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요약

여기, 우리는 3 차원 기본 조직 특성화 및 전 비보 문화에 대 한 환자 파생, 수술 excised, fibrovascular 직물을 사용 하 여 증식 성 당뇨 망막 증의 병 태 생리학을 공부 하는 프로토콜을 제시. Ex vivo 문화 모델이 테스트 또는 새로운 치료법 개발에 대 한 의무가 이기도 합니다.

초록

당뇨병 성 망막 증 (DR)은 당뇨병의 가장 일반적인 microvascular 합병증 그리고 최고의 중 하나 일 나이 성인 실명의 원인. 당뇨병과 산소 유도 된 망막의 없음 현재 동물 모델 개발 인간의 증식 당뇨 성 망막 증 (PDR)에 전체 범위의 진보적인 변화. 따라서, 질병의 병 인 및 병 태 생리학의 이해 조직학 단면도 유리 샘플만 포함 된 병원 성 요인에 정상 상태 정보를 제공 하는 방식에서의 사용에 크게 의존 했다. 증거를 증가 나타냅니다 동적 셀 및 3 차원 (3D) microenvironments의 맥락에서 세포-세포 외 기질 (ECM) 상호 작용의 개발 쪽으로 기계 및 기능 연구에 대 한 필수적인 새로운 치료 전략입니다. 따라서, 우리는 안정적으로이 치명적인 질병의 세포 및 분자 메커니즘을 해명 소설 임상에 대 한 가능성을 테스트 하 고 병 적인 fibrovascular 조직 수술 PDR와 눈에서 excised 활용할 수 가설 개입입니다. 이 끝 우리 수술 excised 환자 파생 fibrovascular 조직 (FT), 인간의 PDR 이상의 관련 모델 될 것입니다의 비보 문화 전 3D에 대 한 새로운 방법을 개발. FTs는 explants로 해 부하 고 ex vivo 문화 및 3D 특성에 대 한 섬유 소 매트릭스에 포함 된. 네이티브 FTs 및 끝점 문화 전체 마운트 면역 형광 수 조직 구성과의 잠복 관련 기능에 대 한 3 차원 조직 수준 특성의 중요성을 강조 하는 다세포 프로세스의 철저 한 조사 PDR 이상입니다. 이 모델은 동적 PDR 조직 아키텍처와 microenvironment 내 생 화 학적 및 물리적 상호 작용의 복잡 한 맥락에서 분자 메커니즘, 세포/조직 프로세스 및 치료 응답의 동시 평가 허용할 것 이다. 이후이 모델이 PDR 이상, 그것은 또한 새로운 치료법을 개발 또는 테스트에 대 한 의무가 있을 것입니다.

서문

박사는 당뇨병, 지난 3 년간1에서 거 대 한 비율에 도달 했습니다 질병의 심각한 안구 합병증. 20 년 후 일 나이 성인2실명의 원인 진단, 타입-1 당뇨병과 망막 질환, 당뇨병 라기보다 하나의 주요의 만들기의 유형 2 당뇨병 현재 징후와 환자의 60%와 거의 모든 환자. Microvascular 변성 및 허 혈 성 손상의 수준에 따라 박사는 비 증식 박사 (비 PDR) 및 증식 박사 (PDR)으로 분류 됩니다. 말기 질환, PDR, 허 혈 및 염증 유발 neovascularization 및 vitreoretinal 인터페이스에서 거리 응답 특징 이다. 치료 되지 않는 조건에서 이러한 프로세스는 유리 체 출혈, 망막 증, 망막 tractional 및 신생 녹 내장3,4실명 이어질 것입니다. 최근 발전에도 불구 하 고 현재 치료 옵션 대상만 박사 단계, 망막 손상에는 이미 일어 났 죠 때 당뇨 황 반 부 종 및 PDR, 포함 한. 또한, 박사 환자의 큰 비율 현재 치료 armamentarium, 향상 된 치료4,,56에 대 한 긴급 한 필요를 나타내는에서 혜택 하지 않습니다.

