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요약

Golgi 세포 표면에서 단백질의 역행 수송 막 항상성 유지에 필수적 이다. 여기, 우리는 화학적 HeLa 세포에서 기능성된 nanobodies를 사용 하 여 재조합 단백질의 세포 표면에 골 교통을 분석 하는 방법을 설명 합니다.

초록

수송 단백질은 골을 넘어 셀 표면에서 막의 항상성, 세포 기관이 정체성과 생리학에 대 한 필수적입니다. 공부 하 고 퇴행 성 단백질 트래픽, 최근 고정 및 라이브 셀 이미징, 전자 현미경, 또는 화학적 여 골 복잡 한 세포 표면에서 수송 분석을 다양 한 nanobody 기반 툴킷을 개발 했습니다. 우리 설계 기능성된 안티 녹색 형광 단백질 (GFP) nanobodies-작고, 단위체, 높은 선호도 단백질 바인더-셀 라인 막 단백질 extracellular GFP moiety와 관심의 표현에 적용 될 수 있는. Derivatized nanobodies GFP 기자에 바인딩된 특별히 내 면 고 기자 정렬 경로 따라 피기백을 수송. Nanobodies은 기능성을 형광 현미경 검사 법에 의해 역행 수송을 따라 하는데 과산화 효소 2 전자에 의해 기자 nanobody 복합물의 ultrastructural 지역화를 조사 (APEX2)와 영상 살 fluorophores와 현미경 검사 법, 그리고 trans Golgi 네트워크 (TGN) 도착의 활동을 평가 하기 위해 티로신 sulfation (TS) 모티브. 이 방법론 문서에서는, 우리는 bacterially 표현 하 고 기능성된 nanobodies 정화 일반 절차 개요. 우리는 mCherry 및 TS 수정 nanobodies endocytic 통풍 관 및 TGN 도착 화물 단백질의 분석을 사용 하 여 우리의 도구를 사용 하 여를 강력한를 보여줍니다.

서문

단백질과 지질 세포 표면에서 다양 한 세포내 구획을의 역행 트래픽이 막 항상성 분 비를 균형 잡히게 하 고 참가자 전송 기계1 의 구성 요소를 재활용의 유지 보수에 대 한 중요 한 , 2. 다음 clathrin-또는-독립적인 endocytosis 통해 국제화, 단백질 및 지질 화물은 먼저 일찍 채울 endosomes 어디에서 그들은 더 중 엔 lysosomal 시스템, 플라즈마 막에 재활용 따라 리디렉션 또는 trans Golgi 네트워크 (TGN) 대상. 다양 한 양이온 종속 및 양이온 독립만 노 오 스 6 인산 염 수용 체 (CDMPR 및 CIMPR) 등 참가자 막 횡단 화물 수용 체의 기능 사이클의 일부인는 TGN endosomes 및 셀 표면에서 재활용 제공 새로 합성 늦은 endosomes와 리소좀3,,45, sortilin 및 SorLA6,7, 및 Wntless (WLS) 수송 하는 세포 표면에 Wnt ligands는 TGN에서 lysosomal hydrolases 8 , 9 , 10 , 11. 다시는 TGN에 검색 하는 다른 단백질은 TGN46 및 그것의 관련된 isoforms12,13,14, SNAREs (수용 성 N-ethylmaleimide-민감한 퓨전 요소 첨부 수용 체) 15 , 16 , 17, 녹말 체 선구자 단백질 (APP)18,19, 진보적인 ankylosis (ANK) 단백질20, ATP7A/B 나 DMT121,22, 등 고 막 횡단 금속 전송기 효소 carboxypeptidase D, furin 또는 BACE123,,2425를 포함 하 여 처리. 이러한 내 생 단백질은 그렇다 하 고 박테리아 및 식물 독 소 (예를 들어, 시가 콜레라 독 소, 신은 abrin) 납치 cytosol26,27,에 retrotranslocation에 대 한 응급실에 도달 역행 수송 기계 , 2829.

