다양 한 생 화 확 적인 접근을 사용 하 여 소설 CK2 키 기판의 식별

요약

이 프로토콜의 목적은 레이블, 풍부, 및 단백질 키 니 아 CK2 세포 lysate 또는 조직 homogenate 같은 복잡 한 생물학 견본에서의 기판 확인 하는 것 이다. 이 메서드는이 목적을 위해 CK2 생물학의 독특한 측면을 활용합니다.

초록

키 기판 관계의 연구는 이러한 효소와 생리 및 병 적인 상태에서 그들의 다운스트림 목표의 기능에 대 한 완전 한 이해를 얻기 위해 필수적 이다. CK2 여러 세포질 과정에서 포함 된 기판의 수백의 성장 목록을 진화론 보존된 떠들고/트레오닌 키 니 아 제 이다. 다 면 발현 성 속성으로 인해 식별 및 CK2 기판의 종합 세트 특히 도전 하고있다 고이 중요 한 효소의 연구에서 장애물을 남아 있다. 이 문제를 해결 하려면 우리 대상된 농축 및 상 상속 CK2 기판의 식별을 가능 하 게 하는 다양 한 실험적인 전략을 고안 했다. 이 프로토콜은 lysate 셀 또는 조직에는 기판의 특정 thiophosphorylation에 대 한 허용 CK2의 독특한 듀얼 공동 기질 특이성을 활용 합니다. 이러한 기판 단백질은 이후에 alkylated, immunoprecipitated, 및 액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS)에 의해 식별. 우리는 이전 CK2 기판 초파리 난소에서 성공적으로 식별 하이 접근을 사용 하 고 여기 우리가 조사를이 방법의 적응성을 보여주는 인간 세포종 세포에이 프로토콜의 응용 프로그램을 확장 합니다 다양 한 모형 유기 체 및 실험적인 시스템에이 키의 생물학 역할.

서문

단백질 kinases는 신호 변환 폭포의 핵심 요소입니다. 이 효소에 의해 기질 단백질의 인 산화는 세포 분열, 물질 대사, 및 다른 사람의 사이에서 분화 하는 중요 한 이벤트를 규제 하는 생물학 응답 elicits. CK2 편 표현, acidophilic 떠들고/트레오닌 키 니 아 하이 인 간에 게 효 모에서 보존 하 고는 transcriptional 규칙에서 apoptosis^{1 세포 주기 진행에 이르기까지 많은 세포질 과정에 중요 한 역할은 2,3}. 효소는 2 개의 촉매 α의 구성 하는 heterotetramer (또는 α') 소 단위 및 2 개의 규제 β 소 단위⁴. 매우 다 면 발현 성 덧붙여 CK2 두 다른 특이 한 특성의 분석을 복잡 하 게 하는 즉 제정 활동⁵ 와 듀얼 공동 기질 특이성⁶전시 한다. 이 후자의 속성 기질 단백질의 인 산화에 대 한 ATP로 서 GTP를 사용 하는 기능 CK2 endows.

쥐에서 CK2의 촉매 또는 규제 subunits의 유전 삭제 결과 그것은 개발 및 organogenesis^7,8동안 중요 한 역할을 재생을 나타내는 배아 치 사 율. CK2 또한 여러 가지 유형의 암 overexpressed 고 따라서 유망 치료 대상^9,,1011를 나타냅니다. 실제로, 특정 억제제 대상 CK2 키 니 아 제 활동은 현재이 목적^12,,1314에 대 한 조사를 받고. 동안 억제 CK2의 가능한 옵션을 주어진 다 면 발현 성 자연, 대안 이며 아마도 더 합리적인 접근의 특정 암 진행의 기반이 되는 중요 한 CK2 기판 대상 하는 것. 따라서, 포괄적인 신분증과 CK2 기질 단백질의 특정 조직이 나 종양 유형 내에서이 키의 특정 함수를 elucidating 상당한 이점 될 것 이다.

여기, 우리는 셀 또는 조직 lysate 복잡 한 생물학 견본에서 CK2 기판 식별에 대 한 다양 한 생 화 확 적인 방법 설명. 이 프로토콜은 GTP 아날로그 (guanosine 5'-[γ-thio]triphosphate) 다른 생 kinases 사용할 수 없습니다 GTPγS의 사용에 의해 CK2의 듀얼 공동 기질 특이성을 이용. 효과적으로 "레이블" 후속 격리 및 식별에 대 한이 예제 내에서 기판 하 니 수 있습니다.