다른 여러 나n vivo 질병/개발 모델 및 당뇨병 동물 모델 개발 되었습니다 날짜, 하지만 그들 중 누구도 인간의 PDR7,8관찰 pathologic 기능의 전체 범위. 또한, 증거를 증가 시키는 치료 응답 ECM 구성으로 공간 배열 및 세포질이 고 acellular microenvironment9사이의 상호 작용에 밀접 하 게 연결 되어 있는지 나타냅니다. 우리는, 그러므로, 일반적으로 vitrectomy PDR10의 외과 관리의 일환으로 진행 하는 눈에서 excised 피트 병 적인 소재를 활용 하 여 인간의 PDR의 임상 관련 모델 개발에 착수.

이 원고 vivo 문화 전 3D에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 수술 excised PDR의 환자-파생 된 병 적인 피트. 여기 설명 하는 방법은 네이티브 3D PDR 조직 풍경의 성공적인 해체 하 고 재현 부 PDR 이상 신생 등의 비정상적인 거리 응답의 특징의 최근 간행물에서 사용 되었습니다. 혈관 구조11. 이 모델은 또한 소설 기능 수 없습니다 쉽게 평가 될 얇은 조직학 섹션에서와 같은 공간을 국한 apoptosis와 확산 뿐만 아니라 혈관 섬 형성11을 공개 했다. 유리 같은 액체는 성공적으로 사용 되었습니다 다른 사람에 의해 3D 내 피 회전 타원 체 문화는 신생 잠재력을 평가 하 고 angiostatic 분자12의 효능에. 생체 외에서 3D 림프 내 피 세포 (LEC) 회전 타원 체 흥분 제 PDR 유리를 사용 하 여 분석 결과 돋 아와 결합 하면, 우리의 모델 두 성 vitreal의 기여 요인 as에 신생 조직 내에서 뿐만 아니라 로컬 단서 공개 아직 불완전 하 게 이해 LEC 참여 PDR 이상3,11. PDR의 관리에 vitreoretinal 수술 정기적으로 수행이 아직 어려운 절차 이다. 수술 기기 및 기술을 볼 수 있습니다 지속적인 발전과 세련, fibrovascular 증식 견본의 보수와 적시 제거 뿐만 아니라 비전 결과 향상 하지만 또한 귀중 한 조직에 대 한 자료를 제공 합니다 살아있는 인간의 조직 microenvironment의 복잡 한 변환 측면에서 PDR 이상과 치료 응답의 조사.

프로토콜

이 연구는 제도적 검토 보드와 헬싱키 대학 병원의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 서명 된 동의 각 환자에서 얻은 했다.

1. 솔루션, 미디어 및 장비 준비

  1. 신속한 처리를 보장 하기 위해 fibrovascular 조직 (FT)의 컬렉션에 이전 다음 장비를 준비 합니다.
    1. 멸 균 압력솥 2 서의 핀셋
    2. 1 미리 무게 PBS 태블릿 (0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.010 M 포4-3) 이온된 수와 해산 저 어 900 mL에 용 해 하 여 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1을 준비 합니다. 1 L 및 멸 균 압력솥 준비 솔루션 물 볼륨을 조정 합니다. 실시간에 저장소
    3. 위에서 언급 한 솔루션 및 단일-사용 무 균 메스, 살 균 6 cm 세포 문화 접시와 5 살 균 12-잘 세포 배양 배지는 바구니에 장비를 수집 합니다.
  2. HBSS, 적어도 1 시간 동안 37 ° C에 물 목욕으로 몰입 50 mL 튜브를 사용 하 여의 5 mL로 플라스 미노 겐 고갈 인간의 fibrinogen의 30 mg를 용 해 하 여 6 mg/mL fibrinogen 솔루션에서 행 크 스 균형 소금 솔루션 (HBSS)을 준비 합니다.
    참고:이 솔루션 수 보관 7 h (최대 10 h)에 대 한 물 목욕 (37 ° C)에서 사용 하기 전에.
  3. 전 준비 추가 하 여 5% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 또는 5% 인간 혈 청, 0.4% 내 피 세포 성장 보충, 10 ng/mL 재조합 인간 표 피 성장 인자, 1 μ g/mL 날린, 그리고 상업적으로 사용 가능한 50 μ g/mL gentamycin vivo 문화 매체 내 피 세포 성장 매체 그리고 사용까지 37 ° C에 물 목욕에 계속. 한 달에 4 ° C에서 저장 합니다.