직접 역행 트래픽 분석, 위해 이전 레이블 및 세포내 구획30화물 단백질을 세포 표면에서 따라 하는 nanobody 기반 툴킷을 개발 했습니다. Nanobodies는 homodimeric 무거운 체인만 항 체 (hcAbs) camelids과 연골 물고기31,32에서 자연스럽 게 발생 하는에서 파생 된 단백질 바인더의 새로운 가족을 나타냅니다. 그들은 hcAbs의 변수 중 체인 도메인 (VHH)를 구성 하 고 기존의 항 체 (예: IgGs)에 비해 많은 장점이 있다: 그들은 단위체, 작은 (~ 15 kDa), 높은 가용성, 이황화 결합, 없는 bacterially 표현 하 고 선정 수 높은 친 화력 바인딩33,,3435,36. 우리의 nanobody 도구를 다양 하 고 광범위 하 게 적용을 하려면 우리는 표면 레이블과 트랙 단백질 그들의 세포 외/lumenal 도메인에서 GFP 태그로 기능성된 안티-GFP nanobodies 고용. MCherry, 하는데 과산화 효소 2와 nanobodies (APEX2)의 기능화에 의해37또는 티로신 sulfation (TS) 시퀀스, 역행 bonafide 막 횡단 화물 단백질의 고정으로 분석 될 수 있다 수송과 라이브 셀 이미징 전자 현미경 검사 법, 또는 화학적. Tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 및 TPST2)에 의해 중재 티로신 sulfation 이기 때문에 trans Golgi 제한 posttranslational 수정/TGN, 우리 수 있다 직접 전송 하 고이 셀 표면에서 관심사의 단백질의 활동 세포내 Golgi 구획38,,3940.

이 방법 문서에서는, 우리는 포유류 세포30의 역행 교통 분석 응용 프로그램의 수에 적합 한 기능성된 nanobodies (VHH-2xTS,-APEX2,-mCherry 및 파생 상품)의 생산의 용이성을 설명 합니다. 우리는 주로 sulfation의 세포 표면에서 세포내 매매의 분석에 대 한 TS 사이트 수정 nanobody의 사용에 초점.

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프로토콜

1. 세균성 전이 기능성된 Nanobodies

참고: 이 프로토콜은 앞에서 설명한30식, 정화, 고 기능성된 안티-GFP nanobodies의 분석에 대 한 최적화 되었습니다. 다른 단백질 moieties와 derivatization이 표준 프로토콜의 수정이 필요할 수 있습니다.

  1. 해 동 chemocompetent 박테리아 (~ 100 µ L) 단백질 표정에 적합 (예를 들면, 대장균 로제타 BL21 (DE3) 셀) 얼음에 그들을 배치 하 여.
    참고: Chemocompetent 표준 실험실 절차에 따라 세균 셀을 준비 합니다. 또한, 화학적으로 유능한 세균성 세포는 상업적으로 구입할 수 있습니다.
  2. 추가 50 기능성된 nanobodies 인코딩 플라스 미드의 ng. 충분 한 사이트 biotinylation nanobody 기자의 세균성 식 중, 또한 추가 삼 배 초과 (150 ng) 인코딩 biotin 리가 BirA 세균성 식 플라스 미드의 (참조 표 1 플라스 미드 정보). 부드럽게 피펫으로 위쪽 및 아래쪽입니다.
    참고: Nanobody biotinylation는 필요 하지 않습니다 또는 nanobody 기자 biotin 수락자 펩 티 드 (BAP) 없는, 인코딩 BirA 플라스 미드와 공동 변환 필요 하지 않습니다.
  3. 얼음에 30 분 동안 세균성 세포를 품 어.
  4. 열 물 목욕 또는 열 블록에 42 ° C에서 1 분 동안 그들을 배치 하 여 세균성 세포를 충격.
  5. 실내 온도 (RT)의 1 mL을 추가 Luria 국물 (파운드) 매체와 저항 유전자의 phenotypic 표정 있도록 37 ° C에서 1 시간에 대 한 thermoshaker에서 변형 된 박테리아를 품 어. 1 L 파운드 준비 중간, 균형의 효 모 5 g, 추출 10 g tryptone의 10 g의 NaCl, 물으로 채워 및 압력가 마로 소독 하 여 소독. 기능성된 nanobody 암 피 실린/carbenicillin에 저항을 포함 하는 식 벡터에 subcloned 되었습니다, 단계 1.5를 생략할 수 있습니다.
  6. 11000 x g 1 분 동안에 박테리아를 작은 고 신선한 파운드 매체의 100 µ L에서 resuspend.
  7. (예:,)와 함께 50 µ g/mL 대 50 µ g/mL carbenicillin 박테리아 (1.2 단계) 위에 말한 대로 공동 BirA nanobody 기자와 변형 되었을 때 각각 항생제를 포함 하는 파운드 플레이트에 일시 중단 된 박테리아 접시
  8. 37 ° C에서 인큐베이터에서 파운드 접시를 놓고 성장 하자 하룻밤 (O/N).
    참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 4 ° c.에 성장된 식민지와 파운드 플레이트를 저장 하 여 Parafilm를 사용 하 여 파운드 접시를 봉인.

