작은 분자 조사를 시험관 및 셀 모양을 사용 하 여 사전 mRNA 구조 변화 유도

요약

둘 다 생체 외에서 그리고 세포에서 선택적 2'-히 드 록 acylation 뇌관 연장 (모양) 실험 사전 mRNA 시퀀스는 RNA를 대상으로 작은 분자의 존재의 2 차 구조를 결정 하 여 분석에 대 한 자세한 프로토콜은 이 문서에서 제시 하는.

초록

RNA를 대상으로 작은 분자의 약 개발, 과정 대상 RNA 순서와 그들의 상호 작용에 구조적인 변화를 elucidating는 원한다. 우리 여기는 상세한 생체 외에서 제공 하 고 셀 선택 2'-히 드 록 acylation 뇌관 연장에 의해 척수 근육 위축 증 (SMA)의 생존에 대 한 실험 약물의 RNA 구조 변화 연구 (모양) 프로토콜 분석 모터 신경 (SMN)-c 2를 사전-SMN2 유전자의 mRNA의 exon 7에서. 생체 외에서 모양, SMN2 exon 7 포함 된 140 뉴클레오티드는 RNA 순서 T7 RNA 중 합 효소에 의해 복사할 SMN-C2, 존재 접혀 이며 가벼운 2'-OH acylation 시 약, 2-methylnicotinic 산 imidazolide (NAI)에 의해 연속적으로 수정. 이 2'-오-NAI adduct 추가 ³²P 표시 된 뇌관 연장에 의해 조사 되 고 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)에 의해 해결. 반대로, 2'-OH acylation 셀 모양에서 일어난다 SMN-C2 바인딩된 세포질 RNA와 현장에서 살아있는 세포에서. 뇌관 연장에 모양 유발 돌연변이와 SMN2 유전자에서 exon 7의 사전 mRNA 순서는 다음 차세대 시퀀싱 및 PCR에 의해 증폭 됩니다. 두 가지 방법론을 비교, 생체 외에서 모양을 더 비용 효율적인 방법 이며 결과 시각화 하는 컴퓨팅 파워를 필요로 하지 않습니다. 그러나, 생체 외에서 모양을 파생 RNA 모델은 때때로 RNA 의무적인 단백질에와 함께 모든 상호 작용의 손실로 인해 가능성이 셀룰러 맥락에서 이차 구조에서 일탈 한다. 셀 모양 방사성 소재 직장을 필요 하지 않습니다 고 세포질 문맥에서 더 정확한 RNA 이차 구조를 생성 합니다. 또한, 셀에 형태는 일반적으로 해당 페이지 분석에 의존 하는 체 외에 비해 차세대 시퀀싱을 활용 하 여 더 큰 범위의 RNA 시퀀스 (~ 1000 뉴클레오티드) 모양 (~ 200 뉴클레오티드)는 일반적으로 대 한. SMN2 사전-mRNA에 exon 7의 생체 외에서 그리고에서 셀 모양 파생 하는 경우에 RNA 모델은 서로 비슷합니다.

서문

선택 2'-히 드 록 acylation 뇌관 연장 (모양)에 의해 분석은 관심사의 RNA 순서에 있는 각 뉴클레오티드의 활동을 측정 하 고 단일 뉴클레오티드 해상도¹에서 이차 구조를 elucidating 방법입니다. 생체 조건^2,,34 (정의 된 버퍼 시스템에서 정화 RNA)에 둘 다 모양 방법론 및 보조를 조사 하기 위해 개발 되었습니다 생활 포유류 세포^5,6, 중간 길이가 RNA의 구조 (일반적으로 < 셀 모양에 대 한 1000 뉴클레오티드와 < 생체 외에서 모양에 대 한 200 뉴클레오티드). 특히 유용 바인딩 상호 작용 하는 RNA 분자 대사 산물^2,4,7,8 시 수용 체 RNA에에서 구조적인 변화를 평가 하 고 기계 작업을 공부 하 약 개발^9,10동안 RNA를 대상으로 분자.

RNA를 대상으로 약물 발견 최근 그려 관심 학술 연구소에서 및 제약 산업^11,12 다른 접근 방식 및 전략^{13,,1415 를 통해 16}. 최근 임상 사용에 대 한 RNA를 대상으로 하는 작은 분자의 예로 두 구조적으로 독특한 실험 약물, LMI-070¹⁷ 및 RG-7916^18,19, 척수 근육 위축 증 (SMA), 유망 보여준 단계 II 임상 시험²⁰에서 결과. 두 분자 했다 증명 대상 생존 모터 신경 (SMN)의 2 중-mRNA 및 SMN2 유전자^6,,1721의 접합 과정을 조절. 우리는 이전의 생체 외에서 셀 모양 RG-7916 SMN C2⁶으로 알려진의 아날로그의 대상 RNA 구조 변경 검사에 응용 프로그램을 설명 했다.