2. fibrovascular 조직 해 부

  1. 수술 트랜스 conjunctival microincision vitreoretinal, PDR의 vitreoretinal 외과 관리의 일환으로 23 또는 20 게이지 3 포트 동위 플 vitrectomy에 의해 인체에서 excised 되었습니다 fibrovascular 조직 (FT)를 수집 합니다.
    참고: FT 세분화 및 박, 잘라 intraocular 끝 창과 microforceps와 유리 같은 구멍에서 제거와 microscissors, 필요 경험된 vitreoretinal 외과 의사에 의해를 사용 하 여 excised입니다. 극단주의 시 신경 또는 병 적인 신생 조직이 가장 일반적으로 위치한 일시적인 혈관 아케이드를 포함 하 여 눈 구조에 손상을 초래 하지 않고 그대로, 손상 되지 않은 피트를 제거로 이동 해야 합니다. 삭제 조직의 크기는 변수, 보통 3와 50 m m2까지인.
  2. 6 cm 세포 문화 접시 또는 젖은 얼음에 살 균 PBS의 1 mL를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 FT를 유지 하 고 즉시 처리에 대 한 실험실 연구에 그것을 전송.
    참고: 연구 단위 (실험실 시설)는 물리적으로 병원 수술 실 (OR)에 가까운 작은 삭제 피트의 전송 시간을 최소화 하기 위해 필수적 이다. 이 경우 전송 5 분 미만 소요 하 고는 explants에에서 포함 된 섬유 소 내에서 일반적으로 1-1.5 h (최대 2 시간) 제거 수술 후. 3 차원 문화에 더 이상 전송 시간의 영향 테스트 해야 합니다.
  3. 실 온 (RT, 25 ° C)에서 PBS의 1 mL를 포함 하는 6 cm 세포 문화 접시에 FT를 놓고 조직 5 배 목표는 거꾸로 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 이미지를 수집 합니다.
    참고: 이미지 문서에 대 한 질적 평가 획득 됩니다. 그것은 조직의 크기, 밀도 및 일반적인 구성 (예: 혈관 구조) 관찰 가능 합니다.
  4. 잘라 FT ~ 1 mm를 직 립 해 부 stereomicroscope, 메 마른 메스와 서 핀셋을 사용 하 여 아래2 조각. 잘 서 트위터를 사용 하 여 장소에 PBS에 빠져들 조직 누른 분명 상처 소독 메스를 사용 하 여 수행 합니다. 이 네이티브 fibrovascular 구조를 변경할 것으로 FT, 찢 어 하지 마십시오.
  5. 살 균 PBS의 1 mL를 포함 하는 12-잘 셀 문화 접시의 각 개별 조각을 넣으십시오.
    참고: 필요한 경우, 부드럽게 상처를 수행 하기 전에 기정 핀셋을 사용 하는 접시에 피트 확산.

