수명이 긴 플라즈마 세포에 인간의 정상적인 메모리 B 세포의 체 외 분화 모델

요약

생체 외에서 B 세포 플라즈마 세포 차별화 모델을 보고 다단계 문화 시스템을 사용 하 여, 우리.

초록

플라즈마 세포 (Pc)는 많은 양의 항 체를 분 비 하 고 활성화 된 B 세포에서 개발. Pc 희귀 세포 골 수 또는 점 막에 위치 하 고 체액 성 면역을 확인 합니다. 그들의 낮은 주파수 및 위치, Pc의 연구는 어려운 인간에서. 우리 PC에는 B를 보고 선택한 조합의 vivo에서 발생 하는 순차 세포 분화를 재현할 수 있도록 하는 cytokines 및 활성화 분자를 사용 하 여 체 외 분화 모델. 그리고 마지막으로, 긴에이 체 외 모델, 메모리 B 세포 (MBCs) (PBs), 초기 Pc 사전 plasmablasts (prePBs), plasmablasts로 차별화에 Pc는 표현 형 가까운 건강 한 개인. 에서 그들의 대응에 우리 또한 오픈 액세스 생물 정보학 GEP 데이터 PC 분화에 관련 된에서 가장 눈에 띄는 정보를 분석 하는 도구를 만들었습니다. 인간의 B PC 차별화 하 고 현재 연구에 연구를 이러한 리소스를 사용할 수 있습니다, 그리고 우리 인간의 B PC 차별화를 하는 동안 후 요인의 유전자 표현 규제 조사.

서문

플라즈마 세포 (Pc) B 세포의 분화는 체액 성 면역에 대 한 필수적 이며 감염¹에 대 한 호스트를 보호. B PC 차별화를 주요 변화 항 체 분 비에 맞게 전송 용량 및 신진 대사에 연결 됩니다. B PC 차별화를 제어 하는 전사 인자 광범위 하 게 연구 하 고 밝혀 독점 네트워크 B 및 PC 관련 전사를 포함 하 여 요인 (TFs)². B 세포, PAX5 BCL6, BACH2 TFs에 B 세포 정체성^2,3의 수호자. 유도 IRF4, PRDM1 인코딩 BLIMP1 및 XBP1 PC TF의 B 세포 유전자를 소화 하 고 유도 조정된 항 체 은닉 세포 transcriptional 프로그램^3,,45. 이러한 조정된 transcriptional 변화는 secreted 형태의 면역 글로불린 무거운 체인^2,3, 막 바인딩 폼에서 스위치 함께 Ig 유전자 녹음 방송 활성화와 관련 ⁴. B PC 차별화를 바인딩과 그물에 관련 된 유전자의 유도로 연결 기능과 Golgi 기구 펼쳐진된 단백질 응답 (UPR) 활성화의 합성을 수용 하 여 PC에서 핵심적인 역할을 담당할 것으로 알려져 수 반하는 은닉 면역 글로불린^6,7. TF XBP1이 셀룰러 적응^8,,910에서 주요 역할을 한다.

B 세포와 Pc는 체액 성 면역의 중요 한 선수. 이해 하는 생물 학적 제어 생산과 정상 혈장 세포의 생존은 효율적인 면역 반응 및 면역 또는 면역 결핍을 방지 하는 치료 내정간섭에 중요 하 처리 합니다. PC는 전체 생물 학적 특성, 특히 인간에서에서 방해 해 부 위치에서 일어나는 초기 분화 단계와 희귀 세포 이다. 다단계 문화 시스템을 사용 하 여, 우리 PC 차별화 모델에는 생체 외에서 B를 보고 있다. 이 모델 재현 순차 세포 분화 및 성숙 vivo^11,12,13. 에 다른 장기에서 발생 첫 번째 단계에서 메모리 B 세포 처음 CD40 ligand, oligodeoxynucleotides 및 cytokine 조합 하 여 4 일에 활성화 하 고 preplasmablasts (PrePBs)으로 차별화 합니다. 두 번째 단계에서 preplasmablasts는 CD40L oligodeoxynucleotides 자극을 제거 하 고 cytokine 조합을 변경 하 여 plasmablasts (PBs)로 분화를 유도. 세 번째 단계에서 plasmablasts는 cytokine 조합^11,12변경 하 여 초기 Pc로 차별화를 유도. 네 번째 단계 이러한 초기 Pc 골 수 기질 세포 조절 매체와 경작 하 여 완전히 성숙한 Pc를 소개 했다 또는 성장 요인¹³을 선택. 이러한 성숙한 Pc 생체 외에서 몇 달 동안 살아남을 수 있고 분 비 면역 글로불린 (그림 1)의 높은 양의. 흥미롭게도, 우리의 생체 외에서 모델이 조정 transcriptional 변화와 감지 vivo에서^{11,12,13,14 수 있는 PC 단계에 다른 B 형 ,15}. Pc는 희귀 세포 및 우리의 체 외 분화 모델 인간의 B PC 차별화를 연구 수 있습니다.