원칙적으로, 모양 편견 방식에서 자체 냉각 acylation 시 약의 초과 하는 금액의 RNA 순서의 각 뉴클레오티드의 2'-OH acylation 속도 측정합니다. Acylation 시 약은 물의 짧은 반감기에에서 불안정 (예를 들어, T_1/2 = 17의 1-메 틸-7-nitroisatoic 무수 물; 또는 1 M 7, 2-methylnicotinic 산 imidazolide에 대 한 ~ 20 분 또는 NAI)²² 와 무감각의 정체성 기지²³. 각 뉴클레오티드의 역학의 정확한 평가로 변형 될 수 있는 유연한 기초 2'-OH 그룹의 더 유리한 acylation 발생 합니다. 특히, 뉴클레오티드 기본적인 쌍에 NAI 1 M 7 등 2'-오 수정 시에는 짝이 없는 하나 보다 일반적으로 덜 반응입니다.

RNA 템플릿과 2'-OH acylation 수행의 소스를 보면, 모양 수 있다 생체 외에서 그리고에서 셀 모양으로 일반적으로 분류 될 있다. 시험관 모양 사용에서 순화 T7 RNA를 변하게 하 고 실험 설계에서 셀룰러 컨텍스트 부족. 셀 모양에 RNA 서식 파일 녹음 및 2'-OH acylation는 살아있는 세포; 내에서 발생 따라서, 결과 세포 맥락에서 RNA 구조 모델을 정리 수 있습니다. 셀에서 모양은 하 비보 모양에서 문학²⁴에서 살아있는 세포에 운반 하는 모양에 대 한 추천 되었습니다 했다. 이후이 실험 동물에서 수행 되지 않습니다, 우리 셀 모양 정확도 대 한이 실험 되 나.

체 외에서 세포 모양의 뇌관 확장 단계에 대 한 전략 또한 다르다. 생체 외에서 모양, 반전 녹음 방송의 Mg^{2 +}2'-OH acylation 위치에서 중지합니다. 밴드의 강도 acylation 속도¹에 비례와 ³²P 표시 뇌관 연장 따라서 밴드 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)에 나타납니다. 셀 모양, 반전 녹음 방송 2'-OH에서 무작위 돌연변이 생성 adduct 미네소타^{2 +}존재 위치. 각 뉴클레오티드의 mutational 속도 깊이 차세대 시퀀싱에서 캡처할 수 수 있습니다 그리고 단일 뉴클레오티드 해상도 모양 반응 다음 산출 될 수 있다.

셀 모양에 대 한 잠재적인 문제는 낮은 신호 대 잡음 비율 (즉, 2'-OH 그룹의 대부분은 수정, 수정 되지 않은 시퀀스 다음-세대 시퀀싱에서 읽기의 대부분을 차지 하는 동안). 최근, 2'-OH를 풍부 하 게 하는 방법 RNA, vivo에서 모양 (icSHAPE)를 클릭 하 여 참조, 수정 장 실험실²⁵에 의해 개발 되었다. 이 농축 방법 RNA 상호 작용, 특히 전체 transcriptome 심문 등 약한 작은 분자를 공부에 유리한 수 있습니다.

프로토콜

1. 시험관 모양에서

참고: 프로토콜 게시 프로토콜¹에서 수정 됩니다.