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프로토콜

참고: 필요한 자료 사용 가능 하 고 제대로 준비 되는지 확인 ( 재료의 표참조).

1입니다. 준비

1. 기계적 조직 샘플 (조직 세포의 용 해 버퍼, 표 1의 100 µ L에 1-2 mg) lyse 세포 (세포의 용 해 버퍼의 350 µ L에서 80-90% 합칠 즉는 10 cm 접시) 실험에 대 한 샘플의 900 µ L의 총 수집 되 고 목표와 교양 또는. 이 볼륨의 아래에서 설명 하는 실험에 필요한 약간의 초과에서 note.
2. 4 ° c.에 3 분 동안 17500 x g 에서 원심 분리 하 여 샘플 다운 스핀 완료 되 면, 각각 3 개의 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브는 상쾌한의 270 µ L을 전송. 약 90 µ L 남아 있을 것입니다. "입력된 컨트롤" 및 새로운 튜브에 장소 사용할 수 40 µ L을 제거 합니다. 얼음에 모든 샘플을 놓습니다.

2. 키 분석 결과: thiophosphorylation 및 알

1. 270 µ L를 포함 하는 것은 다음과 같이 3 개의 튜브 라벨: "니 rxn", "GTPγS만", 및 "PNBM (p nitrobezyl mesylate)만". 니 반응 준비.
   1. "니 rxn" 튜브를 CK2의 (1350 U에 해당) 2.7 µ L을 추가 다음 2.5 mM GTPγS의 2.7 µ L를 추가 합니다.
   2. "GTPγS만" 튜브 2.5 m m GTPγS, 2.7 µ L을 추가 하 고 세포의 용 해 버퍼의 2.7 µ L를 추가 합니다.
   3. "PNBM만" 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 5.4 µ L를 추가 합니다. 모든 튜브 믹스 하 고 다음 즉시 얼음에 장소를 터치 합니다.
2. 30 ° C 물 욕조에 1 분에 대 한 모든 3 개의 튜브를 품 어. 부 화, 다음 모든 3 개의 튜브를 12 mg/mL PNBM의 13.5 µ L를 추가 합니다. 샘플 혼합 반전입니다. 1 시간에 대 한 실 온에서이 샘플을 품 어.
3. 시작 후는 인큐베이션 단계 2.2에서에서, 빨리 과정 약 45 분 소요 가능한 염 열을 준비 합니다.

3입니다. 열 담의 준비

1. 처음 반전 저장 버퍼에 다시 Sephadex G-25 중단 수 지를 여러 번 각 열에 의해 열 (이 예에서는 실험 3)를 준비 합니다. 수 지 클램프 스탠드에 각 열을 연결 하 고 약 5 분 동안 그대로 앉아 시키는 하 여 정착을 허용 합니다.
2. 맨 아래 하단 개방 폐기에 대 한 흐름을 통해 수집 하는 튜브를 중력에 의해 배수 저장 버퍼 수 있도록 열 아래쪽에서 뚜껑을 제거 Sephadex G-25 수 지의 정착에 따라.
3. 일단 저장소 버퍼 고갈 열 equilibrate 위해 세포의 용 해 버퍼의 약 2.7 mL를 추가 합니다. 흐름을 통해 수집 하 고 삭제. 3 회 반복 한다. 최종 평형에 따라 열 단계 4.1에 대 한 준비가.입니다.

4입니다. PNBM의 제거

1. 1 h 인큐베이션 (2.2 단계) 및 열 준비 (3 단계) 완료 되 면 샘플 열에 적용 됩니다. 각 열을 다음과 같이 레이블: "니 rxn", "GTPγS만", 및 "PNBM만". 각각의 열에 각 샘플의 모든 로드. 수집 하 고 흐름을 통해 삭제.
2. 각 열에 세포의 용 해 버퍼의 420 µ L을 추가 하 여 샘플을 씻으십시오. 세포의 용 해 버퍼 필터링 하는 열을 통해 고 폐기를 위해 흐름 통해 수집을 허용 합니다. 이 세척 단계 튜브 샘플의 컬렉션에 대 한 위치에 배치 합니다.
3. 각 열에 세포의 용 해 버퍼의 500 µ L을 추가 하 여 샘플을 elute. 지금 포함 alkylated CK2 기판 및 thiophosphorylated 흐름-통해 수집 합니다.

