 주파수와 음향 렌즈의 기하학적 속성에 따라 달라 집니다. 단일 요소 변환기와 밀리미터 크기 초점 영역을 달성 하기 위해 초음파 주파수 MHz 범위에는 일반적으로 필요 합니다. 불행 하 게도, 같은 주파수에서 청각 파 공기 같은 얇은 매체에 전파 될 때 감쇠 매우 빠르게 있습니다. 따라서, MHz 초음파 파도 생성 하 고 물과 같은 농도 자료 샘플을 전파 해야 합니다. 이 구성 LIPUS 적임 현미경에 통합에 첫 도전 합니다.

두 번째 도전은 다른 음향 임피던스 (재료 밀도 및 음향 속도의 제품에는) 음향 경로 재료 사이의 물리적 인터페이스를 최소화 하는 것 이다. 이러한 인터페이스 수 반영, 굴절, 분산 하 고 샘플을 효과적으로 전달 하는 음향 에너지의 양을 계량 하 고 어려운 청각 파 흡수. 그들은 또한 원치 않는 기계 공예품을 만들 수 있습니다. 예를 들어, 반사 생산된 음향에 수직 불일치 임피던스 인터페이스는 backpropagating 파도 앞으로 전파 하는 것을 방해 하는 만듭니다. 간섭 경로 따라 파도 취소 서로 노드 및 안티 노드, 지역 교류에서 합계 라는 공간의 고정된 지역에서 소위 서 파도 (그림 1)를 만들어. 그것을 제어 하거나 이러한 실험적인 인터페이스 시험관 에 비보없을 수 있습니다 제거 수 experimentalist에 대 한 중요 하다.

형광 측정 광 기자 들의 투명 한 생물 학적 샘플 없이 실제 소요와 실시간으로 잘 알려진 방법입니다. 이 접근은 따라서 어떤 물리적 프로브 sonicated 지역에 기계적 유물 소개로 LIPUS 연구에 이상적입니다. 이 프로토콜 구현 및 상업 epi-형광 현미경 LIPUS의 운영에 설명합니다.

프로토콜

1. 성장 어쿠스틱 투명 한 폴리에스터 필름에 셀

1. 수직 프레스-드릴을 사용 하 여 표준 35mm 문화 접시의 하단에 12 m m 구멍 크기를 드릴. 드릴을 천천히 이동 하 고 눈 보호를 착용. (그림 2) 외부 면에 매끄러운 표면을 만들려고 블레이드를 사용 하 여 접시의 바닥에 연결 된 플라스틱의 조각을 제거 합니다.
2. 해양 학년 에폭시 또는 접시의 외부 바닥 표면에 접착제의 얇은 층을 적용 합니다.
3. 접시의 외부 바닥 표면에 대 한 폴 리 에스테 (2.5 µ m 두께)의 영화를 놓고 에폭시/접착제 필름과 두꺼운 플라스틱 표면 사이 균등 하 게 확산 되도록 단단히 누르십시오. 평평한 표면 (그림 2)를 만들 손가락으로 원심 방식으로 영화를 가볍게 당깁니다.
4. 에폭시/접착제는 건조 때 짧게 린스 드라이 폴리에스터-아래 95% 에탄올과 접시와 접시 및 내부 배치 하 여 소독 강한 254 nm 자외선 여기 소스 아래 그것의 뚜껑의 표면. 기간 및 약 330 mJ cm^-2 미생물의 대부분의 종류의 완전 한 파괴에 대 한의 UV 복용량을 제공 하는 강도 조정 합니다. 이 에너지는 약 1000 µW cm^-2 자외선 조명을 사용 하 여 5 분의 기간에 해당 합니다.
5. Aliquot 상용 세포 외 기질 단백질 혼합물 (EMPM) 작은 튜브 (50-100 µ L)에 게 메 마른 조건에서 더 적은 또는-20 ° C에서 그들.
6. (예를 들어, biosafety 캐비닛 안에) 무 균 환경에서 1: 100 원하는 문화 매체와 냉동된 EMPM 재고 희석. 실 온에서 EMPM 중 합을 방지 하기 위해 얼음에서 작동 합니다. 폴리에스터 필름에 중간 혼합물의 100 µ L는 신속 하 게 적용 됩니다. 불 임을 유지 하기 위해 접시에 다시 뚜껑을 놓습니다.
7. 셀 문화 공동₂ 인큐베이터에서 37 ° C에서 6-12 h EMPM 코팅 폴리에스터 하단 요리를 품 어.
8. 부 화, 이후 초과 중간 발음 하 고 직접 원하는 밀도에 세포 표면 씨앗. 불 임을 유지 하기 위해 무 균 조건 하에서 작동 합니다.