1. RNA 서식 파일 준비
   참고: T7 전사에 대 한 서식 파일 합성 이중 가닥 DNA (dsDNA) 고 중 삽입 대장균 벡터에 의해 증폭 된 EcoRI/BamHI 금지 endonuclease, pET28a, 또는 PCR에 의하여의 독특한 쌍으로 명령 했다. PCR 확대를 위한 프로토콜은 아래 나와 있습니다.
   1. 다음 자료를 믹스: PCR 마스터의 50 μ 믹스 ( 재료의 표참조), 10 μ M에 각 뇌관을 위해 2 μ (시퀀스 표 1 참조), 200 2 μ 및 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 3 μ H₂두 개의 PCR로 약 수 오의 41 μ dsDNA 템플릿의 ng 튜브 (각 튜브 포함 반응 혼합물의 50 μ).
   2. 다음과 같이 열 cycler 설정: 단계 1) 95 ° C 30에 대 한 s; 2 단계) 20 95 ° C s; 3 단계) 20 56 ° C s; 4 단계) 20 72 ° C s; 단계 5) 루프 다시 단계로 2 30 사이클; 6 단계) 3 분;에 대 한 72 ° C 및 7 단계) 무한 다음 단계까지 4 ° C에서 개최.
   3. 젤 조각의 추출에 의해 PCR amplicon 정화 ( 테이블의 자료 를 참조 하 고 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여). 10 mM Tris (pH 8.0)를 포함 하는 트리 스-EDTA (테) 버퍼의 35 μ와 제품 DNA elute 1 mm EDTA 0.1-0.5 μ g/μ 서식 파일. 0.10 μ g/μ로 순화 된 DNA 템플렛을 정상화.
      참고: 필요에 따라 서식 파일의 품질에는 1.8 %agarose 젤 전기 이동 법 0.10 μ g의 DNA 분석 수 있습니다. 원하는 서식 파일 DNA의 단일 밴드 젤에 예상 된다.
   4. T7 녹음 방송 반응 (총 볼륨 40 μ) PCR 튜브에 다음 자료를 추가 하 여 설정: 반응 버퍼, ATP, CTP, GTP, UTP, T7 효소의 4 μ의 4 μ의 4 μ의 4 μ의 4 μ x 10의 4 μ ( 재료의 표참조) 단계 1.1.3 (0.4 μ g)에서 순화 된 PCR amplicon의 4 μ 그리고 diethyl pyrocarbonate (DEPC)의 12 μ-물 처리. 4 x 위아래로 pipetting으로 혼합. 4-16 h 열 cycler에서 또는 37 ° C 배양 기에서 37 ° C에서 품 어.
      참고: 1.1.6 단계 단계 1.1.4에서에서 반응이 진행 하는 동안 설치를 시작 합니다.
   5. DNase의 2 μ 추가, 4 배속, 위아래로 pipetting으로 혼합 및 동일한 볼륨 2의 15 분 믹스에 대 한 37 ° C에서 품 어 트리 스-borate-EDTA (TBE) x-요소 샘플 버퍼 ( 재료의 표참조). 비활성화를 3 분 동안 70 ° C에서 열.
   6. RNase 무료 병 혼합 40% 아크릴/bisacrylamide 솔루션의 75 mL (29: 1, 테이블의 자료를 참조), 요소, 180.2 g (RNase 무료 재료의 표참조) 10 x TBE 버퍼의 50 ml. 우 레 아의 모든 결정은 해산 때까지 궤도 셰이 커 (250rpm)에 병을 넣어 (2 시간까지 걸릴 수 있습니다). DEPC 처리 물 500 mL를 볼륨을 조정 합니다. 0.2 μ m의 막으로 솔루션을 필터링 ( 재료의 표참조).
      참고: 이 과정에서 하지 않도록 반사를 사용 하 고 저 어 바 RNase 오염을 방지 하기 위해. 솔루션 4 ° C에서 최대 1 년 동안 저장할 수 있습니다.
   7. 이온된 수와 70%는 적절 한 크기 (16.5 cm x 24 c m)의 2 개의 전기 이동 법 유리 접시를 청소 EtOH 닦아 종이의 조각을 사용 하 여. 2.0 m m 스페이서 (시 표면 플레이트 안쪽에서 마주보 고)의 쌍 판 하며 테이프와 플레이트의 가장자리를 밀봉 됩니다. 더블-테이프 유출 방지 하기 위해 플레이트의 모서리.
   8. 비 커에서 단계 1.1.6 10% 염화 persulfate 솔루션의 2.0 mL, tetramethylethylenediamine (TEMED)의 100 μ에서 아크릴 솔루션의 200 mL와 함께 혼합 RNase 무료 피 펫 팁 30 s. 기울기에 대 한 신속 하 게 감동 하 여 벤치탑 커버의 조각에 접시 부 어 격판덮개의 간격에서 솔루션입니다. 모든 거품을 해제 하 여 벤치탑 커버에 접시를 놓고 접시를 누릅니다. 즉시 빗을 삽입 하 고 적어도 1 시간에 대 한 유해 젤을 하자.
      참고: 젤 다음 날 내에서 사용 될 경우 커버 젖은 종이 타월과 랩의 조각으로 젤의 상단 플라스틱 랩의 큰 조각. 4 ° c.에 평평 거짓말 배치
   9. 테이프를 제거 하 고 접시를 전기 스탠드에 클램프. 빗을 제거 하 고 위쪽 및 아래쪽 저수지에서 적절 한 1 x TBE 버퍼를 추가 합니다. 미리 W. 20에서 30 분 동안 젤을 실행
      참고: 필요에 따라 원하는 RNA의 내용입니다 ~ 90% 이상, 미니 젤 대리점 젤의 대체에 사용할 수 있습니다.
   10. 저수지에서 액체와 두 번 아래로 pipetting으로 각 로드 웰 스 워시. 우물에 1.1.5 단계에서 원유 RNA를 추가 합니다. 크 실 렌 cyanol FF 염료 (밝은 파란색) 전달 젤의 길이 (~ 60 분)의 대략 2/3까지 20 W에 젤을 실행 합니다.
       참고: 우물의 높이의 1/3 더 이상 로드 확인 (필요한 경우 여러 개의 우물을 사용).
   11. 담가 안전의 1:10,000 희석 1 x TBE 버퍼에 젤 젤을 위해 충분히 큰 용기에 ( 재료의 표참조)를 염색. 80 rpm에서 5 분 동안 궤도 셰이 커에 컨테이너를 넣어.