3. 네이티브 피트 및 전 비보 문화 특성에 대 한 수직 섬유 소 젤 방울 주조

  1. 멸 균 필터 10 mL 주사기로 탑재 0.22 μ m 필터 단계 1.2 준비 준비 fibrinogen 솔루션.
  2. Fibrinogen 솔루션 (1.5 mL 튜브 당 25 μ)와 실시간 준비 섬유 소에 대 한 약 수에 계속 준비 aliquots 젤 / 모든 포트 조각 해 부, 후 고는 섬유 소를 테스트 하기 위한 추가 aliquots의 몇 젤 형성 있습니다.
  3. 준비 HBSS 트 롬 빈과의 aprotinin, 400 μ g/mL의 4 단위/mL를 포함 하는 솔루션 여기서 따 솔루션, 불리고 많은 TA 솔루션은 절 개 후 얻은 조각 수에 따라 필요에 따라 실시간 준비에서 유지 (25 μ 따 솔루션의 각 사용은 FT/fibrin 젤), 그리고 섬유 소 젤 형성을 테스트 하 고 충분 한 해결책은 섬유 소 젤 방울의 전체에 대 한 추가 금액 (예를 들어, 250 μ).
    참고: 트 롬 빈이 aprotinin FTs13,14에 의해 표현 하는 세포질 프로 테아 제에 의해 섬유 소 젤의 저하를 방지 하기 위해 추가 하는 동안 중 합 섬유 소에 대 한 필요 합니다.
  4. 섬유 소 젤 형성의 타이밍 테스트: 25 μ 따 솔루션 aliquoted 25 μ fibrinogen 솔루션 단계 3.2에서에서 준비의 추가 하 고, 50 μ로 설정 하는 또 다른 피 펫을 사용 하 여, 믹스 pipetting으로 튜브에 6 cm 세포 문화 접시에 분배 직 립 방울 형성.
    참고: 섬유 소 젤 형성 일어나 야 한다 ~ 1 분. 이 분 이상 경우에, 단계 3.3에서에서 준비 타 솔루션에서 트 롬 빈의 농도 더 트 롬 빈 재고 솔루션을 추가 하 여 늘릴 수 있습니다. 트 롬 빈 재고 솔루션의 처음 사용 된 볼륨의 10 분의 1 추가할 수 있습니다, 반복적으로, 1.5 분 이내 발생 하는 섬유 소 젤 형성 때까지. 섬유 소 젤 형성 시간은 문화의 3 차원에 대 한 중요 한 빠른 젤으로 (1.5 분) 이내 형성 방지 섬유 소 젤의 바닥에 침 몰 하 고 따라서 셀의 2D 플라스틱 표면 만남에서 피트 조각 문화 플레이트, 2D 세포 접착 및 파생물 이어질 수 있습니다.
  5. 살 균 족집게를 사용 하 여 24-잘 접시의 한의 센터에 피트 한 조각 놓고 FT에 흡입 힘을 피하기 위해 0.5-10 μ 피 펫과 pipetting으로 어떤 초과 PBS를 제거 합니다. 경우에는 조직은 트위터에, 추가 트위터를 사용 하 여 조직 조각 접시에 배치 원조.
    참고: FT/섬유 소 젤 또한 시 약의 사용량을 줄이기 위해 48-잘 접시에 캐스팅 될 수 있습니다. 그러나, 이것은 더 많은 도전으로 공간은 더 제한 된 섬유 소는 잘 벽에 접촉으로 오는 경우 확산 됩니다.
  6. 25 μ fibrinogen 솔루션 단계 3.2에서 aliquoted TA 솔루션의 25 μ를 추가 하 고 다른 피 펫을 사용 하 여 설정 관에서 50 μ 믹스 pipetting. 잘, 접시에 배치 피트 조각에 분배 고 2-3 위 피 펫 FT에 3D 주변 매트릭스를 제공 하는 직 립 방울 내 피트 조각을 포함 하기 위하여.
    참고: 확인 FT pipetting 동안 발음 하지 아무 공기 방울 형성 된다. 또한 그 혼합, 분배 및 pipetting 수행 됩니다 신속 하 게 섬유 소 젤 1.5 분 이내 양식 것 이다 단계 3.4에서에서 테스트 확인 합니다. 48-잘 접시에 섬유 소 젤을 캐스팅 하는 경우 fibrinogen 솔루션의 20 μ와 타 솔루션의 20 μ 대신 사용 합니다.
  7. 모든 포트 조각에 대 한 3.5-3.6 단계를 반복 합니다.
  8. 5% CO2습도 분위기에서 37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에 접시를 배양 하 여 응고 섬유 소 젤을 허용 합니다.
  9. 0.5-1 h, 체크 섬유 소 젤 완전히에 의해 신중 하 게 형성 되는 접시를 기울이기. 접시를 기울이면, 나타내는 섬유 소 젤 형성 완료 되는 젤이 움직이지 않는 때 3.10 단계로 진행 합니다.
  10. 오버레이 FT/섬유 소 젤와 ex vivo 문화 매체 (600 μ/24-잘 접시에 잘) 또는 300 μ/48-잘 접시에 잘 100 μ g/mL aprotinin 보충. Drop-wise 분배 하 여 매체를 부드럽게 플라스틱.
    참고: 여기, aprotinin 사용 됩니다 섬유 소 젤의 저하를 방지 하기 위해 FTs13,14에 의해 표현 하는 세포질 프로 테아 제에 의해. ex vivo 문화 매체 또한 보완 될 수 있습니다 VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ 등 재조합 성장 인자와 함께 (참조 테이블의 재료)11.
  11. 원하는 시간 동안 (예를 들어, 2 월 18 일, 기간 테스트할 필요가 있을 것 이다 더 이상 문화) 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터 및 문화에 다시 비보 문화 접시 전 피트를 놓습니다. 3 일 마다 신선한 ex vivo 문화 매체와 매체의 50%를 교체 합니다.