2. LIPUS 구현

1. 전송 경로에 큰 작업 볼륨 및 조명 하드웨어 없이 직 립 현미경의 목표 아래 물 탱크를 배치 합니다.
2. 상용 optomechanical 구성 요소를 사용 하 여 목표 아래 샘플 홀더 및 변환기 홀더 샘플 홀더 아래 놓습니다. 다음 샘플 검색 및 초음파 정렬에 대 한 번역 단계에서 이러한 두 홀더를 탑재 합니다.
   1. 탱크 외부 또는 물 손상을 방지 하기 위해 물 라인 위에 움직이는 부품 및 액추에이터의 번역 단계를 놓습니다. 만 포장 되어 optomechanical 구성 요소에 대 한 양극 처리 한 알루미늄 또는 스테인레스 스틸 등 비 부식성 재료를 사용 합니다.
3. 침수 변환기를 이용 하기 전에 이온 및 degassed 물으로 탱크를 채우십시오. 물 라인 샘플 홀더 (그림 3)의 수평 비행기와 일치 한다.
   참고: 이온된 수 높은 전기 분야의 존재에 전기 연결을 방지합니다. 산란 그리고 청각 파의 변경 degassing 또한 막을 것 이다. 변환기의 위치 떨어지면 수 선 하는 펌프 나 밸브를 사용 하 여 각 실험 후 물 드레인. 또한, 교체 또는 자주 물을 필터와 청소 물 탱크 미생물의 성장을 방지 하는 데 필요한.

3. 간접 음향 여기

1. 상용 optomechanical 구성 요소를 사용 하 여 광학 경로 대해 비스듬한 위치에서 변환기를 방향을 정하십시오. 이렇게 하면 어떤 반영 파도 (그림 3 및 그림 4) 샘플에서 지시 될 것 이다.

4. 드라이브 변환기

참고: 초음파 트랜스듀서 압 전 재료의 기계적 확장/수축으로 진동 전기 에너지를 변환합니다. 이 변환 열 에너지의 형태로 에너지 손실을 생성합니다. 따라서, 변환기는 피크 입력된 전압 제한 가지고지 않습니다, 하는 동안 그들은 또한 압 전 요소에 열 손상을 방지 하는 전력 제한 보유:

의무 주기 전기 시뮬레이션, P (에서 와트) 전력의 시간의 상대적인 비율 V_rms 입력된 루트-의미-스퀘어 전압 (볼트)에 다른 전압 소스 및 Z 는 전기의 임피던스 (옴).

V_pp 변환기에 적용 피크 대 피크 입력된 전압으로

1. 원하는 주파수, 펄스, 초당 사이클의 수를 포함 하는 사인파 형태로 만들고 상업 함수 발생기를 사용 하 여 반복 주파수 펄스. 그러나, 효과적으로 종종 표준 초음파 트랜스듀서를 구동 하는 데 필요한 상대적으로 높은 Vpp 함수 발생기의 출력 (즉, V_pp의 진폭 증가)를 증폭 하는 전력 증폭기의 추가 요구 한다.
   참고: 예를 들어 변환기의 제조업체 나타냅니다 전력 제한 주어진된 트랜스듀서는 35 W. 것 이다 사인 곡선 피크-피크 입력 전압 (V에_에서) 500 mV 의무에 50%의 고 50 dB를 통해 증폭/100 W 앰프가이 변환기의 전력 제한 내?
   1. 이 질문에 대답 하려면 확대 후 전압을 계산 합니다. 무선 주파수 (RF) 전력 증폭기 증폭 요소 (dB)으로 정의 됩니다.
      