   12. UV 빛에서 원하는 RNA 밴드를 식별 하 고 신속 하 게 깨끗 한 면도날을 사용 하는 젤의 얇은 밴드를 잘라 합니다. 1.7 mL 튜브에 1-2 젤 분할 영역을 배치 합니다.
   13. 수동 차입 하 여 젤 조각에서 RNA를 복구할. 각 튜브를 적절 한 차입/강수량 믹스 (조각 당 ~0.3 mL) 추가: 0.3 M NaOAc (pH 5.2), 2.5 M LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) DEPC 처리 물에. 16 h 4 ° C에서 젤 splice(s) 포함 된 튜브를 회전 합니다.
       참고: 일반적인 복구 속도가 ~ 75%가이 단계 에서입니다. 수확량을 증가 하 고는 eluent 수집 및 차입 버퍼의 동일한 볼륨을 추가 다음이 단계를 반복.
   14. 새로운 1.7 mL 튜브에서 eluent 결합. 얼음 처럼 차가운 EtOH x 2.5를 추가 하 고, 액체를 혼합 하는 튜브 6 번 반전-80 ° C 1 시간 이상에서 튜브를 배치.
   15. 10000 x g 와 4 ° C에서 10 분 원심 분리기 조심 스럽게 pipetting으로 상쾌한 제거. 80%를 추가 하 여 RNA 펠 릿을 세척 EtOH (관 당 1 mL), 소용돌이 15 s, 및 10000 x g 와 4 ° C에서 10 분 원심 분리기
   16. 상쾌한을 제거 하 고 10 번 위아래로 pipetting으로 RNase 무료 물, 믹스의 5 분 추가 50 μ의 RNA 펠 렛 건조. RNA 농도 0.10 μ g/μ를 정상화. -80 ° c.에 순화 된 RNA를 저장
       참고: -RNA 펠 릿을 건조 하지 마십시오.
   17. 필요한 경우, RNA의 품질 분석, 희석 1 μ (100 ng) 2 x TBE 요소 샘플 버퍼의 5 μ와 물과 혼합의 단계 5에서 1.1.16 μ에서 RNA의. 그런 다음 3 분 및 부하 6 %TBE 요소 미니 젤에 70 ° C에서 열.
       1. 1.1.11 단계에서 완료 얼룩 180 V 1 h. 수행에서 젤을 실행 합니다. 이미징 시스템에서 UV 젤을 시각화. 단일 밴드는 원하는 길이 예상 된다.
2. ³²P 표시 된 입문서를 준비
   1. 다음과 같은 재료를 혼합 하 여 반응 설정: γ-³²P-ATP의 10 μ (~1.5 mCi, 25 μ M, 재료의 표참조), 반전 녹음 방송 (RT) 뇌관 (100 μ M, 시퀀스 참조 하십시오 표 1)의 2 μ, 10 x T4 polynucleotide 키 니 아 제 (PNK)의 2 μ 반응 버퍼, T4 PNK의 1 μ ( 재료의 표참조), 그리고 5 μ RNase 무료 물. 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
      주의: 적절 한 보호 단계 1.2-1.5 방사성 물질에 대 한 권한이 있는 작업에 대 한 필요는.
   2. 열-65 ° c.에 20 분 동안 비활성화 1 분 2 x TBE 요소 샘플 버퍼의 25 μ는 eluent 믹스에 대 한 1000 x g에 염 열 및 원심 분리기에 샘플을 추가 합니다. .
      참고: 그것은 즉시 정화 하는 경우-20 ° C에 레이블이 원유 제품을 저장 합니다.
   3. 20 W 1 h 10% 아크릴 아 미드 젤을 실행 합니다.
      주의: 1.2.1 젤에 단계에서 ³²P 표시 된 입문서를 로드 하 고 최고의 저수지로 방사능 출혈 방지. 젤에 얇은 밴드를 되도록 잘의 높이의 1/3 이상 로드 되지 않습니다 (필요한 경우 여러 개의 우물을 사용). 아래쪽 저수지에서 액체는 높게 방사성 일 수 있다.
   4. 젤 카세트의 유리 접시를 제거 하 고 플라스틱 랩의 조각에 젤을 하다. 빵빵한 샌드위치를 만들어 젤의 상단을 충당 하기 위해 플라스틱 포장을 접어. 칼슘 tungstate 인광 체 스크린에 젤 샌드위치를 놓고 이미징 장비를 노출 합니다. 젤의 가장자리 어디 인지를 일반 빛으로 다시 젤 이미지.
   5. 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 두 개의 이미지를 오버레이. 인쇄 된 이미지에 젤을 맞춥니다. 신선한 면도칼 블레이드를 사용 하 여는 젤 원하는 밴드를 잘라. 1.7 mL 튜브에 1 ~ 2 젤 분할 영역을 배치 합니다.
      참고: 인쇄 된 이미지는 실제 젤으로 같은 크기 다는 것을 확인 하십시오. 두 번 다시 젤 조각 절단 후 남은 젤을 이미징 하 여 맞춤을 확인 합니다.
   6. 다음 단계로 1.1.13 1.1.16 ³²P 표시 된 입문서를 복구 합니다. 0.4 mL 튜브에 솔루션의 1.0 μ를 1.0 μ ~ 100000 cpm에서의 방사능을 얻기 위해 1 x 테 버퍼 뇌관을 희석. RNA 2'-오 수정 반응까지 하지만 4 주 보다는 더 이상에 대 한 정화 ³²-80 ° C에서 P 표시 된 입문서를 저장 합니다.
3. 작은 분자 바인딩 및 RNA 2'-오 수정
   1. 4 개의 샘플을 준비 하려면 추가할 8 pmol RNA 0.5 x 테 버퍼의 32 μ에 1.7 mL 튜브, 2 분, 그리고 스냅-멋진 적어도 1 분 동안 얼음에 80 ° C에서 열.
      참고: 다음 방정식을 사용 하 여 RNA의 대략적인 분자량 계산: MW (#의) = 340 다 x.
   2. 20 mM MgCl₂, 및 500 mM NaCl 500 mM HEPES (pH 8.0)를 포함 하는 혼합을 접는 x 5의 8 μ를 추가 합니다. 각 4 개의 PCR로 RNA 혼합물의 aliquot 9 μ 튜브 하 고 그들에 레이블 #1-#4. #1 튜브, #2에 집중 된 작은 분자 솔루션 (10 %DMSO)의 1 μ로 1 μ 10 %DMSO 추가 희석된 작은 분자 솔루션 # 3 (10 %DMSO)의 1 μ 그리고 # 4에 물 1 μ.