프로토콜

프로토콜은 헬싱키의 선언 및 계약 몽펠리에 대학 병원 센터의 생물 자원에 대 한 지침을 따릅니다.

1. 체 외 일반 플라즈마 세포 차별화 모델에

참고: Pc 4 단계 문화^11,,1213를 통해 생성 됩니다.

1. B 세포 증폭 및 분화
   1. 메모리 B 세포 정화에 대 한 건강 한 자원자에서 말 초 혈액 세포를 사용 합니다.
   2. RPMI 1640 매체의 24.5 mL와 함께 혈액의 7.5 mL를 희석.
   3. 살 균 50 mL 원뿔 튜브에 실내 온도 밀도 그라데이션 (예: Ficoll)의 12.5 mL를 추가 합니다. 부드럽게 희석된 혈액의 32 mL와 함께 밀도 그라디언트 오버레이. 두 단계를 혼합 하 여 최소화 합니다.
   4. 해제 브레이크 500 x g 에서 20 분을 원심. 희석된 플라즈마/밀도 그라데이션 인터페이스는 PBMCs를 수집 하 고 셀 살 균 50 mL 튜브에 놓고 45 mL 행 크의 균형 소금 솔루션을 완료 합니다.
   5. 500 x g에 5 분에 대 한 셀 원심 조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 펠 릿을 유지.
   6. 500 x g에서 RPMI1640/10% 송아지 태아 혈 청 (FCS) 및 원심 분리기 5 분의 45 mL를 추가 합니다. 조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 펠 릿을 유지. PBS/2% FCS의 30 mL를 추가 합니다.
   7. C d 2 + 자석 구슬 안티-c d 2를 사용 하 여 셀을 제거 합니다. 4 구슬 한 목표 셀에 대 한 추가 합니다. 4 ° c.에 30 분을 품 어
      1. 별도 구슬 바인딩된 셀 셀 분리 응용 프로그램에 대 한 자석을 사용 하 여 바인딩되지 않은 셀에서. 바인딩되지 않은 세포를 수집 하 고 셀 펠 릿으로 CD19 APC 안티 및 CD27 PE 항 체 안티 4 ° C (10⁶ 셀에 대 한 항 체의 2 µ L)에서 15 분 동안 품 어.
      2. PBS/10% 염소 혈 청에 두 번 세척.
      3. FSC 그리고 SSC 플롯에 오염 이벤트를 제거 합니다. FSC-A vs FSC-H와 SSC A 대 SSC-H 플롯 파편을 제거 하 고 총 백혈구 채우기 선택에 singlets을 플롯 합니다. CD19/CD27와 CD19 메모리 B 셀 선택⁺CD27⁺.
      4. 95% 순수성을 가진 셀 정렬을 사용 하 여 MBCs를 정화.
   8. 10%와 IMDM FCS, 50 mg/mL 인간의 올려진다 고 5 mg/mL 인간의 인슐린 보충을 사용 하 여 모든 문화 단계를 수행 합니다.
   9. 6 잘 배양 배지에서 MBCs를 정화 하는 플레이트 (1.5 x 10⁵ MBCs/mL에 5 mL/잘), 일리노이-2와 4 일 동안 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL), 및 IL-15 (10 ng/mL).
      1. Phosphorothioate CpG ODN 2006, 히스티딘 태그 재조합 인간 성 CD40L를 추가 (sCD40L; 50 ng/mL) 및 MBCs 활성화 (그림 1)에 대 한 안티 polyhistidine mAb (5 mg/mL). 낮은 확대¹²같은 cytokine 칵테일 수익률 만으로 sCD40L 또는 ODN 활성화. 여기의 최대 수에 납을 첨가 하는 활성화 신호를 설명의 조합 활성화 B 세포와 PrePBs^11,12 (그림 1).
