검출 하는 혈 청 알레르기 항 원 특정 면역 글로불린 e (sIgE) 바이오 미세 기술의 응용

요약

이 종이 알레르기 진단에 미세 화학 카트리지 기반 시스템의 유용성 평가와 특정 혈 청 면역 글로불린 E를 탐지 하기 위한 프로토콜을 제공 합니다.

초록

알레르기 질환은 성인과 아이 들 둘 다에 일반적 이다. 원인이 알레르기 증상의 질병 관리 및 예방에 중요 하다. 그러나 높은 가격-성능 비율 특정 면역 글로불린 E (IgE) 측정 시스템은 주치의 병원에서 특히 중국 본토에서에서 부족 한. 이 문서에서는 미세 화학 카트리지 기반 시스템을 사용 하 여 알레르기 관련 IgE 혈 청에서 검출 하는 원리 및 운영 절차를 설명 합니다. 결과 ImmunoCAP (시스템 1), 산업 표준 비교 되었다 고 환자 일반적인 알레르기에 민감하게 감지 시스템의 재현성 평가. 결과는 ImmunoCAP (시스템 1), 비해 BioIC 시스템 (시스템 2)는 좋은 정밀도 및 감도 다양 한 흡입 및 식품 알레르기에 대 한 하지만 훨씬 저렴 한 비용으로 특정 혈 청 IgE 검출에 나타났다. 그것은 낮은 금융 경제성 있는 본토 중국에서 1 차 진료 병원 시스템 1에 좋은 대안이 될 수 있습니다.

서문

알레르기의 유행 지난 수십 년간에서 꾸준히 증가 하 고 세계 인구¹의 20%-30%에 영향을. 원인이 알레르기 증상의 질병 관리에 중요 한 의미가 있습니다. 중국에서는, 등록 된 vivo에서 피부 자식 시험 국가에서 사용할 수 있습니다 이후, 특정 혈 청 IgE의 생체 외에서 결정은 가장 중요 한 도구 일반적으로 사용 되 나 알레르기를 입력^2를진단 한다. 이것은 서방 세계에서 관행 이지만 ImmunoCAP 시스템 (시스템 1), 형광 효소 연결 된 immunosorbent 기본 시스템, 생체 외에서 알레르기 진단³골드 표준으로 인식 되, 비록 중국에 있는 그것의 사용 때문에 매우 제한 된 높은 장비 및 시 약 가격 하. 따라서 높은 가격-성능 비율을 새로운 다른 알레르기 진단 시스템은 나쁘게 필요 합니다.

BioIC 시스템 (시스템 2) 특정 혈 청 IgE의 다중화 분석 실험에 대 한 화학 원리에 따라 미세 카트리지 기반 시스템입니다. 크기는 7 cm x 4 cm, 미세 카트리지는 사출 성형 플라스틱의 3 레이어 구성 됩니다. 상단 부분은 3 m m 두꺼운 투명 폴 리 카보 네이트 열 어셈블리 프로세스 동안 좋은 안정성을 운반입니다. 3 m m 두꺼운 레이어 아크릴로 니트 릴, 부 타 디 엔, 스 티 렌 (ABS)의 공중 합체에서 건설, 함께 그것은 0.5 m m 두꺼운 중간 레이어 실리콘 고무의 만든 샌드위치. 블랙 색상에서 이기 때문에, 중간 계층 화학 탐지 동안 낮은 백그라운드를 제공 합니다. 실리 카 겔 위에 nitrocellulose 막 (NC 멤브레인)의 얇은 층 다른 allergenic 단백질의 야생 수 있는 반응 영역에 해당 하는 위치에 살포 된다. 이 연구의 목적은 혈 청 ige의 알레르기 관련의 다중화 된 결정에 대 한 미세 시스템의 임상 성과 평가 하는 것입니다.

프로토콜

이 연구와 인간의 혈 청 샘플의 사용의 첫 번째 제휴 병원의 광주 의과대학 (GYYY-2016-73)의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 독립적으로 또는 (어린이)의 경우 그들의 부모를 통해 모든 참가자가 그들의 서 면된 동의 주었습니다.

1. 기본 정보 연구 그룹의

참고: 상태 키 실험실의 호흡기 질병 (공기-SKLRD)의 알레르기 정보 저장소는 광저우 연구소 호흡기 병원 (GIRH) 내의 설립 큰 혈 청 은행입니다. 지난 10 년간에서 시작, 공기 SKLRD 이미 수집 하 고 그들의 임상 정보 (표 1)^4,5함께 알레르기 질환을 가진 환자에서 혈 청 샘플을 저장 하기 시작 했다. 현재 연구는 공기-SKLRD에서 세라와 함께 수행 되었다.