   3. 30 분 동안 열 cycler에서 37 ° C에서 PCR 튜브를 품 어.
   4. 2'-오 수정 반응 앞 0.5 M 작업 솔루션을 DEPC 처리 물의 3 μ와 NAI 재고 솔루션 (2 M)의 1 μ를 희석. 지체 없이, NAI 솔루션 튜브 #1, # 2와 #3, 작업의 1 μ 그리고 # 4에 25 %DMSO 1 μ를 추가 합니다. 15 분에 대 한 열 cycler에 있는 37 ° C에서 품 어.
   5. 차입/강 수의 100 μ glycogen (15 mg/mL)의 2 μ (단계 1.1.13 레시피 참조), 혼합 1.7 mL 튜브에 각 PCR 튜브에 모든 액체를 전송 추가. 얼음 처럼 차가운 200 증거 EtOH 0.34 mL을 추가 (3 x 볼륨) 각 관으로. 5 s와 장소에 대 한 vortexing에 의해 믹스-80 ° C 냉동 적어도 1 시간에 대 한 관.
      참고: 이 기간 동안 시작 시퀀싱 젤 단계 1.5.1에서에서 사용 하도록 설정 합니다.
   6. G 와 4 ° C x 14, 000에서 15 분 동안 원심 분리기 RNA 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 합니다. 80%를 추가 하 여 RNA 펠 릿을 세척 EtOH 튜브 당 (0.5 mL), 소용돌이 15 s, 그리고 20000 x g 와 4 ° C에서 15 분 동안 원심 분리기에 대 한 다시는 상쾌한을 제거 합니다.
      참고: 필요한 경우,가 거 카운터를 사용 하 여 방사성 펠 렛 튜브에 유지 되도록.
   7. RNase 무료 물 5 분 추가 9 μ의 RNA 펠 렛 건조 하 고 10 번 위아래로 pipetting으로 혼합.
      참고: -RNA 펠 릿을 건조 하지 마십시오. 모든 강 수가이 단계 끝에 해산 될 예정 이다.
4. 마커 준비 및 뇌관 연장
   1. 4 새로운 PCR 튜브로 수정 된 RNA를 전송 하 고 그들에 레이블 #1-#4 이전. 4 추가 PCR 관에 7 μ DEPC 처리 물에 2 pmol 제어 RNA를 추가 하 고 그들에 레이블 #5 ~ #8. 모든 8 개의 튜브에서 방사선된 뇌관 (단계 1.2.6)의 2 μ를 추가 합니다. 5 분, 65 ° C에서 anneal 다음 즉시 열 cycler에서 4 ° C까지 냉각 열.
   2. 추가 실시간 버퍼 x 5의 4 μ ( 재료의 표참조), dithiothreitol (DTT, 0.1 M)의 1 μ와 dNTP 믹스 (10 mM 각) 각 8 PCR 튜브의 1 μ.
   3. DEPC 처리 H₂O 2 μ 관 #1 ~ # 4에 추가 합니다. 추가 ddATP (5 m m)의 4 μ, ddTTP (5 m m)의 4 μ 그리고 ddCTP (5 m m)의 4 μ 튜브 #5 ~ #7, 각각. 튜브 # 8를 ddGTP (5 m m)의 1 μ와 DEPC 처리 물의 3 μ를 추가 합니다. 4 피 펫 혼합 시간.
   4. 열 cycler에서 1 분 52 ° C에서 열. 1 μ 역전사의 추가 ( 재료의 표참조), 다음 4 번 위아래로 pipetting으로 혼합. 20 분 동안 52 ° C에서 반응을 품 어.
   5. 각은 RNA를 튜브 5 M NaOH의 1 μ를 추가 합니다. 5 분 동안 95 ° C에 튜브를 열.
   6. 1 M HCl의 5 μ를 추가 하 고 반복 에탄올 강수량 (1.3.5 단계와 단계 1.3.6), 글 리 코겐 및 액체 전송 제외 하 고.
      참고: "소금 앞"로 알려진 젤 중간 흐림 지역에서 단계 1.4.6 결과 생략.
   7. 5 분 추가 10 μ H₂O의 DNA 펠 렛 건조 고 10 μ 2 x TBE 요소 로딩 버퍼와 10 번 redissolve 위아래로 피 펫. 5 분 동안 70 ° C에서 열 젤에 적재 하기 전에 얼음에 튜브를 놓습니다.
5. 페이지 분석
   1. 8 %polyacrylamide 연속 젤 준비, 단계 1.1.6 1.1.10 다음 수정: 40% 아크릴/bisacrylamide 솔루션 (29: 1) 100 mL를 사용 하 여 8% 아크릴 솔루션을 준비 하 고 시퀀싱 젤 유리 접시 (예를 들어, 46을 사용 하 여 57 cm) x 0.4 m m의 스페이서와 함께.
   2. 1.4.7 단계에서 샘플의 10 μ를 로드 합니다. 65 W 2 h 또는 하단 염료는 젤의 3/4에 도달할 때까지 젤을 실행 합니다.
      참고: 필요한 경우 반복-80 ° C에서 샘플의 나머지 부분을 저장 합니다.
   3. 스페이서를 제거 하 고 부드럽게 주걱을 삽입 하 여 상위 시 유리 접시를 제거 합니다. 젤 커버 대형 필터 종이 놓고 허용 필터 종이에 젤을 살짝 누릅니다. 아래쪽 끝에서 시작, 필터 종이 리프트 하 고 함께 유리 접시에서 젤을 제거.
   4. 필터 종이 함께 젤 전체 젤 (지 향하도록)를 충당 하기 위해 충분히 큰 플라스틱 랩의 조각에 놓습니다. 필터 종이 면이 아래로 향하게 젤 건조 기에 필터 종이/젤/플라스틱 랩 샌드위치를 전송.
      주의: 방사성 물질 오염을 방지 하려면 3 ~ 4 젤 샌드위치 사이 큰 필터 종이의 더 많은 부분을 사용 하 고 젤 건조 기.
   5. 진공으로 1 시간에 70 ° C에서 젤을 건조. 표백 하는 사진 인 저장 화면 카세트에 젤 샌드위치를 전송 합니다. 4-16 h에 대 한 화면에 젤의 방사능 노출.
   6. 이미징 장치 및 중간 해상도 (~ 30 분) 스캔에 형광체 저장 화면을 놓습니다.
      참고: 젤 이미지에 미소 같은 유물 경우 수정 소프트웨어 (예를 들어, 사파)를 사용 하 여 게시 품질에 이미지 처리. 표준 마커 레인 1 뉴클레오티드 2'-오 수정 차선 보다는 마음에 계속.