5. Immunoprecipitation: 1 부

1. 각각 elutions ("니 rxn", "GTPγS만", 및 "PNBM만")의 각 단계 4.3에서에서 수집에서 "차입 입력 제어" 샘플에 대 한 첫 번째 제거 80 µ L에 의해 immunoprecipitation에 대 한 샘플을 준비 합니다. 각 샘플에서 80 µ L의 제거, 다음 약 420 µ L 샘플 당 남아 있을 것입니다.
   1. 200 µ L을 포함 하는 2 관으로 각 샘플을 분할. 각 각 튜브 라벨: "니 rxn 안티 thiophosphate 에스테 르", "니 rxn IgG", "GTPγS 안티 thiophosphate 에스테 르", "GTPγS IgG", "PNBM 안티 thiophosphate 에스테 르", 및 "PNBM IgG".
2. 안티 thiophosphate 에스테 르 항 체 안티 thiophosphate 에스테 르 레이블 튜브의 각의 2.8 µ g와 2.8 µ g isotype 제어 항 체 IgG 라는 튜브의 각의 추가 합니다. 2 h 4 ° C에서 회전자에 튜브를 놓습니다.
3. 5.2 단계에서 2 h 외피의 마지막 15 분 동안 단백질 A/G 구슬의 준비를 시작 합니다.

6. 단백질 A/G agarose 구슬 준비

1. 짧게 소용돌이 구슬 되도록 저장 튜브는 완전히 다시 일시 중단. p 200의 끝을 잘라 피 펫 팁을 증가 하기 위하여 깨끗 한 면도날을 사용 하 여 표시기 크기. 피펫으로 100 µ L 당 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브에 immunoprecipitation 구슬 슬러리의. 이 예제에서는 6 튜브의 총 필요 합니다.
2. 17500 x g 4 ° c.에 1 분 동안에 관을 원심 상쾌한을 제거 하 고 삭제. 세포의 용 해 버퍼와 짧게 소용돌이의 200 µ L에 다시 구슬을 일시 중단 합니다. 스핀을 반복 하 고 단계 3 번 세척.
3. 5.2 단계에서 부 화 완료 될 때까지 최종 세척 후 얼음에 비즈를 놓습니다.

7. Immunoprecipitation: 부 II

1. 단계 5.2에서에서 2 h 부 화 후 4 ° c.에 3 분에 17500 x g 에서 샘플 다운 스핀 원심 분리 후 세척된 구슬 튜브를 사용 각 샘플에서 200 µ L을 추가 합니다. 1 시간에 4 ° C에서 회전자에 튜브를 놓습니다.
2. 1 h 부 화에 따라 원심 17500 x g 4 ° c.에 1 분 동안에 관 다음 각 예제에서 상쾌한의 40 µ L을 제거 하 고 "고갈 제어"로 저장 (총 6 관). 상쾌한 및 폐기의 나머지 부분을 제거 합니다. 알아서 하지 구슬을 방해.
3. 세포의 용 해 버퍼 및 vortexing의 200 µ L를 간단히 추가 하 여 샘플을 씻으십시오. 다음 4 ° c.에 1 분 동안 17500 x g 에서 원심 상쾌한을 제거 하 고 삭제. 세척을 반복 하 고 단계 3 번 회전. 알아서 하지 다음이 단계 동안 구슬을 방해.
4. 세척 단계를 완료 한 후 구슬을 포함 하는 각 샘플에 2 x 샘플 버퍼의 50 µ L를 추가 합니다. 다른 모든 샘플에 대 한 샘플 버퍼 x 6의 8 µ L를 추가: "입력된 컨트롤", "차입 입력된 컨트롤" 및 "고갈 컨트롤".
5. 일단 버퍼 튜브, 피펫으로 위쪽 및 아래쪽을 혼합, SDS 페이지를 진행 하기 전에 5 분 동안 95 ° C에서 모든 샘플을 열에 추가 됩니다.