      2. 진 식 프로 파일링, CD38 정화^-/CD20^- PrePBs, 4, 일에서 셀 정렬 (그림 2)를 사용 하 여.
2. Plasmablastic 셀 생성
   1. 4 일에는 셀을 계산 합니다.
   2. 2 mL/잘에서 10⁵/mL x 2.5에서 12-잘 배양 배지에서 플레이트 세포.
   3. CpG oligonucleotides 및 sCD40L의 제거 및 추가와 새로운 cytokine 칵테일 일리노이-2를 포함 하 여 새로운 문화 매체의 차별화를 유도 (20 U/mL), 일리노이-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) 및 IL-15 (10 ng/mL) (그림 1). 3 일 (4 일) 하루 7 37 ° c.에 대 한 문화 셀
   4. 진 식 프로 파일링, CD38 정화⁺/CD20^- PBs, 하루 7에서 셀 정렬 (그림 2)를 사용 하 여.
3. 초기 플라즈마 세포 생성
   1. 7 일에는 셀을 계산 합니다.
   2. 셀 2 mL에 5 x 10⁵/mL에서 12-잘 문화 접시에 접시/잘.
   3. 일리노이-6와 신선한 문화 매체를 사용 하 여 초기 Pc에 PB를 차별화 (50 ng/mL), 일리노이-15 (10 ng/mL)와 IFN-α (500 U/mL) 37 ° c.에 3 일 동안 CD20 정화 진 식 프로 파일링,^-/CD38⁺/CD138⁺ 초기 Pc, 하루 10에서 셀 정렬 (그림 2)를 사용 하 여.
4. 수명이 긴 플라즈마 세포 생성
   1. 문화 상태를 변경 하 여 초기 Pc 오래 살았던된 Pc로 차별화.
   2. 5 x 10⁵2 ml에서 /mL에서 12-잘 배양 배지에서 셀 문화/잘 또는 24-잘 배양 배지 1 mL/37 ° C에서 4 월의 매체를 조절 하는 일리노이-6와 stromal 세포를 사용 하 여 (200 ng/mL).
   3. Stromal 세포 배양과 5 일 배양 여 stromal 세포 조절 매체를 가져올. Stromal 세포 배양 표면에 뜨는 (0.2 µ m) 필터 및 고정.
   4. 매주 갱신 PC 문화를 stromal 세포 조절 미디어의 50%를 추가 합니다. 생성 된 긴 Pc 개월¹³유지 될 수 있습니다. Pc의 긴 기간 생존 보고¹³으로만 일리노이-6와 4 월 얻을 수 수 있습니다.
   5. Cytometry에서 측정 Ig 분 비 Pc 정렬.
   6. 24 h에 대 한 10⁶ 셀/mL에 Pc 문화 고 문화 상쾌한 수확. IgG 및 IgA 인간 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 키트^11,,1213를 사용 하 여 측정 합니다. 메디아 IgG 일 10 ~ 17 세/셀/일 하루 60¹³에서 10 pg/셀/일에서 240 분 비.

2. 분자 아틀라스 PC 차별화에 B의

참고: 우리는 편리 하 고 오픈 액세스 생물 정보학 도구를 추출 하 고 PC 차별화 (GenomicScape)¹⁵에 관련 된 Affymetrix GEP 데이터에서 가장 눈에 띄는 정보 시각화를 내장. GEP 순화 MBCs, PrePBs, PBs와 Epc를 포함 하 여 ArrayExpress 데이터베이스 (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)에서 공개적으로 사용할 수 있습니다: 전자-MTAB-1771, E-MEXP-2360 및 E-MEXP-3034 BMPC E-MEXP-2360^14,15. Genomicscape는 자유롭게 사용할 수 webtool을 이다.