2. 세균성 액체 문화 및 기능성된 Nanobody 식의 유도

  1. 접시에서 벡터를 포함 하는 세균성 식민지를 선택 하 고 포함 된 항생제 O/N 37 ° C에서 떨고 인큐베이터에서 보충 파운드 매체 20 mL 플라스 크에 성장 하자 (선택 항생제에 관한 1.7 단계 참조).
  2. 다음 날, 선택 항생제로 파운드 매체의 1 L를 포함 하는 플라스 크에 성장된 20 mL 세균성 문화를 희석.
  3. 계속 그것은 0.6-0.7의600 세 도달할 때까지 37 ° C에서 세균성 문화를 품 어. 유도 하는 단백질 식 전에 rt 진정 문화를 허용 한다.
  4. 유도 1 M 이소프로필-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) 유도 (1:1, 000 희석)의 1 m m의 최종 농도에 1 mL의 추가 의해 공업화 nanobodies 및 BirA 단백질 표정. 또한 BAP epitope 기능성된 nanobodies (참조 표 1 플라스 미드 정보)에의 biotinylation 수 있도록 성장 매체에서 200 µ M d-biotin 결과 20 m m d biotin 재고 솔루션의 10 mL를 추가하시오
    참고: D-biotin 재고 솔루션 ddH2O에서에서 준비 하 고 500 mM NaH2포4의 drop-wise 추가 솔루션으로 가져온. 또는 d biotin 또한 DMSO에 녹아 수 있습니다. Nanobodies APEX2 융합 생산 (VHH-APEX2), LB 매체 1 m m 5-aminolevulinic 산 (달라) 염 헤 법인 홍보와 또한 보완 해야 합니다. 달라는 ddH2o. 100 m m 재고 솔루션으로 준비
  5. IPTG 유도 1 L 세균성 문화 VHH 2xTS 4 h 30 ° C, 20 ° C 또는 RT O/N VHH-APEX2, 또는 16 품 어 ° C O/N VHH mCherry (참조 표 1 플라스 미드 정보).
    참고: 새로운 nanobody 구문 식 조건에서 실험에 의해 낙관 되어야 한다.
  6. 1 L 원심 병에 플라스 크에서 세균성 문화를 전달 하 고 45 분 Decant는 상쾌한 4 ° C에서 5000 x g 에서 셀 작은 정화를 계속.
    참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기 무기한-80 ° C에서 세균성 펠 렛을 저장 하 여. VHH APEX2 또는 VHH mCherry 펠 릿은 일반적으로 (때문에 법인된 헤) 갈색 또는 분홍색, 각각.