      따라서, 증폭된 전압 진폭 출력 V_pp 는 (V_{pp 밖으로}V =)의:
      방정식 1과 2를 사용 하 고 전기 임피던스 50 Ω를 사용 하 여,이 전압에 의해 생성 된 해당 전원이입니다.
      
      이 자극은 그러므로 제한 내에 전력 변환기의.
   2. 위의 예제를 사용 하 여 해당 전원 및 전압 제한 변환기의 제조업체에서 제공 하는 파형 파라미터 (Vpp, 주파수, 펄스 기간 및 펄스 반복 주파수)를 계산 합니다. 변환기 및 다른 연결 된 계측기의 손상을 방지 하려면 이러한 한계를 존중 하는 있는지 확인 합니다.
2. 초음파 트랜스듀서와 호환 되는 주파수 범위 내에서 작동 하는 함수 발생기를 선택 합니다. 공칭 피크 주파수 변환기의 함수 발생기의 주파수를 조정 합니다.
3. 원하는 기간 및 함수 발생기의 버스트 모드를 사용 하 여 반복 주파수의 정현파 전압 펄스를 만듭니다. 피크 대 피크 전압 원하는 값을 조정 합니다. 펄스 기간 보다 짧습니다 2 연속 펄스 사이의 경과 시간 다는 것을 확인 하십시오.
4. 파형을 오실로스코프의 입력 함수 발생기의 출력을 연결 하 여 원하는 신호에 해당 함을 확인 하십시오.
5. 함수 발생기의 출력 전력 RF 증폭기 (그림 4)의 입력에 연결 합니다. 자극 매개 변수 변환기의 제조 업체의 한계 내에 있는지 확인 합니다.

5. 빔 정렬

1. 초음파 변환기의 강도 주파수 범위와 음향 강도 주파수와 호환와 작동 하는 고래의 선택 하십시오.
2. 샘플 (그림 4)의 위치에 해당 위치에서 객관적인 시야 내에서 초점으로 고래의 프로브 팁을가지고 신중 하 게.
3. 프로브 및 변환기 이온 및 degassed 물에 몰입 하는 것을 확인 하십시오. 이 코팅을 변경 하 고 측정에 영향을 미칠 것입니다 물 이외의 어떤 물리적 개체와 고래의 끝을 범프 하지 않습니다.
4. 시각적으로 고래의 프로브 향해 음향 축을 배치 하 여 변환기의 총 사전 정렬을 수행 합니다. 변환기의 표면와 고래의 끝 사이 거리 약 변환기의 초점 거리에 해당 합니다.
5. 고래의 오실로스코프의 신호 입력 중 하나에 출력을 연결 합니다. 다른 오실로스코프 입력 함수 발생기에서 동기화 트리거를 연결 합니다. 오실로스코프에 동시에 두 신호를 시각화 합니다.
6. 드라이브는 낮은 듀티 사이클 및 프로브 손상을 방지 하려면 낮은 진폭에 몇 초음파 사이클 변환기. 고래의 팁의 손상을 방지 하려면 고래의 제조 업체 안전한 작업 조건을 확인 하십시오.
7. S/부 손잡이에 고래의 초음파 변환기의 표면에서의 여행 시간에 따라 조정 합니다. 동기화 트리거 후 오실로스코프에 고래의 신호를 찾고 있습니다.
8. 천천히 작용 전동 또는 수동 XYZ 단계를 사용 하 여 변환기. 최대한 고래의 신호 (그림 4)와 연결 하는 위치에 변환기를 둡니다.
   참고: 신호는 인식 가능 하다 음향 펄스의 강도 너무 낮은 또는 광속은 잘못 또는 개체에 의해 흩어져. 고래 및 변환기는 시각적으로 미리 정렬 하 고 거품 또는 물리적 개체는 폴리에스터 필름을 제외 하 고 경로 정기적으로 확인 합니다. 신호가 감지 되 면 여전히, 고래의 신호 진폭을 증가 하는 작은 금액으로 입력된 전압을 증가.