4. "매트릭스"에서 영상

  1. (0 일) 같은 날 비보 문화 전 피트의 이미지를 수집 하 고 설정 된 간격 (예: 매일)를 사용 하 여 거꾸로 epifluorescence 현미경, 3D 성장에 따라.
    참고: 가져온 이미지 사용할 수 있습니다 두 개의 수직 직경의 총 길이로 피트 파생물의 정량화에 대 한 explant11에서.

5. 네이티브 피트 및 전 비보 문화 끝점

참고: FT/섬유 소 젤 원하는 기간 (ex vivo 문화 FT)에 대 한 비보 전 경작 하거나 네이티브 피트 특성화11같은 날 (네이티브 FT)에 고정 될 수 있습니다.

  1. 네이티브 피트 또는 vivo 문화 전 피트 1 mL/PBS 솔루션, 실시간에서 1 시간에에서 4 %paraformaldehyde 문화 매체를 대체 하 여 수정 네이티브 FT/섬유 소 젤, 0.5-1 수정 전 추가 후 h 비보 문화 매체 (섬유 소 젤 하지 중간에 배어 되어 있다, 고정 됩니다 손상 그들).
    참고: paraformaldehyde 이다 부식성, 독성 및 발암 성 증기 두건에서이 단계를 수행 합니다.
  2. PBS에와 3 5 분 세척 FT/섬유 소 젤을 씻어 (2 mL/음).
  3. 2 mL / 0.02% 나트륨 아 지 드를 포함 하는 PBS의 PBS를 장착 하 고 추가 처리까지 4 ° C에서 고정된 섬유 소 젤을 저장. FT/섬유 소 젤 저장소에 건조 하지 않습니다 보장 하기 위해 파라핀 영화와 함께 접시를 봉인.
    참고: 나트륨 아 지 드는 독성 증기 두건에서이 단계를 수행 합니다.

6. 전체-마운트 면역 형광 염색

참고:이 프로토콜 5 일을 지속 하 고 밤새 외피와 함께 중단 될 수 있습니다 어디에 표시. 섬유 소를 젤 어느 시점에서 건조 하지 마십시오. 모든 단계는 명시 되지 않는 한 RT에서 수행 됩니다.