3입니다. 기능성된 Nanobodies의 정화

  1. 필요한 경우 녹여 얼음에 냉동된 세균 펠 릿 (단계 2.6 참조).
  2. 세균성 세포 pellet을 30 mL의 얼음 처럼 차가운 바인딩 버퍼 (1 x PBS에 이미 20 m m)를 추가 하 고 아래로 pipetting으로 resuspend. 레이블이 지정 된 50 mL 튜브에 resuspended 박테리아를 전송 합니다.
  3. 30 mL 바인딩 나, 1 mM MgCl2 와 1 m m phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF) 200 µ g/mL lysozyme, 20 µ g/mL DNase 버퍼링 하 고 RT에서 10 분 동안 처음 그리고 끝 이상 통에 4 ° C에서 1 시간을 품 어 보충.
  4. 기계적으로 팁 sonicator는 서 스 펜 션에 배치 하 여 50 mL 튜브에 세균성 세포를 lyse. 일정 3 x 1 분 펄스 1 분 냉각 기간 사이 함께 적용 합니다.
  5. 45 분 작은 파편과 그대로 셀 4 ° C에서 15000 x g 에서 lysate 박테리아 원심 원심 분리에 대 한 적절 한 원심 병으로 하나 sonicated 세균성 세포 lysate를 전송 하거나은 lysate 탁상 원심 분리에 대 한 여러 5 mL 튜브로.
  6. 새로운 50 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 수송과 파편을 삭제.
  7. 삭제 저장 lysate 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)에 의해 정화를 준비 하는 동안 얼음에. 기능성된 nanobodies 히스티딘 태그를 격리 하려면 고용 단일 사용 ( 재료의 표참조) 그의 열 수 있도록 신속 하 고 간단한 중력 흐름 정화.
    참고: 또는 상업 열 대신 일괄 처리 정화는 또한 사용 될 수 있습니다.
  8. 그의 열 금속 스탠드에 장착.
    1. 열 스토리지 솔루션을 테이퍼 하 고 그의 equilibrate 열 바인딩 버퍼 (1 x PBS에 이미 20 m m)의 10 mL와 함께.
    2. (흐름을 통해 삭제 될 수 있습니다) 중력 흐름에 의해 빈.
  9. 점차적으로 허가 세균성 lysate (~ 30 mL) 열에 로드 합니다. (흐름을 통해 삭제 될 수 있습니다) 중력 흐름에 의해 빈.
  10. 그의 씻어 열 2 바인딩 버퍼 (1 x PBS에 이미 20 m m)의 10 mL x.
  11. 2 mL 튜브에 차입 버퍼 (1 x PBS에 이미 500 m m)의 2 개 mL와 nanobodies을 elute 고 버퍼 교환 적용 합니다.
  12. 버퍼 교환입니다.
    1. Equilibrate는 담 열 5 번과 1 x PBS의 5 mL 50 mL 튜브 열 어댑터에 배치 ( 재료의 표참조).
    2. 버퍼 층을 입력을 허용 합니다. 흐름을 통해 삭제 합니다.
    3. 다섯 번째 PBS 평형 후 1000 x g 2 분 동안에 열을 회전 합니다.
    4. 흐름을 통해 삭제 합니다.
    5. 새로운 50 mL 튜브에 어댑터와 열을 배치 합니다. 2 mL PBS equilibrated 염 열에 2 분 동안 1000 x g 에서 스핀 (3.11 단계)에서 eluted 기능성된 nanobody의 로드와 eluate 수집 합니다.
      참고: 상업적인 염 열 대신 투 석 교환 버퍼 구성에 적용할 수 있습니다.
  13. Bicinchoninic (BCA) 또는 제조업체의 지침에 따라 Bradford 분석 실험을 사용 하 여 eluate의 단백질 (nanobody) 농도 결정 합니다.
    참고: Nanobody GFP 기자 셀 라인에 의해 이해 분석 실험, 2-10 mg/mL의 농도 재고 최적입니다.

