자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

요약

이 프로토콜에 대 한 3 차원 구조적된 암 세포 (spheroids)에서 실시간으로 immunotherapeutic 리디렉션된 T-셀 (자동차 T-세포) 세포 독성을 평가 하기 위해 설계 되었습니다.

초록

Immunotherapy는 다르게 untreatable 암와의 싸움에서 성장 관심 분야를 되었다. 모든 immunotherapeutic 방법 중 공상 항 원 수용 체 (자동차) T 세포 특히 소아 B 급성 림프 구성 백혈병 (B-모두)와 함께 가장 아름 다운 결과 얻은 리디렉션됩니다. 클래식 유효성 검사 메서드가 자동차 T 세포의 특이성의 사용 정지에서 및이 종이 식 모델에서 대상 셀에 대 한 자동차 T 세포의 기능 분석에 의존합니다. 불행 하 게도, 생체 외에서 관측은 종종 vivo에서 얻은 결과에서 분리 하 고 다른 단계를 추가 하 여 많은 노력 및 동물을 아끼지 수: 3D 문화를 사용 하 여. 그들은 동물 모델에 engrafted는 때 종양 세포의 3 차원 구조를 모방 하는 잠재적인 대상 셀에서 spheroids의 생산 이상적인 대안을 나타냅니다. 여기, 우리는 (여기 CD19 자동차 T 세포에 의해 exemplified) 입양 세포 치료에 대 한 유효성 검사 도구로 불리고 장 셀 라인에서 spheroids를 생산 하는 저렴 하 고 신뢰할 수 있는 쉬운 방법 보고. 이 메서드는 회전 타원 체 성장 따를 수 있는 고급 라이브 이미징 시스템으로 결합, 이펙터 세포 세포 독성 그리고 종양 세포 apoptosis.

서문

입양 세포 이동 (ACT)는 다음 세대 암 치료를 나타냅니다. 그것은 환자에 효과 기 세포 (T-또는 NK-세포)의 주입에 사용합니다. 이 세포는 유전자 그들 그들의 목표는 종양을 안내 하 고 그것을 파괴 하는 수용 체와 함께 수정할 수 있습니다. 최근이 방법은 공상 항 원 수용 체 (차) B-세포 마커 CD19에 대 한 감독을 죽 일 자신의 암¹환자 T 세포에 도입 되었다 때 가능한 것으로 표시 했다. 인공 수용 체 자동차의 경우 디자인 구성 특정 항 체 파편의 바인딩 도메인은 엔터티 지정 된 단일 체인 변수 조각 (scFv), 감소 하는 항 T-세포 신호 도메인에 연결. 여러 디자인을 확인 하 고는, 가장 일반적으로 사용 되는 버전 2 세대의 자동차 디자인으로 이루어져 TCR 신호에 대 한 CD3z 및 co-stimulatory 도메인 참조 (CD28, 4-1BB, OX40, 등.) ^{1 , 2}. immunotherapy 필드 CD19 자동차-T 세포 efficaciously B 세포 악성 종양^3,4수많은 환자를 치료 법의 새로운 형태에 그것의 주의의 대부분을 감독. 이 성공 연구원은 제한 된 성공 단단한 종양에 대 한 다른 epitopes를 대상으로 비슷한 디자인을 악용 하려고 합니다. 불행 하 게도, 종양 관련 항 원 및 자동차 T 렌더링 엄격한 종양 microenvironments의 부족 단단한 종양⁵쪽으로 더 적은 효과적인 세포.