2. 셀 모양

1. 뇌관 디자인
   참고: 생체 외에서 모양을 달리 셀 모양 식 카세트 디자인 필요 하지 않습니다. 그러나, 최적의 입문서 세트 사용 해야 하며 모양 하기 전에 평가 되어야 한다 실험.
   1. 폭발 기반 뇌관 설계 도구 (예를 들어, 뇌관 폭발)에 의해 적어도 3 개의 독특한 뇌관 쌍을 생성 합니다. 공부 하 고 사전-인간의 세포에 있는 mRNA, 인간 게놈 (하지 transcriptome) 뇌관 쌍 특이성 검사 매개 변수에서 참조 데이터베이스 선택 합니다. 200-1000 기초 쌍 (bp)의 범위에서 amplicon의 크기를 선택 합니다.
   2. RNase A와 protease K의 치료와 함께 회전 열 기반 방법으로 관심의 ~ 10⁶ 세포에서 게놈 DNA를 추출 ( 테이블의 자료 를 참조 하 고 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여). 0.1 μ g/μ 테 버퍼에 순화 된 게놈 DNA를 정상화.
   3. 테스트 PCR 프로토콜 1.1.1, 1.1.2 단계에서 수행합니다.
      참고: 원하는 뇌관 세트 1.8 %agarose 젤에 단일 밴드를 양보 한다.
2. 세포 준비 및 2'-오 수정
   참고: 관심의 사전 mRNA의 풍부를 증가 구성 식 세포 (CMV) 발기인에서 올바른 시퀀스와 minigene 호스트 세포로 페는.
   1. 미리 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1 x 항생제 혼합물에 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 37 ° c.에 포함 된 문화 매체를 따뜻한 50 %confluency 문화 매체에 transfection 이전 24 시간에 종자 293T 세포. 2%로 매체를 변경 항생제 1 ~ h는 transfection 전에 없이 DMEM에서 FBS.
   2. 1 96 잘 접시의 감소 된 혈 청 미디어 ( 재료의 표참조)의 100 μ로 minigene 플라스 미드의 10 μ g을 추가 합니다. 혼합 4 번 위아래로 솔루션 플라스틱
   3. 40 μ transfection 시 약의 추가 ( 재료의 표참조)에 격판덮개의 다른 잘 감소 된 혈 청 미디어의 100 μ로. 최대 플라스틱 및 혼합 4 번 아래로. 5 분 동안 실 온에서 품 어.
   4. Transfection 시 정지에 전체 플라스 미드 솔루션을 추가 합니다. 최대 플라스틱 및 혼합 4 번 아래로. 30 분 동안 실 온에서 품 어.
   5. 전체 DNA를 추가 / 접시에 걸쳐 매체의 표면에 dropwise transfection 시 혼합물. 6-12 h 37 ° C에서 품 어.
   6. 매체를 발음 하 고 부드럽게 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.4, CaCl₂ , MgCl₂, 없이 재료의 표참조)의 5 mL로 한 번 씻어. 트립 신 솔루션의 3 mL와 함께 셀 trypsinize 5 분 동안 실 온에서 품 어.
   7. 접시는 접시의 아래쪽에서 세포 분열을 부드럽게 노크. 중화 문화 매체의 6 mL와 트립 신. 4 분에 대 한 300 x g 에서 centrifuge 고 매체를 제거 합니다.
   8. 반응 매체의 199 μ에 각 샘플에 대 한 ~ 10⁶ 셀 resuspend (1% FBS DMEM에) 및 96 잘 접시에 세포 현 탁 액을 전달. 복합 작업 솔루션의 1 μ와 모든 세 개의 컨트롤 37 ° c.에 30 분에서에서 DMSO의 1 μ 셀을 품 어
      참고: 3 제어 샘플 포함 되어야 한다: NAI, NAI, 및 NAI 변성된 RNA DMSO 제어 부정적인 통제.
   9. 변성 컨트롤 (DC) RNA 및 NAI 부정 컨트롤 제외한 각 샘플을 2m NAI의 10 μ를 추가 합니다. 최대 플라스틱 및 혼합 4 번 아래로. 15 분 부드럽게 흔들어 다시 셀 마다 5 분 중단 번호판에 대 한 37 ° C에서 품 어.
   10. 1.7 mL 튜브와 지체 없이 2 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기로 셀을 전송 합니다. 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 합니다.
   11. 0.4 mL guanidinium 안산의 추가 ( 재료의 표참조). 15 소용돌이 균질에 s. 5 분 동안 실 온에서 샘플을 품 어.
       참고: 샘플은 다음 단계를 진행까지-20 ° C에 저장할 수 있습니다.
3. RNA 추출
   1. Guanidinium 안산 무 균 샘플의 각각 클로 프롬의 0.2 mL를 추가 합니다. 2 분 동안 실 온에서 15 미 품에 대 한 소용돌이.
   2. 12000 x g 와 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기 최고 무색 수성 층 RNA를 포함합니다. 새로운 1.7 mL 튜브에 수성 해결책의 ~ 380 μ를 전송 합니다.