4. 기능성된 Nanobody 식 (Coomassie 얼룩)의 유효성 검사

  1. 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 따라 표준 프로토콜에 대 한 10-12.5% 젤을 준비 합니다.
    참고: 또는 상용 부품된 그라데이션 젤 사용.
  2. 1.5 mL 튜브를 5 분 동안 95 ° C에서 샘플 버퍼에 종으로 정화 기능성된 nanobody의 피펫으로 20 µ g.
    참고: 예를 들어, 2 x 샘플 버퍼의 10 µ L 1.5 mL 튜브에 2 mg/mL nanobody 재고 솔루션의 10 µ L를 추가 합니다. 볼륨이 너무 작은 경우에, 견본 버퍼를 추가 하기 전에 nanobody PBS에 희석 추가.
  3. SDS polyacrylamide 젤에 샘플 버퍼에 삶은 순화 nanobody을 로드 하 고 참조 염료 (예를 들어, bromophenol 블루) Coomassie 얼룩 다음, 분리 젤의 끝에 도달 했습니다 때까지 표준 페이지 프로토콜에 따라 실행 하 고 destaining.
  4. Coomassie 젤 얼룩 및 Destaining입니다.
    1. Uncast 젤 하 고 움직이는 떨고 플랫폼에 RT에서 20-30 분 Coomassie 얼룩 솔루션 (10 g/L ddH2O 10% 초 산 및 45% 메탄올에서 Coomassie 재고 솔루션의 5%)으로 얼룩. 젤 얼룩 솔루션에 완전히 처리 되어야 합니다.
    2. Destain 젤 번 2-3와 destain 솔루션 (7.5% 아세트산 및 15% 메탄올 ddH2O) RT에 각 1 시간 추가 destaining 젤 O/N 떠나기 전에.
      참고: 초과 Coomassie 수 수 효율적으로 젖 었 젤 주위 부엌 종이 타 올을 배치 하 여.
  5. 이미지 영상 또는 카메라 선택의 젤.
    참고: Nanobody 식 immunoblot 분석의 epitopes를 대상으로 하는 항 체를 사용 하 여 ( 그림 1A참조)에 의해 더 확인 수 있습니다.

5. 형광 착 색에 대 한 경작된 한 세포에 의해 공업화 Nanobodies의 이해

  1. 셀 문화 후드, 씨 ~ 400000 500000 HeLa 세포 안정적으로 항생제 (Dulbecco의 수정이 글 매체, DMEM 포함 하는 완전 한 매체와 18 m m 유리 coverslips (제 1.5 H) 35 m m 요리 또는 6-잘 클러스터에 GFP 태그 기자 단백질을 표현 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 100 단위/mL 스, 2 m m l-글루타민, 및 1.5 µ g/mL puromycin 보충).
    참고: 여기, 우리는 안정적으로 표현 EGFP Calnexin, EGFP CDMPR TfR EGFP 용도로 HeLa 세포를 사용 합니다. 안정적인 셀 라인, 외도 뚜렷이 transfected HeLa 세포를 사용할 수 있습니다. 안정적인 셀 라인 공동 부모의 비 불리고 HeLa 세포와, 직접 비교를 위해이 단계에서 재배 하실 수 있습니다.
  2. 셀 O/N 37 ° c에 7.5% CO2 배양 기에서 품 어.
    참고: 셀 ~ 80%의 confluency 다음날 있어야 합니다.
  3. 피펫으로 2 µ L의 완전 한 중간의 2 개 mL를 포함 하는 15 또는 50 mL 튜브에 2 mg/mL nanobody 재고 솔루션 (이 볼륨은 35mm 접시 또는 6-잘 클러스터의 한 잘 커버, 매체와 비례적으로 더 많은 셀 문화 d를 포함 하는 nanobody의 볼륨을 조정 하기에 충분 ishes 또는 클러스터)입니다.
    참고: 그림을 위해 우리가 여기 VHH-mCherry, 이후 추가 항 체 얼룩이 지 EGFP 기자 ( 그림 2C참조)에 의해 내 면 nanobody를 참조 하는 데 필요한 사용 합니다.
  4. 세포에서 성장 매체를 제거 하 고 35 m m 접시 또는 6-잘 단위 당 2 µ g/mL 기능성된 nanobody를 포함 하는 prewarmed 완전 한 매체의 2 개 mL를 추가 합니다.
  5. 기자 중재 nanobody 통풍 관을 허용 하도록 7.5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 1 시간에 대 한 셀을 품 어.
    참고: 계획 된 실험에 따라 nanobody 통풍 관의 시간 조정 될 필요가 있다. 여기에 표시 된 실험에 대 한 1 시간 EGFP CDMPR와 TfR EGFP nanobody 통풍 관의 정상을 도달 하기 충분 하다.
  6. 매체를 제거 하 고 2-3 시간에 실시간 1 x PBS의 1 mL로 세포 세척
  7. 실시간에서 10 분 동안 3 %paraformaldehyde (PFA)의 1 mL와 함께 셀 수정
  8. PFA 솔루션을 제거 하 고 50mm NH41 x PBS 실시간에 5 분 동안에 Cl의 1 mL와 함께 잔여 정착 액을 끄다
    참고: 3 %PFA 별도로 통 쓰레기의 폐기 해야 합니다.
  9. 3 번 실시간에 1 x PBS의 1 mL로 세포 세척
  10. 0.1%의 1 mL로 세포를 permeabilize 실시간에 10 분의 1 x PBS에 트라이 톤 X-100
    참고: 없다 permeabilization 필요 하지만 EGFP 및 mCherry 형광 때 더 나은 이후에 셀 설치 매체에 포함 됩니다.
  11. 3 번 실시간에 1 x PBS의 1 mL로 세포 세척
  12. 실시간에서 5 분 동안 5 µ g/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole)를 포함 하는 1 x PBS에서 1 %BSA 드롭 (~ 100 µ L)에 집게와는 coverslips 배치
  13. 다시 접시/우물에는 coverslips을 놓고 3 번 실시간에 1 x PBS의 1 mL로 씻어
  14. 유리 슬라이드 레이블 및 Fluoromount-G. 셀 탑재 장착 매체 3-4 h에 대 한 어둠 속에서 강화 하 고 가벼운 보호에서 4 ° C에서 유리 슬라이드를 저장 하자.
  15. 이미지 패턴 선택 (예: 포인트 검사 Confocal 똑바로 현미경)의 현미경을 사용 하 여 얼룩.