1. 6 월 2018 년 1 월 2015에서 수집 하는 세라에 대 한 공기-SKLRD의 데이터베이스를 검색 하 고 지역에서 일반적인 알레르기에 민감한 것을 발견 했다 알레르기 질환을 가진 환자를 선택 합니다.
2. 모든 선택 된 환자는 알레르기 관련 질환, 알레르기 비 염 및 천식, 알레르기 성 피부염, 두 드러 기, 등 여러 혈 청 알레르기 항 원 특정 면역 글로불린 E (sIgE)이 환자의 혈 청에 포함 되어 있는지 확인 시스템 1에서 검색 하는이 지역에서 일반적인 알레르기의 sensitizations.
3. 그 후속, 과학적 목적, 그는 확인 된 면역 결핍, immunotherapy에 현재 그에 대 한 그들의 혈 청 샘플의 사용에 관한 동의 제공을 거부 하는 사람들을 잃은 불완전 한 의료 기록, 환자 제외 또는 immunomodulatory 에이전트, 또는 그 기생 감염을 발견.
4. 치료 또는 약물 처방 혈 청 컬렉션 이전 실험실 연구 결과에 간섭을 최소화 하기 위하여 주어진 확인 하십시오. 기준을 충족 하지 않는 모든 혈 청 샘플을 거부 했다.

2. 연구의 흐름과 관심의 측정

참고: 미세 시스템 19 알레르기를 확인 하기 위한 혈 청의 100 µ L를 필요 합니다. 정 맥 혈액 (5 mL) 진공 혈관을 포함 하는 분리 젤을 사용 하 여 각 환자에 게 서 수집 되었다. 1000 x g에서 10 분 동안 centrifuging 후 상위 계층 테스트를 위해 수집 되었다. 사용 되지 않는 혈 청-80 ° c.에 저장 된 테스트, 이전 혈 청 30 분 동안 실내 온도에 유지 되었다 그리고 소용돌이 믹서와 동요 되었다. 반복된 그리고 freeze-thaw 주기 피 했다.

1. 주로 테스트 sIgEs Dermatophagoides pteronyssinus (d1), Dermatophagoides farinae (d2), Blomia tropicalis (d201), 고양이 비 듬 (e1), 개 비 듬 (e5), 버뮤다 잔디 (g2)의 모든 알레르기에 대 한 혈 청 샘플, 티모시 ( g6), 바퀴벌레 (i6), Aspergillus fumigatus (m3), 칸디 다 albicans (m5), ragweed (w1), 달걀 흰 자 위 (f1), 우유 (f2), 밀 (f4), 땅콩 (f13), 콩 (f14), 아몬드 (f20), 게 (f23)와 새우 (f24). 섹션 3에서에서 주어진 지침을 따르십시오.
   참고: sIgE 결정 화학 분석기에 의해 분석 결과 (참조 테이블의 재료) 키트 및 측정 관련 알레르기 IgE와 수행 되었다.
2. 임의로 재현성 연구에 대 한 충분 한 혈 청 (적어도 900 µ L)으로 3 개의 샘플 샘플 중에서 선택 합니다. 9 일 연속에 대 한 알레르기 sIgEs에 대 한 3 세라를 매일 측정 모든 조건 변경, 유지 (즉, 100 x 9 = 900의 총 혈 청의 µ L).

3. 반 자동화 미세 시스템의 테스트 절차

참고: 시스템 2 자동 미세 기술, 단백질 microarray, 형광 분석, 병렬 ige의 분석, 및 이미지 처리 기술을 통합 이다. 테스트 프로토콜 4 부분으로 나누어져 있습니다: 장비, 샘플 로드, 부 화, 및 측정의 준비.

1. 장비 준비
   1. PC 및 분석기 전원을 켭니다.
      참고: 전원 스위치는 기지의 왼쪽에.
   2. PC에서 LabIT 프로그램을 시작 합니다. 어두운 프레임 경고 창이 팝업 경우 누설 테스트를 실행 하려면 확인 을 클릭 합니다. 그 후, 센터 로고 작업 인터페이스를 클릭 합니다.
      참고: 시스템 유휴 24 h에 대 한 누출 시험 을 실행 사용자 생각나 게 합니다.
   3. 반응 온도 CCD (전 하 결합 소자) 온도 화면의 오른쪽 아래 모서리에 확인 합니다. 반응 온도 37 ° C ± 1 ° C에서 약 10 분, 상승 한다 그리고 CCD 온도-15 ° C ±에 드롭 해야 1 ° c.
   4. CCD 온도-15 ° C ± 감소 했다 후 누출 테스트 실행 1 ° c. 누설 테스트를 실행 하기 전에 다른 항목이 악기 안에 남아 있는지 확인 하 고 문을 닫습니다. 도구 | 시스템 테스트 | 누설 테스트합니다. 테스트 하는 동안 문을 열지 마십시오. 테스트가 완료 되 면 보고서 창이 팝업 됩니다.
2. 샘플 로딩
   1. 미세 카트리지에 해당 시 약 탱크를 세척 버퍼, 블로킹 버퍼의 120 µ L, A와 B 60 µ L 기판 A와 B, 그리고 혈 청 샘플의 100 µ L 어원이 같은 말의 60 µ L의 620 µ L를 추가 합니다.
3. 부 화
   1. 카트리지 ID에 클릭 하 고를 사용 하 여 바코드 스캐너 카트리지의 일련 번호를 스캔, 샘플 ID 입력, 분석기에 카트리지를 넣어 문을 닫은 분석기 및 분석을 시작 하려면 실행 을 클릭 합니다.
4. 측정
   1. 측정 후 결과를 통계 소프트웨어 (예: Excel)을 내보냅니다.
      참고: 외피의 30 분 후 분석기 자동으로 측정을 수행 하 고 결과 보고.
5. 분석기의 전환
   1. 테스트를 마친 후 일상적인 유지 보수에 대 한 카트리지를 제거 하 고 분석기의 내부 난방 철 75% 알코올로 가볍게 전자석을 닦아.
      참고: 눌러 하드 하거나 전자석 흔들 없습니다.
   2. LabIT 창을 닫습니다. 온도 모니터링 창이 나타납니다. CCD는 5 ° C 보호 모드를 데우는 때 그것은 자동으로 닫힙니다. 다음으로, 분석기 및 PC의 전원을 꺼도 안전 합니다 것입니다.
      참고: 수동으로 닫지 마십시오 CCD 온도 5 ° C에 증가 했다 전에 창 모니터링 온도 그리고 CCD 워밍업 동안 분석기도 PC의 전원을 설정 하지 마십시오.