1. PC 데이터 집합 B의 선택
   1. GenomicScape 오픈 액세스 bioinformatic 도구 (http://www.genomicscape.com) 라는 인간의 B 세포 플라스마 세포에서에서 데이터 찾아보기 메뉴에서 PC 데이터 집합에 B를 선택 합니다. 시각화의 독특한 유전자의 유전자 식 프로필 또는 유전자의 목록이 분석 도구 홈 페이지에서 사용할 수 있는 식 Coexpression 보고서 도구를 사용 하 여 이용하실 수 있습니다.
2. 감독된 분석 및 주성분 분석 (PCA)
   1. 선택 분석 도구 | webSAM SAM 도구를 로드.
   2. 플라스마 세포 인간 B 세포 데이터 집합을 선택 하 고 샘플 비교의 그룹을 선택 합니다.
   3. 관심의 필터링 옵션을 적용할 수 있는 다른 필터를 사용 합니다.
   4. 샘 도구로 유전자 표현 프로 파일 비교를 배 변경, 순열, 거짓 검색 속도 비교의 종류의 수를 포함 하 여 필터링 옵션을 수정 합니다. GenomicScape는 분석을 계산 하 고 차동 선택한 그룹 사이 표현 하는 유전자를 제공.
   5. 주요 구성 요소 분석 분석 도구 메뉴에서 선택 하 여 주성분 분석을 실행 합니다.
   6. 플라즈마 세포 인간 B 세포 데이터 집합을 선택 하 고 관심의 그룹을 선택 합니다.
   7. 관심사의 유전자 또는 분산에 따라 선택 유전자 목록을 붙여 넣습니다. 유전자의 목록을 붙여 넣습니다, 유전자/ncRNAs 목록을 분석 하 고 여기를 클릭... Genomicscape 선택 PCA 시각화 하 고 다운로드 수를 계산 합니다.

결과

생체 외에서 정상적인 PC 차별화의 전반적인 절차는 그림 1에 표시 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜을 사용 하 여, 우리 수 얻을 수 없는와 ex vivo 인간의 샘플 셀의 충분 한 수량을 생성할 수 있습니다. PC 분화에 관련 된 녹음 방송 요인의 복잡 한 네트워크의 역할을 조사 하지만 키 PC 차별화 전사 네트워크 규제 메커니즘 가난 하 게 알려진 남아 있습?...

토론

인간, PC 희귀 세포 분화 단계 전체 생물 학적 특성을 방해 해 부 장소에서 일어나는. 우리 개발 활성화 분자와 cytokines의 다양 한 조합에서 발생 하는 순차 세포 분화를 재생 하기 위하여 적용 이후에 다단계 문화 시스템을 사용 하 여 PC 차별화 모델에 생체 외에서 B는 vivo^11,,1213에 다른 기관/조직.

Pc 차별화 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-CD2 magnetic beads	Invitrogen	11159D
Anti-CD138-APC	Beckman-Coulter	B49219
Anti-CD19-APC	BD	555415
Anti-CD20-PB	Beckman-Coulter	B49208
Anti-CD27-PE	BD	555441
Anti-CD38-PE	Beckman-Coulter	A07779
Anti-histidine	R&D Systems	MAB050
CpG ODN(PT)	Sigma		T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human Transferin	Sigma-Aldrich	T3309
IFN-α	Merck	Intron A
IMDM	Gibco	31980-022
Recombinan Human CD40L-hi	R&D Systems	2706-CL
Recombinant Human APRIL	R&D Systems	5860-AP-010
Recombinant Human IL-10	R&D Systems	217-IL-
Recombinant Human IL-15	Peprotech	200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 Protein	R&D Systems	202-IL-
Recombinant Human IL-6	Peprotech	200-06