  1. 얼룩 프로토콜을 시작 하기 전에 다음과 같은 솔루션을 준비 합니다.
    1. 후 고정 솔루션: 같은 양의 아세톤과 메탄올을 혼합 하 여 50: 50 아세톤: 메탄올 솔루션을 준비 (예를 들어, 50 mL). -20 ° c.에 게 하루 전에 얼룩에 최신이 솔루션을 준비 합니다. 이 솔루션은-20 ° C에 다시 저장할 수 있습니다 하 고 후속 stainings에 사용할 수 있습니다.
      참고: 아세톤과 메탄올은 인화성 및 건강에 유해 증기 두건에서이 솔루션을 준비 합니다.
    2. 차단 솔루션: 준비 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 0.3 %octyl 페 놀 ethoxylate 솔루션 PBS에서 첫 번째 추가 15% FBS PBS에. Octyl 페 놀 ethoxylate를 추가 하 고 해산 저 어. 4 ° c.에 게
      참고:이 솔루션 준비 수 있습니다 될 큰 금액에서 사전에-20 ° C에서 15 mL aliquotes에 저장 하 고 얼룩 프로토콜을 시작 하는 날에 사용 하기 전에 해 동. 갓 또는 갓 해 동 aliquote를 사용 하 여 각 얼룩 프로토콜에 대 한.
    3. 세척 솔루션: 0.45 %octyl 페 놀 ethoxylate ethoxylate octyl 페 놀의 4.5 mL PBS의 995.5 mL에 추가 하 여 보충 하는 PBS의 1 리터를 준비. 분해를 저 어. 실시간에 저장소
  2. 스테인리스 스틸 광장 예리하게 주걱을 사용 하 여 접시에서 신중 하 게 방울을 들어올립니다. 센터, 운동 하기 전에 가장자리에서 먼저 드롭릿에 분리 하 고 PBS의 1 mL를 포함 하는 12-잘 접시의 전송.
    참고:이 판 형태로 후 정착, 세척 및 차단 단계를 수행 합니다.
  3. 후에 방울 1 mL ~ 1 분 (작은 물방울의 테두리 흰색 바뀝니다) 얼음 처럼 차가운 50: 50 아세톤: 메탄올 솔루션을 수정.
    참고: 아세톤과 메탄올은 건강에 유해 증기 두건에서이 단계를 수행 합니다.
  4. 2 ml PBS (방울 싱크대 것입니다 PBS 솔루션에 완료 되 면 재)의 3-5 세척 린스 합니다.
    참고: 포스트 고정 후 그들은 플라스틱 끈 적으로 피 펫 팁과 방울을 만지지 마십시오. 프로토콜을 통해 발음 후 수정, 항 체를, 및이 손상 될 수 있습니다 또는 작은 물방울을 완전히 파괴, 흡입 하 여 솔루션을 세척 하지 마십시오. 대신, 접시를 기울기 고 신중 하 게 500-5000 μ 피 펫을 사용 하 여 솔루션을 제거 합니다.
  5. 21000 x g와 4 ° C에서 15 분 동안 차단 솔루션 파편을 제거 하기 위해 원심.
    참고: 솔루션 원심 분리에 대 한 1.5 mL 튜브에 aliquoted 수 있습니다. 사용 하지 않는 솔루션 4 ° C에 저장 하 고 모든 관련 후속 단계에 사용할 수 있습니다.
  6. 500 μ에 물방울을 품 어 실시간에서 2 h에 대 한 솔루션을 차단
    참고: 사용 하는 솔루션을 차단의 볼륨을 줄이기 위해 접시 기울이면 수 있습니다 지원에 고 솔루션/드롭릿은의 약간 300 μ를 사용할 수 있습니다.
  7. 솔루션 및 원심 분리기 21000 x g 15 분 및 4 ° c.에 대 한 차단에 적합 한 희석에서 1 차적인 항 체 혼합물 (적어도 30 μ/드롭릿은) 준비
  8. 라운드 (U)으로 작은 물방울 전송-라운드 모서리 주걱을 사용 하 여 96 잘 접시를 바닥 및 4 ° c.에 하룻밤 1 차적인 항 체 혼합물의 적어도 30 μ/드롭릿은 함께 품 어
  9. 다음 날, 전송 12-잘으로 물방울 접시 세척 솔루션/잘 포함 2 mL에 린스 3 5 분 첫 번째 그리고 9 30 분 세척을 씻어. 밤새 4 ° c.에 마지막 세척 (2 mL)를 두고
  10. 다음 날, PBS로 3 번을 씻어 하 고 라운드 (U)으로 작은 물방울 전송-96 잘 접시 바닥.
  11. 세척, 동안 차단 솔루션 및 21000 x g와 4 ° C에서 15 분 동안 원심 분리기에 적절 한 fluorophore 활용 된 이차 항 체 혼합물 (희석된 1: 500, 적어도 30 μ/드롭릿은) 준비
  12. 라운드로 작은 물방울 전송 (U)-라운드 모서리 주걱을 사용 하 여 96 잘 접시를 바닥 및 4 h RT, 빛 으로부터 보호에 대 한 2 차 항 체 혼합물의 적어도 30 μ와 품 어.
    참고: 모든 후속 외피와 세척 단계 빛 으로부터 보호를 수행 합니다.
  13. 솔루션/잘 라운드 모서리 주걱, 3 5 분 세척과 린스를 먼저 사용 하 여 세척의 그리고 4 개의 30 분 세척 2 mL를 포함 하는 12-잘 접시에 방울을 전송 합니다. 밤새 4 ° c.에 마지막 세척 (2 mL)를 두고
  14. 다음 날, 5 30 분 세척으로 젤과 PBS 가진 다음 3 번 씻어. 밤새 4 ° c.에 마지막 세척 (2 mL)를 두고
  15. 다음 날에는 라운드로 작은 물방울 전송 (U)-실시간에 30 분 동안 10 μ g/mL Hoechst 핵 얼룩 (적어도 30 μ/드롭릿은)와 함께 배양 하 여 라운드 모서리 주걱 counterstain 핵을 사용 하 여 96 잘 접시 바닥
    참고: 중간 보충 4'를 탑재, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 핵 counterstaining에 대 한 대 안으로 사용할 수 있습니다. 어떤 경우에,이 단계와 단계 6.16는 생략, 직접 단계로 6.17 진행.
  16. 2 mL의 PBS/라운드 모서리 주걱을 사용 하 여 포함 된 12-잘 접시에 작은 물방울 전송 및 PBS로 세 번 씻어.
  17. 다음과 같이 현미경 슬라이드에 방울을 탑재.
    1. 사각형 모양의 22 x 22 mm coverglass의 가장자리에 빠른 경화 설치 매체의 좁은 레이어를 적용 하 고 ~ 1 분 동안 건조 하자. 이 단계를 수행이 각 강하 개별적으로 설치 매체의 과도 한 경화를 방지 하려면.
      참고: 빠른 경화 설치 매체는 건강에 유해 증기 두건에서이 단계를 수행 합니다.
    2. 이온된 수의 2 개 mL를 포함 하는 12-잘 접시의 우물에 담거 서는 물방울을 헹 구 고 라운드 모서리 주걱을 사용 하 여 현미경 슬라이드에 전송. 흡수 성 종이의 작은 조각을 사용 하 여 초과 물을 제거 합니다.
    3. 분배는 물방울에 비 경화 antifade 장착 매체의 15 μ.
      참고: 또는, Hoechst 핵 얼룩 사용 되지 않은 경우 4'를 포함 하는 매체를 장착 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 사용할 수 있습니다.
    4. 부드럽게 커버 유리는 물방울 이상의 현미경 슬라이드를 직면 하 고 빠른 경화 설치 매체와 놓고 정착 하자.
      참고: 빠른 경화 매체 현미경 슬라이드에 충실 하 고 자리에는 작은 물방울을 유지 것입니다.
  18. 모든 작은 물방울에 대 한 6.17 단계를 반복 합니다. 각 현미경 슬라이드에 두 방울을 탑재 합니다.
  19. 슬라이드 RT에서 ~ 2 시간 건조 하 고 하룻밤 4 ° C에서 저장 하자. 슬라이드는 수평으로 위치 하 고 빛 으로부터 보호 확인 하십시오.
  20. 이미지 스테인드 네이티브 또는 ex vivo 문화 confocal 현미경 또는 광학 단면 함수 및 20 x 40 x 목표를 갖춘 직 립 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 끝점 피트. 타일 함수를 사용 하 여 조직의 더 큰 영역을 한 번에 캡처.