현재, 가장 일반적으로 사용 된 생체 외에서 유효성 검사 전략만 이미 언급 한 고체 종양도 전에 조각 하는 2 차원 (2D) 시스템에 의존 합니다. 고전적인, 2D 생체 외에서 시스템 기능 및 이러한 효과 기 세포의 특이성을 평가 하기 위해 monolayers로 차 T 세포와 대상 암 세포 라인의 혼합물을 포함 한다. 이러한 전략은 연구의 중요 하 고 중요 한 부분, 하지만 그들은 복용 하지 마십시오 고려 사항으로 복잡 한 형태와 암 세포⁶의 3 차원 (3D) 구조. 3D 시스템, spheroids로 배양 암 세포 유전자 식 프로필⁷, 리디렉션된 effector 세포에 의해 인식에 영향을 줄 수 있는 변화를 통해 새로운 phenotypic 특성을 획득 합니다. Birgersdotter와 동료 Hodgkin 림프 종 (HL) 셀 라인 3D 문화 모델에만 성장 하는 때 유전자 식 프로필 기본 종양 샘플⁸유사한 취득 하는 것을 설명 했다. 따라서, spheroids 또는 유사한 3D 방법론 제공 표준 2D 시스템 반대로 체 외 모델에 더 많은 관련 문화. 이러한 체계는 또한 유사한 vivo에서 연구는 특정된 자동차의 유효성 검사 과정에서 마지막 단계로 볼 수 있습니다. 2D 시스템 암 클러스터의 형태를 모방 하지 고려 spheroids 제공 하기 전에 차 T 세포의 기능을 평가 하기 위해 비슷한 형성 vivo에서 모델. 한 연구, Pickl 외. 인간 표 피 성장 인자 수용 체 (HER2) 암 세포 overexpressing의 회전 타원 체 모델 vivo에서 모델⁹유사한 신호 프로필 증명 확인. 이 더 더 적절 하 고 주변에-에서 비보의 평가 차 T 세포를 제공 하는 spheroids을 지원 합니다. 또한, 자동차 T-셀 유효성 검사 spheroids에 대 한 그들의 효능을 좀 더 비판적으로 평가 하 고 vivo에서 연구 중간 이동에서 일부 디자인을 방지 도움이 될 수도¹⁰; 따라서, 적은 동물을 희생 하 여 윤리적으로 관련된 연구에 기여. 또한, spheroids를 사용 하 여 프로토콜 되지 않는 더 비싼 클래식 2D 시스템 보다 훨씬 더 빨리 클래식 vivo에서 학문에 비해. 함께 촬영 한 회전 타원 체 연구의 생체 외에서 그리고 vivo에서 학문을 연결 하는 표준 연습을 곧 될 것입니다 예측할 수 있습니다.

여기, 우리는 결 장 암 세포 선 HCT 116에서에서 spheroids의 준비를 제시. 이 셀 라인 CD19 자동차 T 세포에 민감한 렌더링 임상 검증된 차 구문을 사용 하 여 살인의 명확한 평가 제공 하 고 인간의 CD19 분자를 표현 하기 위해 수정 되었습니다.

프로토콜

1. 대 장 암 세포 선에서 Spheroids의 생성

1. 씻어 HCT 116 (클러스터 차별화 19 (CD19) 및 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하는 불리고 안정적) 셀 monolayers 인산 염과 식 염 수 (PBS, 25 cm² 또는 75 c m² 플라스 크에 10 mL 5 mL) 버퍼링. 트립 신 (0.5 mL 25 c m² 에 대 한 또는 75 c m² 플라스 크 1 mL)을 추가 하 고 5 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어.
2. 현미경으로 세포 분리를 확인 하 고 완전 한 로스웰 파크 기념 연구소 160 매체 (RPMI 1640)와 셀 분리 효소를 무력화 (RPMI 1640 + 10 %FCS + Gentamycin; 10 mL 25 c m² 에 대 한 또는 75 c m² 플라스 크에 대 한 20 mL).
3. 5 분에 대 한 500 x g 에서 원심 분리기 세포 현 탁 액 표면에 뜨는 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 여러 번 완전 한 RPM1 1640 매체의 5 mL와 함께 아래로 pipetting으로 resuspend.
4. Trypan 블루 제외 호환 셀 카운터에 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
5. 5 분에 대 한 500 x g 에서 원심 분리기 세포 현 탁 액 표면에 뜨는 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 5 x 10³ 셀/mL를 RPMI 매체에서 resuspend.
6. 메 마른 저수지에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 하단 플레이트 라운드 96 잘으로 200 µ L/잘 분배.
7. 접시 (37 ° C, 5% CO₂, 95% 습도) 인큐베이터 안에 자동된 이미징 장치에 전송.
8. 수집 소프트웨어에 로그인, 일정 취득 선택 | 실행 선박 추가 | 일정 검색 | 배 만들기: 새로운.
9. 선택 검사 유형: 회전 타원 체. 관심의 채널 선택: 단계 + 대물 (spheroids 성장 따르도록), 녹색 (종양 신호에 따라, 수집 속도 300 ms)와 레드 (apoptosis에 따라, 수집 속도 400 ms).
   1. 선택 원하는 배율: 10 배.
   2. 플레이트 모델과 서랍에 그것의 위치를 선택 하십시오. 이미지를 우물의 위치를 선택 합니다. 실험의 설명을 입력: 이름, 셀의 형식, 셀의 수.
10. 분석 설정에 대 한 연기 분석까지 나중에 선택 합니다. 시간 표시 막대를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 스캔 그룹 간격 설정 옵션을 선택 하 고 설정 검사를 추가 모든 4 h 고 의 총 24 h.에 설정 원하는 시작 시간 (자동된 이미징 장치에 부 화 후 적어도 1 시간).
11. 이미징 소프트웨어에 로그인 하 여 spheroids의 성장에 대 한 일 마다 확인 합니다.
    1. 보기 최근 검색 옵션을 선택 하 고 원하는 실험에는 두 번 클릭. 이미지 채널 패널에서 명시 를 선택 하 고는 spheroids의 직경을 측정 하는 측정 이미지 기능 도구 날짜를 사용 하 여. 원하는 크기에 도달 하는 회전 타원 체에 대 한 일: 0.5 m m 직경의. 하루 중 증발 효과 제한 하는 4에 잘 당 완전 한 RPMI 매체의 50 µ L를 추가 합니다.