6. (Sulfation 분석)에 대 한 경작된 한 세포에 의해 공업화 Nanobodies의 이해

  1. 셀 문화 후드에서 씨 ~ 400000 500000 HeLa 세포 안정적으로 35mm 요리에서 또는 완전 한 중간 포함 항생제 (Dulbecco의 수정이 글 매체, 10% 태아 종 아리 보충 DMEM 6 잘 클러스터에 GFP 태그 기자 단백질을 표현 혈 청 (FCS), 100 단위/mL 스, 2 m m l-글루타민, 그리고 puromycin 1.5 µ g/mL).
    참고: 위에서 설명 했 듯이, 여기 HeLa 세포 안정적으로 표현 EGFP Calnexin, EGFP CDMPR TfR EGFP 용도로 사용 합니다. 안정적인 셀 라인, 외도 뚜렷이 transfected 헬러를 사용할 수 있습니다.
  2. 셀 O/N 37 ° c에 7.5% CO2 배양 기에서 품 어.
    참고: 셀 ~ 80% 다음 날의 confluency가 있어야 합니다.
  3. 완전 한 매체를 제거 하 고 RT에 1 x PBS로 2 회 세척 한 7.5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 1 시간에 대 한 황산 무료 매체 (SFM)와 셀을 굶 어.
    참고: SFM은 MEM 아미노산 (50 x) 솔루션, L-글루타민 (200 mM), 비타민 솔루션 (100 x)의 5 mL 및 CaCl2·2H2O의 900 µ L의 5 mL의 10 mL 500 mL이 글의 균형된 염을 추가 하 여 준비가 되어 있습니다. 0.22 μ m 필터와 약 수를 통해 전달 합니다.
  4. 통풍된 후드 또는 벤치 방사능 작업에 대 한 지정, 황산 0.5 mCi/mL [35S] 황산 나트륨 소금 SFM에 포함 하는 매체 라벨을 준비 합니다.
    주의: 신중 하 게 처리 하는 방사능을 포함 하는 모든 솔루션. 지정 된 후드 또는 벤치에만 작동 합니다. 모든 재료 (팁, 튜브, 접시, 등) 또는 방사능 접촉 워시 버퍼 수집을 별도로 처리 해야. 이렇게 모든 단계 (단계 6.5-6.20) 아래도.
  5. 황산 2 µ g/mL의 최종 농도에 매체를 라벨에 1 x PBS에서 VHH-2xTS를 추가 합니다.
    참고: 제어, VHH 성병 또는 다른 nanobody TS 사이트 없는 특정 라벨 설명 포함.
  6. 황산 중간 포함 0.5 mCi/mL [35S] 황산 및 2 µ g/mL VHH 2xTS 라벨의 0.7 mL에 의해 SFM을 장착 하 고 방사능 작업에 대 한 지정 7.5% CO2 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 시간에 대 한 셀을 품 어.
    참고: 계획 된 실험에 따라 nanobody sulfation 시간 조정 될 필요가 있다. 또한, TGN 도착 속도 론을 확인 하려면 라벨 수행 됩니다 (예: 10 분, 20 분, 30 분, 등) 서로 다른 시간에 대 한.
  7. 라벨 매체를 제거 하 고 2-3 시간 냉각 플레이트 또는 얼음 얼음 1 x PBS 가진 세포를 씻어.