결과

PDR fibrovascular 조직 속성 및 단백질 식의 이해 유리 샘플 및 얇은 조직학 피트 섹션3,15,,1617에 주로 의존 하고있다. 방법을 개발 3D 조직 조직의 철저 한 조사와 PDR의 다세포 physiopathological 프로세스에 대 한 밖으로 설정 우리 수술 삭제, 활용 하 하 환자-파생 병 적인 FTs 3D 특성화 ...

토론

신뢰할 수 있는 기능 셀 및 분자 기계 결과 대 한 관련 조직 microenvironment의 중요성을 고려 하면이 조직 환경을 제공 하는 적절 한 실험 모델을 찾을 수 필수적입니다. 여기 설명 비보 전 PDR 문화 모델을 섬유 소 포함 FTs PDR 임상 샘플의 네이티브, 복잡 하 고 다세포 컨텍스트에서 PDR 이상의 메커니즘의 조사 수 있습니다.

프로토콜 내에서 중요 한 단계는 적절 한 섬유 소 ?...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

저자는 대부분의 의료 및 외과 망막 동료, 간호사와 당뇨병 단위 및 Vitreoretinal 수술 장치 안 과학의 부, 헬싱키 대학 병원 채용에 적극적으로 참여에서 전체 직원에 감사 환자. 영상 시설에 감사 Biomedicum 분자 이미징 장치 하 고. 우리는 우수한 기술 지원을 위한 아나 체르넨코 감사합니다. 이 연구는 핀란드 아카데미 (KL), 헬싱키의 대학 (KL), Sigrid Juselius 재단 (KL), K. 알 요한슨 재단 (KL), 핀란드 암 연구소 (KL), 카롤 린스 카 Institutet (KL), 핀란드 눈 재단 (SL), 눈에서 교부 금에 의해 지원 되었다 고 조직 은행 재단 (SL), 메리와 게오르그 C. Ehrnrooth 재단 (SL), 및 HUCH 임상 연구 보조금 (TYH2016230, SL 후 TYH2018127), 의학 (예)의 박사 프로그램 뿐 아니라 당뇨병 연구 재단 (SL, kl 기를, AK, EG).