6. 초음파 펄스 압력 및 강도 결정

1. 빔 정렬와 함께 다양 한 전압 변환기 운전 오실로스코프에서 고래의의 피크-피크 진폭을 측정 합니다. 고래의 제조업체에서 권장 하는 압력 한계를 초과 하지 않도록 확인 합니다.
2. 이러한 측정 압력 및 고래의 제조업체에서 제공 하는 보정 메서드를 사용 하 여 음향 강도 값으로 변환 합니다.
   참고: 음향 강도 수식을 사용 하 여 압력 그리고 반대에서 결정 될 수 있다:
   
   내가 (에 W m^-2), 음향 압력으로 P (Pa)에서 음향 압력 자료 (1000 k g m^-3 물에 대 한) 및 c 전파 매체에 소리의 속도 전파의 밀도 ρ (물, c = 1500 m s^-1).
3. 이러한 측정을 사용 하 여 보정 곡선을 만듭니다.
   참고: 압력 대 전압 및 강도 대 전압 곡선 선형과 포물선 모양, 각각 있다.
4. 해당 보정 곡선을 사용 하 여 원하는 운전 전압의 압력 또는 강도 값을 결정 합니다.

7. 칼슘-민감한/LIPUS 라이브 셀 형광 이미징

1. 셀 permeant 칼슘에 민감한 염료의 5 µ M를 포함 하는 원하는 이미지 버퍼에 셀의 문화 매체를 바꿉니다 (예를 들어, Fluo-4 오전). 1 시간에 대 한 37 ° C에서 CO₂ 인큐베이터에서 문화 접시를 품 어.
2. 신중 하 게 씻어 염료의 무료 동일한 버퍼와 셀.
3. 샘플 홀더에 접시를 놓습니다. 블루 빛 조명을 사용 하 여 셀을 자극 (490 nm) 여기 강도와 카메라 노출 과도 한 표백 또는 픽셀 채도 피하기 위해 조정.
4. 시간 경과 영상 원하는 이미지 수집 설정을 사용 하 여 수행 합니다. ( 그림 4참조) 원치 않는 반사를 줄이기 위해 집중 목표 더 나은 이미지 품질 및 긴 작동 거리와 함께 사용 합니다.

결과

그림 5 LIPUS 실험 칼슘 영상과 다중화의 예입니다. 세포종 세포 (A-172) 했다 EMPM 코팅 폴리에스터 필름에 (10% 세럼과 1% 항생제로 보충) 표준 문화 매체에 성장과 칼슘-민감한 형광 기자 Fluo-4와 incubated 오전. 셀은 10 배 집중 렌즈를 사용 하 여 백색 LED 광원으로 조명 그리고 몇 군데와 형광 빛 표준 GFP 필터 세트를 사용 하 여 수집 되었다. LIPUS 158 V 피크 대...

토론

집중 된 초음파의 주요 장점은 비 접촉 spatio 시간적 고정밀 생물학 견본에 기계적 또는 열 에너지를 전달 하는 기능입니다. 기계적으로 자극 하기 위한 다른 기술을 일반적으로 고용 침략 물리적 프로브 (예를 들어, 셀 파고) 세포 또는 외국 개체 (예: 광학 족집게)와 높은 에너지 레이저 광선의 상호 작용을 요구 한다. 마그네틱 난방 생물 학적 샘플 내부 특정 공간 위치를 열 수 있습?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
upright microscope with large working volume	Thorlabs	CERNA
upright microscope with large working volume	Scientifica	SliceScope
optomechanical components	Thorlabs	n/a
needle hydrophone	ONDA Corporation	HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier
needle hydrophone	Precision Acoustics	n/a
fiber optic hydrophone	ONDA Corporation	HFO series
fiber optic hydrophone	Precision Acoustics	n/a
oscilloscope	Keysight Technology	DSOX2004A (4-channels 70MHz)
function generator	Keysight Technology	33500B (20MHz single-channel)
RF power amplifier	Electronic Navigation Industries (ENI)	325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA
RF power amplifier	Electronics & Innovation (E&I)
immersion ultrasound transducer	Olympus	focused immersion transdcuers
immersion ultrasound transducer	Benthowave Instrument	HiFu transducer BII-76 series
immersion ultrasound transducer	Precision Acoustics	Piezo-ceramic or HiFu transducers
immersion ultrasound transducer	Ultrasonic-S-lab	HiFu transducers made to order
high-density Matrigel	Corning	VWR 80094-330
Mylar film 2.5 microns	Chemplex	CAT.NO:107