2입니다. CD19 자동차 T 세포의 생성

1. CD19 자동차 T 세포의 확장
   참고: CD19 자동차 T 세포의 안정적인 식 앞에서 설명한¹⁶PBMCs 건강 한 기증자의 대량 retroviral 변환에 의해 인수 되었다. CD19 자동차 retroviral 구문을 코딩 하는 것은 2 세대 자동차와 fmc63 scFv 체인, CD8 경첩 및 막 횡단 도메인, 4-1BB co-stimulatory 도메인 및 마지막으로 CD3ζ 도메인의 구성.
   1. 확장, 문화 transduced T 세포 안티-CD3/28 자석 구슬의 구슬 1: 1의 비율을 셀 10-11 일. 확장, 동안 세포는 완전 한 매체에는 (X-VIVO 15, 5% 혈 청 교체, 및 100 U/mL 재조합 인간 일리노이-2).
      참고: 효율적인 확장에 대 한 이상적인 밀도 1 ~ 2 x 10⁶ 셀/mL입니다. 초기 번호에 따라 셀 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO₂, 95% 습도)에 플라스 크 (25 c m² 플라스 크 20 ml, 40 mL 전체 볼륨을 75 c m² 플라스 크)에 확장할 수 있습니다.
   2. 다음 분석 실험에 대 한 부정적인 컨트롤 그룹으로 불리고 비 PBMCs (Mock으로 참조 될 것 이다) CD19 차 T 세포에 병렬 확장 프로토콜을 포함 합니다.
   3. 당일 3 및 이후, 매일 신선한 매체를 추가 하 고 필요한 경우 더 많은 문화 플라스 크로 셀을 나눕니다.
   4. 날 10-11, 5 분에 대 한 500 x g 에서 원심 분리기 세포에 상쾌한 제거 하 고 모든 셀을 결합 하 여 하나의 50 mL 튜브에 resuspend ~ 30 ml 신선한 완전 한 미디어의 셀.
   5. 장소 문화 매체에서 자석 구슬 분리 마그네틱 스탠드에 resuspended 셀을 포함 하는 50 mL 튜브.
   6. 튜브 측에 수집을 구슬에 대 한 2-3 분까지 기다립니다.
   7. 마그네틱 비드 컬렉션 영역을 건드리지 않고 피 펫과 새로운 튜브에 문화 매체를 제거 합니다.
   8. 한 번 더 최종 문화 매체에서 구슬의 수를 제한 하는 비드 제거 (2.1.5–2.1.7)에 대 한 단계를 반복 합니다.
   9. Resuspend는 셀의 개수, 1 완전 한 매체에서 2 x 10⁶ 셀/mL로 밀도 조정.
   10. 적어도 하룻밤까지 h 4 셀 나머지. 그런 다음 직접-80 ° C에 아래로 그들을 멈추게 하 고 액체 질소 탱크 장기 저장에 대 한 다음 날에 튜브를 전송. 또는 한 연장할 수 있습니다 나머지 최대 하룻밤 즉각적인 사용을 위해.
2. 기본 T 세포에 CD19 자동차 식 제어
   1. 야간 문화 또는 동결/동결 해제 후 적당히 숫자 약간 달라질 수 있습니다으로 확장 된 T 세포의 수를 계산 하 고
   2. 5 x 10 두 CD19 자동차에서⁵ 세포와 모의 기본 T 세포의 흐름 cytometry 튜브를 분리 전송.
   3. 흐름 버퍼의 200 μ로 세포 세척 (2% FBS PBS에) 및 원심 분리기 문화 매체에 의해 발생 하는 모든 아티팩트를 제거 세척 단계를 반복 하는 500 x g 5 분에 튜브.
   4. 1: 200 희석 흐름 버퍼에서 수행 하 여 1 차적인 항 체 (Biotin 염소 반대로 마우스 IgG, 조각 특정 F(ab') ₂)를 준비 합니다.
   5. 튜브 당 항 체 혼합의 100 μ 셀 resuspend 그리고 15 분 이전 세척 단계 초과 항 체를 제거를 두 번 반복에 대 한 얼음에 품 어.
   6. 흐름 버퍼에서 1:400 희석으로 이차 항 체 (Streptavidin-PE)를 준비 합니다.
   7. 튜브 당 항 체 혼합의 100 μ 셀 resuspend 그리고 15 분 이전 세척 단계 초과 항 체의 제거를 두 번 반복에 대 한 얼음에 품 어.
   8. 셀의 흐름 버퍼 튜브 당 200 μ에 resuspend 및 교류 cytometer에서 분석.
   9. 부정적이 고 긍정적인 게이트 설정 및 분석 CD19 자동차 사용 모의 T 세포 T 세포를 적절 하 게 불리고.