      주의: 오염을 피하기 위하여 interphase를 방해 하지 마십시오.
   3. EtOH의 1.5 x 볼륨을 추가 (570 ~ μ). 15 대 한 소용돌이를 섞어 s.
   4. 600 μ RNA의 RNA 격리 스핀-열에 전송 ( 재료의 표참조). 원심에서 12000 x g 15 미 폐기를 위해 eluent는. 동일한 회전 열에 모든 액체를 통과 하려면이 단계를 반복 합니다.
   5. 0.35 mL RW1 버퍼의 열 세척 ( 재료의 표참조) 나 RDD 버퍼에 RNase 무료 DNase의 15 미 추가 80 μ에 대 한 회전에 의해 ( 재료의 표참조). 20 분 동안 실 온에서 품 어.
      참고: 그것은 모든 DNA 오염 제거에 중요 한입니다.
   6. 그 후 0.35 mL 및 2 x RPE 버퍼의 0.6 mL RW1 버퍼의 열을 씻어 ( 재료의 표참조) 15 회전 하 여 각 단계에서 s. 12000 x g 1 분 동안에 빈 컬렉션 튜브와 스핀 열 centrifuging 여 열 건조.
   7. 열 중심에 RNase 무료 물 32 μ를 추가 합니다. 12000 x g 30에 1 분 원심 분리기에 대 한 품 어를 순화 된 RNA 솔루션의 ~ 30 μ s. 변성된 샘플을 처리 하는 동안-20 ° C에서 샘플을 넣어.
4. 변성된 RNA 제어 준비
   1. 장소 30 µ L RNA 샘플 DC에 대 한 얼음에 1.7 mL 플라스틱 튜브에. Formamide의 50 μ와 300 mM HEPES (pH 8.0)를 포함 하는 DC 버퍼의 15 μ 추가 및 25 mM EDTA 튜브에.
   2. 1 분 동안 95 ° C에서 RNA를 신속 하 게 변성을 열 NAI 재고 솔루션 (2 분), 다음 두 번 혼합 하 고 다시가 열 블록에 튜브를 넣어 영화의 5 μ를 추가 합니다. 추가 1 분 동안 95 ° C에 품 어 다음 즉시 얼음에 튜브를 넣어.
   3. Guanidinium 안산의 0.4 mL를 추가 합니다. 2.3.1–2.3.4 단계를 반복 합니다.
   4. 2 x RPE 버퍼의 0.6 mL와 열 세척 ( 재료의 표참조) 15 회전 하 여 각 단계에서 s. 12000 x g 1 분 동안에 빈 컬렉션 튜브와 스핀 열 centrifuging 여 열 건조.
   5. 열 중심에 RNase 무료 물 32 μ를 추가 합니다. 12000 x g 30에 1 분 원심 분리기에 대 한 품 어를 복구 된 DC RNA 솔루션의 ~ 30 μ s.
5. 뇌관 연장
   1. 2.3.7 2.4.5에서 RNA 솔루션 RNase 무료 물 0.5 μ g/μ로 정상화. 갓 30 mM MnCl₂ 솔루션 MnCl₂∙4H₂O 분말에서 준비 합니다.
   2. 각 샘플에 대 한 RNA 솔루션의 9 μ PCR 스트립에 전송 합니다. 각 관에서 10 mM dNTP의 1 μ와 2 μ M 유전자 특정 뇌관 (GSP)의 1 μ를 추가 합니다. 최대 플라스틱 및 혼합 4 번 아래로. 열 cycler에서 5 분 65 ° C에서 품 어와 ice에 넣어 > 1 분.
      참고: 또는, 임의의 nonamer의 1 μ GSP의 대체에 사용할 수 있습니다.
   3. 각 PCR 튜브에 추가 RT 버퍼 x 10의 2 μ의 혼합물 ( 재료의 표참조), 30 mM MnCl₂, 100mm DTT의 2 μ의 4 μ. 혼합 4 x 위아래 플라스틱. 2 분 동안 42 ° C에 품 어.
   4. 1 μ 역전사의 추가 ( 재료의 표참조). 혼합 4 x 위아래 플라스틱. 42 ° c 3 h에 대 한 열 cycler에서 품 어.
6. 라이브러리 준비 및 차세대 시퀀싱
   1. PCR 반응의 DNA 중 합 효소 1 μ, DNA 중 합 효소 버퍼 x 10의 5 μ를 추가 하 여 설정 ( 재료의 표참조), DMSO, 1.5 μ (10 μ M), 뇌관의 각각 34 μ H₂O, 그리고 단계 2.5.4에서에서 cDNA의 5 μ의 2 μ.
   2. 다음과 같이 열 cycler 설정: 2 분; 1) 95 ° C 단계 2 단계) 95 ° C 30에 대 한 s; 3 단계) 30 60 ° C s; 4 단계) 30 ° C 68 s; 단계 5) 루프 다시 단계로 2 30 사이클; 6 단계) 3 분;에 대 한 68 ° C 및 7 단계) 무한 다음 단계까지 4 ° C에서 개최.
   3. 1.8 %agarose 젤을 사용 하 여는 amplicon 정화.
      참고: PCR 악대는 젤에 단일 밴드로 표시 되어야 합니다.
   4. 표준 조각화 및 문학^6,26에 결 찰 방법을 사용 하 여 라이브러리를 생성 합니다.
   5. 1 x 75 일자형 읽기를 사용 하 여 약 10 백만 생성 하는 차세대 시퀀싱 장비에 시퀀스 샘플 당 읽습니다.
   6. ShapeMapper 및 SuperFold 소프트웨어를 사용 하 여 결과 분석 하는 주에 의해 개발 된 패키지 그룹²⁶.