8입니다. 결과의 분석/검증

1. 성공적인 CK2 종속 thiophosphorylation 알을 확인 합니다.
   1. 2.2 단계에서 thiophosphorylation CK2 중재의 효능을 확인 하려면 SDS 페이지와 15-20 µ L "차입 입력 컨트롤" 12.5 %polyacrylamide 젤에 단계 5.1에서에서 수집을 실행 하 여 서 부 럽을 수행 합니다.
   2. 다음 항 체와 세포 막 프로브: 안티-thiophosphate 에스테 르, 안티-CK2α, 및 안티-GAPDH (또는 다른 적절 한 로드 제어). 이 단계에 성공 하면 향상 된 안티-thiophosphate 에스테 르 신호 다른 두 레인 (그림 2)에 비해 "니 rxn" 차선에서 해야 합니다.
2. 시각화 CK2의 풍부한 putative 기판 고 단백질 정체성을 결정 합니다.
   1. Immunoprecipitation 단계 성공한 경우 평가, 별도 12.5 %polyacrylamide 젤에 7.4 단계에서 구슬에서 eluted 샘플의 25-30 µ L를 실행 합니다. 모든 장비는 깨끗 한 장갑을 착용 항상이 단계 동안 오염 최소화를 확인 합니다.
   2. 실험 프로토콜 (그림 3)의 다양 한 단계에서 농축된 단백질을 시각화 하기 위해 블루 Coomassie와 젤 얼룩. 새로운 razorblades를 사용 하 여 신중 하 게 소비 세 독특한 밴드에에서 존재 "니 rxn 안티 thiophosphate 에스테 르 IP" 레인, 그들의 대략 분자 무게를 지적.
   3. 액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) (그림 4)에 의해 단백질 식별이 밴드를 제출 합니다. 확인 된 단백질에 대하여 지시 하는 항 체를 사용할 수 있는 경우 입력, 고갈, SDS 페이지 질량 분석의 결과의 immunoblotting 확인 하 고 IP 분수 수집 프로토콜 (그림 4)의 과정 동안.

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결과

실험 절차의 회로도 그림 1에 제공 됩니다. 기술의 기본으로 phosphoryl 그룹 전송을 위한 GTP를 사용 하 여 CK2의 특이 한 능력 이다. 에 세포 lysate thiophosphorylation 생 CK2 기판의 GTP 아날로그, GTPγS, 함께 exogenous CK2 holoenzyme의 추가. 안티 thiophosphate 에스테 르 항 체를 사용 하 여 immunoprecipitated 수 다음이 특정 기질 단백질에 thiophosphate 에스테 르 moiety를 생성 ?...

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토론

여기, 우리는 복잡 한 생물학 견본에서 단백질 키 니 아 제 CK2의 기질을 식별 하는 데 상대적으로 간단한 생 화 확 적인 방법 설명. 이 프로토콜의 중요 한 단계 CK2의 특이 한 효소 속성에 기반 하 고 GTPγS 및 후속 immunoprecipitation 식별을 사용 하 여 특정 기질 단백질의 CK2 종속 thiophosphorylation를 포함 합니다. 이러한 결과 함께 우리 시연 유틸리티와이 접근의 다양성으로 우리가 지금 인간의 세?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 mg/mL PNBM	Abcam	ab138910	40.5 µL
2.5 mM GTPγS	Sigma-Aldrich	G8634-1MG	5.4 µL
Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-373894	1:1000 for Western blotting
Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-32233	1:1000 for Western blotting
Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody	Abcam	ab22758	1:1000 for Western blotting
Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab92570	Varies (final concentration 2.8 µg for each sample)
Centrifuge pre-set to 4ºC	ThermoScientific	Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436
cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor	Roche	11836170001
Lysis Buffer	See recipe below	See recipe below	30 mL
Normal rabbit IgG antibody (isotype control)	Cell Signaling Technology	2729S	Varies (final concentration 2.8 µg for each sample)
PD MiniTrap Column	GE Healthcare	28-9180-10	3 columns
Protein A/G Plus Agarose Beads	Santa Cruz Biotechnology	sc-2003	600 µL
Recombinant human CK2 holoenzyme	New England Biolabs	P6010S	2.7 µL
Rotator	Labnet: Mini Labroller	Mini Labroller SKU# H5500
T98G human glioblastoma cells	ATCC	CRL-1690
Water bath pre-set to 30ºC	Shel Lab	H20 Bath Series Model# SWB15