  8. 세포의 용 해 버퍼 (PBS 포함 1% 트라이 톤 X-100 및 0.5 %deoxycholate) 2 밀리미터 PMSF와 프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 1 보충의 1 mL을 추가 하 고 10-15 분 4 ° c.에 락 플랫폼에 대 한 셀을 품 어
  9. 긁어 1.5 mL 튜브, lysate, 소용돌이로 lysate 전송 및 4 ° c.에 이상 끝 회전에 10-15 분을 위한 장소
  10. 준비는 postnuclear에서 10000 x g 4 ° c.에서 10 분 동안 원심 분리에 의해 lysate
  11. 새로운 1.5 mL 튜브를 사용 하 여, 1.5 mL 튜브에 니켈 구슬의 슬러리의 20-30 µ L를 준비 하 고 부드럽게 1000 x g 1 분 동안에 그들을 산으로 1 x PBS로 한 번 씻어.
    참고: 니켈 대신 구슬, streptavidin 구슬 (nanobody biotinylated 경우) 또는 nanobody (T7-또는 HA-태그)의 피토 프에 대 한 IgG과 단백질 A 구슬 사용할 수 있습니다.
  12. postnuclear 전송 lysate 1.5 mL 튜브에 포함 된 니켈 구슬과는 nanobodies를 분리 하는 이상 끝 회전에 4 ° C에서 1 시간에 품 어. 약 수 (50-100 µ L)는 postnuclear의 lysate를 제거 하 고 총 셀 관련 nanobody, GFP 기자와 컨트롤을 로드의 후속 immunoblot 분석에 대 한 SDS 샘플 버퍼에 종 기.
  13. 부드럽게 1000 x g 1 분 동안에 산에 의해 3 회 PBS 또는 세포의 용 해 버퍼 x 1와 구슬을 씻어.
    참고: 구슬의 더 엄격한 세척에 대 한 20 mM 이미 PBS 또는 세포의 용 해 버퍼에 포함할 수 있습니다.
  14. 조심 스럽게 구슬에서 모든 세척 버퍼를 제거, 샘플 버퍼, x 2의 50 µ L을 추가 하 고, 95 ° c.에 5 분 삶아
  15. 부하 두 삶은 midi에 구슬 12.5 %SDS 페이지 젤과 참조 염료 (예를 들어, 블루 bromophenol) 분리 젤의 끝에 도달 했습니다 때까지 표준 페이지 프로토콜에 따라 실행 합니다.
    참고: 총 셀 관련 nanobody, GFP 기자 및 컨트롤 로드 Immunoblot 분석 또한 수행할 수 있습니다 미니 12.5%를 사용 하 여 SDS 페이지 또는 캐스트 그라데이션 젤.
  16. 분리 젤 고정 버퍼 (10% 초 산 및 45% 메탄올 ddH2O) RT에 1 시간 ~ 30 mL에 수정, 3 번 ~ 50 mL의 이온된 수와 젤을 세척 하 고 젤 건조에 대 한 준비.
  17. SDS 페이지 젤을 건조.
    1. 조심 스럽게 고정된 젤 뻗어 집착 필름에 놓고 규격에 맞게 자르는 필터 종이 함께 그것을 커버 합니다.
    2. 필터 종이 젤 아래로 건조 플랫폼 위에, 진공 커버 장소 놓고 젤 건조 진공 펌프에 전환 합니다. 3-5 h를 위한 젤을 건조.
    3. 집착 영화를 제거 고 말린된 젤 인광 체 스크린 autoradiography 카세트 합니다.
  18. 이미지 autoradiograph 인광 체 스크린 영상 장치를 사용 하 여입니다. 제조업체의 지침을 따릅니다.
    참고: 신호 강도 따라 인광 체 스크린 이상 노출 될 필요가 젤을 건조.