3. 3D 종양 회전 타원 체 살인 분석 결과

1. 6 일 또는 한 번 spheroids 후 원하는 크기에 도달, 인큐베이터에서 제거 하십시오. 회전 타원 체 격판덮개에서 완전 한 RMPI 1640 매체의 100 µ L/잘 제거 부드럽게 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여.
   1. 이 단계에 대 한 내부 쪽으로 팁 각도 spheroids의 교란을 최소화 하기 위해 우물의 바닥 접촉을 피하고 96-웰 플레이트의 벽. 볼륨에 남은 약 100 µ L 이어야 한다.
2. 완전 한 RPMI 1640 매체의 9.95 mL와 빨간 Annexin V의 50 µ L를 혼합 하 여 Annexin V 빨강의 1: 200 솔루션을 준비 합니다.
3. 추가 1: 200 Annexin V 붉은 솔루션 100 µ L/잘.
4. 15 분 동안 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO₂, 95% 습도)에 접시를 전송.
5. 수확 15 mL 튜브에 500 x g 5 분에서 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 여러 번 완전 한 RPM1 1640 매체의 2 mL와 함께 아래로 pipetting으로 resuspend 원심 분리기 transduced 자동차 CD19 T 세포.
6. Trypan 블루 제외 호환 셀 카운터에 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
7. 5 분에 대 한 500 x g 에서 원심 분리기 세포 현 탁 액 표면에 뜨는 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 2 x 10⁵ 셀/mL를 RPMI 매체에서 resuspend.
8. 메 마른 저수지에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 회전 타원 체 바닥판 라운드 96 잘으로 100 µ L/잘 분배.
9. (37 ° C, 5% CO₂, 95% 습도) 인큐베이터 안에 자동된 이미징 장치 다시 접시를 전송.
10. 수집 소프트웨어에 로깅합니다를 취득 일정을 선택 합니다.
    1. 스캔 타임 라인에서 마우스 하 고 일정 편집을 선택 합니다. 검사 그룹에서 마우스 하 고 그것을 삭제 합니다. 타임 라인에서 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 스캔 그룹 간격 설정 옵션을 선택 하 고 설정 검사를 추가 모든 를 1.5 h 의 총 24 h.
    2. 원하는 시작 시간 (자동된 이미징 장치에 부 화 후 적어도 1 시간)을 설정 합니다. 일정 검색 저장을 선택 합니다.