결과

우리는 이전 변조기를 접합 하는 RNA, SMN-C2, SMN2 유전자의 사전-mRNA의 exon 7에 AGGAAG 모티브로 작용을 SMN C2⁶존재 RNA 구조 변화를 평가 하기 위해 모양 사용 설명 했다. SMN-c 2의 바인딩 사이트는 FDA 승인 센스 oligonucleotide (아소) SMA, 바인딩하고 차단 intronic 접합 소음 기 (ISS) intron 7^27,28 (그림 1A)?...

토론

생체 외에서 모양, 그것이 고품질 동종 RNA 서식 파일을 사용 하 여 중요 합니다. 그러나 T7 전사,, 종종 다른 유형의 시퀀스³⁶을 생성합니다. 특히, ± 1에는 3'-무시할 수 없는 수익률³⁶ 와 뉴클레오티드와 시퀀스는 일반적으로 polyacrylamide 젤 정화에 의해 제거 될 어렵다. 유형이 다른 RNA 템플릿을 때로는 어려운 결과 해석 하는 뇌관 확장 제품의 시퀀싱 젤 프로 파일...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNA oligonucleotide	IDT		gBlock for >200 bp DNA synthesis
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix	Thermo Fisher	F566S
NucleoSpin gel and PCR clean-up kit	Takara	740609.50
MegaScript T7 transcription kit	Thermo Fisher	AM1333	Contains 10x reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase
DEPC-treated water	Thermo Fisher	750023
2x TBE-urea sample buffer	Thermo Fisher	LC6876
40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)	Bio-Rad	1610146
10x TBE buffer	Thermo Fisher	15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit	Thermo Fisher	166-0045
Kimwipe	Kimberly-Clark	34133
TEMED	Thermo Fisher	17919
SYBR-Safe dye	Thermo Fisher	S33102
6% TBE-urea mini-gel	Thermo Fisher	EC6865BOX
ChemiDoc	Bio-Rad
T4 PNK	NEB	M0201S
γ-32P-ATP	Perkin Elmer	NEG035C005MC
Hyperscreen™ Intensifying Screen	GE Healthcare	RPN1669	calcium tungstate phosphor screen
phosphor storage screen	Molecular Dynamics	BAS-IP MS 3543 E
Amersham Typhoon	GE Healthcare
NAI (2M)	EMD Millipore	03-310
GlycoBlue	Thermo Fisher	AM9515
SuperScript IV Reverse Transcriptase	Thermo Fisher	18090010	Contains 5x RT buffer, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM)	Thermo Fisher	R0192
ddNTP set (5 mM)	Sigma	GE27-2045-01
large filter paper	Whatman	1001-917
Gel dryer	Hoefer	GD 2000
QIAamp DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51104	Also contains RNase A and protease K
SMN2 minigene34	Addgene	72287
Heat inactivated FBS	Thermo Fisher	10438026
Pen-Strep	Thermo Fisher	15140122
Opti-MEM I	Thermo Fisher	31985062
FuGene HD	Promega	E2311
TrpLE	Thermo Fisher	12605010
DPBS without Ca/Mg	Thermo Fisher	14190250
TRIzol	Thermo Fisher	15596018
RNeasy mini column	Qiagen	74104	Also contains RW1, RPE buffer
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Contains DNase I and RDD buffer
Deionized formamide	Thermo Fisher	AM9342
MnCl2•4H2O	Sigma-Aldrich	M3634
random nonamer	Sigma-Aldrich	R7647
SuperScript First-Strand Synthesis System	Thermo Fisher	11904-018	Contains 10x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymerse	Thermo Fisher	12344024
NextSeq500	Illumina
NucAway column	Thermo Fisher	AM10070	for desalting purpose