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결과

다양 한 세포내 목적지 역행 단백질 교통 조사, 우리는 최근 레이블 및 셀 표면30에서 재조합 융합 단백질을 따라 하는 안티-GFP nanobody 기반 도구를 설립 했습니다. 여기, 그러한 세균 생산 nanobodies derivatized 그리고 TGN 도착 sulfation 분석 조사를 그들의 사용 뿐만 아니라 형광 현미경 검사 법 및 immunoblotting, endocytic 통풍 관 공부를 그들의 응용 프로그램을 보?...

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토론

Nanobodies 많은 이점이 기존의 항 체와 단백질 바인더 장비의 신흥 클래스 대표: 그들은 작은, 안정, 단위체, 높은 친 화력과 부족 이황화 채권33,35, 에 선정 될 수 있다 44 , 45. 세포 배양 시스템에 유기 체 개발 생물학46,47,48,

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공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 작품은 그랜트 31003A-162643 스위스 국립 과학 재단에 의해 지원 되었다. 우리 니콜 Beuret는 Biozentrum 이미징 핵심 시설 (IMCF) 지원에 대 한 감사합니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-GFP antibodySigma-Aldrich118144600001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibodyBethyl LaboratoriesA190-114A
Anti-actin antibodyEMD MilliporeMAB1501
Goat anti-rabbit HRPSigma-AldrichA-0545
Goat anti-mouse HRPSigma-AldrichA-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma-AldrichD9542dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO)ApplichemA3672
D-biotinSigma-AldrichB4501dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochlorideSigma-AldrichA3785dissolved in sterile water
DNase IApplichemA3778dissolved in sterile water
LysozymeSigma-Aldrich18037059001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA)Sigma-AldrichB5936
PuromycinInvivogenant-pr-1
Penicillin/StreptomycinBioconcept4-01F00-H
L-glutamineApplichemA3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796
Fetal calf serum (FCS)BiowestS181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfateHartmann AnalyticsARS0105Product contains 5 mCi
Earle's balanced saltsSigma-AldrichE6267
MEM amino acids (50x) solutionSigma-AldrichM5550
MEM vitamin solution (100x)Sigma-AldrichM6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich11836153001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)ApplichemA1008dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium saltApplichemA1491dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfateApplichemA1493dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue)Sigma-AldrichB-0149
Paraformaldehyde (PFA)ApplichemA3813
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Ni Sepharose High PerformanceGE Healthcare17-5268-01
His GraviTrap columnsGE HealthcareGE11-0033-99
His buffer kitGE HealthcareGE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columnsGE HealthcareGE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-wellBio-Rad456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+Sigma-AldrichD8537
35 mm dishesFalcon353001
6-well platesTPP92406
Glass coverslips (No. 1.5H)VWR631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)ApplichemA0999.0025dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
TryptoneApplichemA1553
Yeast extractApplichemA1552
Magnesium chloride hexahydrateMerck Millipore105833dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrateMerck Millipore102382dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chlorideMerck Millipore106404dissolved in sterile water, stock is 5 M

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