4. 자동화 된 이미지 분석

1. 수집에 로깅합니다, 그리고 보기 최근 검색 옵션을 선택 하 고 시작 분석 옵션을 선택. 새로운 분석 정의 만들기 선택 | 분석 유형: 회전 타원 체. 체크 이미지 채널 분석 (단계 + 대물, 녹색 및 빨강).
2. 적어도 10 대표 이미지 선택: 일반적으로, 조건 및 적어도 3 시간 포인트 (시작, 중간 및 취득의 끝) 1.
3. 미리 보기 기본 분석 전체 이미지 스택에 절차.
4. 대물 마스크에 대 한 매개 변수를 수정 합니다. 일반 매개 변수는: 감도 10, 구멍 채우기 1000 µ m²분 지역 1000 µ m². 전체 이미지 스택 미리 보기와 선택 된 매개 변수는 spheroids를 정확 하 게 감지 하는 확인 하십시오.
5. 녹색 마스크 (GFP)에 대 한 매개 변수를 수정 합니다. 일반 매개 변수는: 반경 200 µ m와 임계값 3 모자 세분화 GCU, 가장자리 분리, 구멍 채우기 5000 µ m², 조정 크기-2 픽셀, 지역 분 3000 μ m². 전체 이미지 스택 미리 보기와 선택 된 매개 변수는 spheroids를 정확 하 게 감지 하는 확인 하십시오.
6. 빨간 마스크 (Annexin V)에 대 한 매개 변수를 수정 합니다. 일반 매개 변수는: 반경 150 µ m와 임계값 2 모자 세분화 GCU, 가장자리 분리, 구멍 채우기 5000 µ m², 조정 크기 0 픽셀, 지역 분 1000 µ m². 전체 이미지 스택 미리 보기와 선택 된 매개 변수는 spheroids를 정확 하 게 감지 하는 확인 하십시오.
7. 분석기를 시작 합니다.
   1. 분석 완료 되 면, 관심의 측정을 추출 합니다. 분석 된 파일 그리고 그래프 통계 옵션을 선택 합니다. 관심, 검사 및 우물의 통계를 선택 합니다. 일반적으로, 대물 경계 내 총 빨강과 녹색 강도 spheroids 경계 명시 마스크 (그림 3)에 의해 결정 하는 형광 신호를 제한 하 여 가장 정확한 측정을 제공 합니다. "데이터 내보내기"를 클릭 하 여 여러 파일 형식에서 선택한 통계를 추출 합니다.
8. 이미지 및 동영상의 추출 분석된 파일을 선택 하 여 이동 합니다 고 내보내기 이미지 및 동영상 옵션을 선택 합니다. 두 옵션 중 "으로 표시" 검색 이미지와 영화 중 하나 "로 저장" 타사 소프트웨어를 통해 외부 분석에 대 한 원시 데이터를 검색 하는 이미징 소프트웨어 (일반적으로 복합 이미지)에 사용할 수 있습니다.

결과

그림 1에서 볼 수 있듯이 그것은 cytometry에 의해 T 세포 (그림 1A)에 CD19 자동차의 표현과 HCT116 종양 세포 라인 (그림 1B)에 CD19의 레벨의 수준을 확인 중요 합니다. 그림 2 는 전형적인 회전 타원 체 실험 결과 예로 보여주. 자동화 된 이미징 장치는 4 개의 다른 채널에서 사진을 찍는: 밝?...

토론

미래의 암 치료의 유효성을 검사 하는 혁신적인 도구 spheroids 사용 하 여 지난 몇 년 동안에서 성장 관심 분야 되고있다. Spheroids 클래식 2D 생체 외 분석과 생체 조건 평가 사이의 중간 단계를 나타냅니다. 추가 방법은 종양 미세 환경 유전자 프로 파일링⁷뿐만 아니라 흉내 낸 측면에서 그들의 힘에 관한 약속을 많이 보유 하고있다. 이 책에서 제시 하는 프로토콜은 Saheen에서 적응

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Lot Number: RNBG7037
75 cm² growth area flasks	VWR	430639	Lot Number: 2218002
75 cm² growth area flasks	VWR	734-2705	Lot Number: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Lot Number: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL	Life Technology (Gibco)	21875-091	Lot Number: 1926384
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064	Lot Number: 08Q3066K
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Lot Number: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	Lot Number: 1886513
96 well plate, round bottom	VWR	734-1797	Lot Number: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fischer	11132D	-
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Lot Number: 8MB036
CTS Immune Cell Serum Replacement	Thermo Fischer	A2596102	Lot Number: 1939319
IL-2 Proleukin	Novartis		Lot Number: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent	Essen Bioscience	4641	Lot Number: 17A1025-122117
Reagent Reservoir	VWR	89094-672	Lot Number: 89094-672
15 mL tubes	VWR	734-1867	Lot Number: 19317044
anti-human CD19-PE	BD Biosciences	555413	Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-066-072	Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583
Streptavidin-PE	BD Biosciences	554061	Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line	ATCC	CCL-247	-
Incucyte S3	Essen Bioscience