4입니다. sIgE 반응의 정의

참고: undiluted 혈 청 견본에 대 한 시스템 2의 탐지 범위는 0.21-100 IU/mL.

1. 0.35 IU/mL의 임계값에 따라 달라 집니다, 긍정적인^6,70.35 IU/mL를 초과 하는 sIgE 수준 고려. ⁸sIgE 테스트의 반응성을 평가: 1 클래스 (≥0.35 및 < 0.70 IU/mL), 2 클래스 (≥0.70 및 < 3.50 IU/mL), 3 클래스 (≥3.50 및 < 17.50 IU/mL), 4 클래스 (≥17.50 및 < 50.00 IU/mL), 5 클래스 (≥50.00 및 < 100.00 IU/mL) 그리고 클래스 6 (≥100.00 IU/mL).

5. 통계 분석

1. 19 알레르기 (그림 1)의 긍정적인 속도 표시 Levey 제닝스 곡선을 사용 하 여 검출 시스템 (그림 2)⁹의 반복성을 설명 하는 히스토그램을 사용 합니다.
2. 세 가지 가장 일반적인 흡입 알레르기 및 식품 알레르기 (총 6 개 알레르기)에서 선택한 나 시스템 1의 임상 진단 성능^10,11평가 하는 결과 비교 합니다. 용어 색인 속도, 감도, 특이성, 긍정적이 고 부정적인 예측 값 및 평가 기준으로 운영 하는 특성 (ROC) 곡선 (AUC) 수신기 아래의 영역을 포함 합니다.
3. 두 시스템 간의 상관 관계를 설명 하 고 카파 값을 사용 하 여 일관성에 대 한 Spearman의 상관 관계 분석¹² 를 적용 합니다. 카파 값을 거의 분류 완벽 (0.8-1.0), 실질적인 (0.6-0.8), 보통 (0.4-0.6), 공정 (0.2-0.4), 또는 가난한 (< 0.2)¹³. SPSS 23.0 및 MedCalc 11.0 통계 분석을 사용 하 고 P 를 정의 < 0.05 통계적 인 의미.

결과

19 일반적인 알레르기 증상에 대 한 긍정적인 요금
293 세라에 대 한 결과 그림 3에 나와 있습니다. 모든 흡입 알레르기 중 D. farinae 높은 긍정적인 평가 했다 (80.89%, 273/293), 뒤에 디 pteronyssinus (78.84%, 231/293)입니다. 식품 알레르기 중 게는 긍정적인 비율 (20.48%, 60/293), 13.65% (40/293) 새우에 대 한 다음. 흡입 알레르겐에 대 ?...

토론

많은 다른 연구 결과 유사^15,16,17, 293 알레르기 환자 보여주었다 그 집에서에서 세라에 따라 미세 시스템에서 결과 먼지 진드기 ( D. pteronyssinus를 포함 하 여 D. farinae, 그리고 B. tropicalis)는 주요 흡입 알레르기 음식, 우유, 땅콩, 새우, 고 게 흔히 알레르기 알레르기 증상을 일으키는 원인이 되는 남쪽 중국에 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agnitio BioIC Analyzer	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	BA-G2000
BioIC Allergen specific-IgE Detection Kit	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DR17A12
BioIC Cartrideg Placement plate	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	T20SET
BioIC Reagent Dispenser	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DS-1
Image two-dimensional barcode machine	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	NLS-HR200
Software Package, LabIT	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	Version 2.4.12
VORTEX-5 Vortex Mixer	Haimen Kylinbell Lab Lastruments Co., Ltd.	VORTEX-5