자료

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Material
MicroforcepsMedicon07.60.03Used for handling the FTs
Disposable Scalpels - SterileSwann-Morton0513Used for FT dissection
Culture dish, vented, 28 ml (60mm)Greiner Bio-One391-3210Used for dissection and for testing fibrin gel formation
Cell culture plates, 12-wellGreiner Bio-One392-0049Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mLGreiner Bio-One391-3477
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mLGreiner Bio-One525-0384
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDFMilliporeSLGV033RSUsed to sterile-filter the fibrinogen solution
Syringe, 10 mLBraun4606108VUsed to sterile-filter the fibrinogen solution
Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mLFisherFB74031
Cell-Culture Treated Multidishes, 24-wellNunc142475Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture
Cell culture plates, 96-well, U-bottomGreiner Bio-One392-0019Used for whole-mount immunofluorescence
Round/Flat Spatulas, Stainless SteelVWR82027-528Used for whole-mount immunofluorescence
Coverslips 22x22mm #1Menzel/Fisher15727582Used for mounting
Microscope slidesFisherKindler K102Used for mounting
Absorbent paperVWR115-0202Used for mounting
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Reagents
PBS tabletsMedicago09-9400-100Used for preparing 1x PBS
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human PlasmaCalbiochem341578
Hanks Balanced Salt SolutionSigma-AldrichH9394-500MLUsed for preparing the fibrinogen and TA solution
Fetal bovine serumGibco10270106Used for preparing the blocking solution
Human SerumSigma-AldrichH4522Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media
Gentamicin Sulfate 10mg/mlBiowestL0011-100
Endothelial cell media MV KitPromocellC-22120Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,  500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL)
Sodium azideSigma-AldrichS2002Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.
AcetoneSigma-Aldrich32201-2.5L-MUsed to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
MethanolSigma-Aldrich32213Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)Sigma-AldrichT9284Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.
Hoechst 33342, 20mMLife Technologies62249For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Eukitt Quick-hardening mounting mediumSigma-Aldrich03989-100mlTOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Thrombin from bovine plasma, lyophilized powderSigma-AldrichT9549-500UN Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Aprotinin from bovine lung, lyophilized powderSigmaA3428Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
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Growth factors
Recombinant human VEGFAR&D Systems293-VE-01050 ng/ mL final concentration
Recombinant human VEGFCR&D Systems752-VC-025200 ng/ mL final concentration
Recombinant human TGFβMilliporeGF3461 ng/ mL final concentration
Recombinant human bFGFMillipore01-10650 ng/ mL final concentration
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Primary antibodies
CD31 (JC70A)DakoM0823Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10)DakoM716501-2Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)DakoM070129-2Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68ImmunoWayRLM3161Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E)Cell Signalling9664Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111)DakoM731429-2Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAPDakoZ0334Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67Leica MicrosystemsNCL-Ki67pUsed at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1R&D SystemsAF2089Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2MilliporeAB5320Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1ReliaTech102-PA32Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab
Prox1R&D SystemsAF2727Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9)MilliporeMAB3757Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4)SigmaC6198Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated
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Secondary antibodies
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgGLife TechnologiesA-21202Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgGInvitrogenA-11012Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgGThermo ScientificA-11057Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgGThermo ScientificA-11036Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgGMolecular ProbesA-21468Used at 1:500 dilution
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Microscopes
Axiovert 200 inverted epifluorescence microscopeZeissFor imaging of the fresh and fibrin-embedded FT
SZX9 upright dissection stereomicroscopeOlympusFor FT dissection
LSM 780 confocal microscopeZeissFor imaging of whole-mount immunostained FT
AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with ApotomeZeissFor imaging of whole-mount immunostained FT

참고문헌

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