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요약

본 품은 동물 연구를 위한 구슈강 과립 및 시험관 내 실험을 위한 혈청을 함유하는 GSK 과립의 작동 용액을 준비하기 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 한방 의약품의 약리학적 조사뿐만 아니라 생체 내 및 시험관 내 실험 모두에 대한 처방에 적용 할 수 있습니다.

초록

중국 전통 한방 의학은 폐경 후 골다공증 (POP)과 같은 많은 질병을 치료하는 대체 방법으로 역할을합니다. Gushukang (GSK) 과립, 중국에서 판매 처방, POP 치료에 뼈 보호 효과. 신체에 투여하기 전에, 하나의 표준 준비 절차가 일반적으로 필요합니다, 이는 원시 허브에서 활성 성분의 방출을 촉진하고 약리효과뿐만 아니라 치료 결과를 향상시키는 것을 목표로. 본 연구는 생체 내 및 시험관내 실험 분석에서 GSK 과립을 사용하기 위한 상세한 프로토콜을 제안한다. 저자는 먼저 생체 내 조사를 위한 과립의 동물적 적당한 복용량을 계산하기 위하여 상세한 프로토콜을 제공합니다: 계량, 용해, 저장 및 관리. 둘째, 이 문서에서는 마이크로 CT 스캐닝프로토콜과 골격 파라미터 측정에 대해 설명합니다. 샘플 전처리, 마이크로 CT 기계를 실행하기 위한 프로토콜 및 뼈 파라미터의 정량화를 평가하였다. 셋째, 혈청 함유 GSK 과립이 제조되고, 약물 함유 혈청은 시험관내 골다강 형성 및 골아세포 발생을 위해 추출된다. GSK 과립은 3일 연속적으로 쥐에게 하루에 두 번 위내 투여하였다. 혈액을 수집, 원심 분리, 비활성화, 필터링. 마지막으로, 혈청을 희석시키고 골성형술 및 골아합형성을 수행하기 위해 사용되었다. 여기에 기술된 프로토콜은 과립과 같은 한방 처방 의약품의 약리학적 조사를 위한 참고자료로 간주될 수 있다.

서문

중국 전통 의학 (한의학)은 골다공증을 치료하는 중요한 보완및 대체접근법 중 하나입니다 1,2. 물 달인은 공식 3의 기본 및가장 일반적으로 사용되는 형태입니다. 그러나 단점도 존재: 나쁜 맛, 운송에 대 한 불편, 짧은 수명 및 일관성 없는 프로토콜, 사용 뿐만 아니라 치료 효과 제한. 위의 단점을 방지하고 더 나은 효과를 추구하기 위해 과립이 개발되었으며 널리 사용되어 왔습니다4. 많은 연구가과립5,6,7에서하나 이상의 효과적인 성분의 약리학적 메커니즘을 탐구했지만, 정확한 메커니즘과 기본 약리학적 과정은 여전히 식별하기 가 어렵습니다. 이것은 하나의 과립에서 너무 많은 효과적인 성분이 동시에 유사하거나 반대 효과를 발휘 할 수 있기 때문이다4. 따라서, 체내에 전달하기 전에 과립을 준비하는 하나의 표준 프로토콜의 개발은 치료 결과에 큰 영향을 미칠 뿐만 아니라 생체 내 및 시험관내 분석법 모두에 대해서도 요구된다.

더욱이, 진료소에 있는 과립의 치료 효력은 약리학 기계장치가 너무 복잡하기 때문에 도전을 만드는 시험관 내 또는 ex vivo 연구 결과를 사용하여 확인하고 정확하게 확인하기 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해 1980 년대8에서 타시노가 약물 함유 혈청의 제조를 처음 제안했습니다. 그 때부터, 수많은 연구자들은 과립9,10,11을포함하여 한방 의학에 약물 함유 혈청을 적용했습니다. 현재, 생체외 조사를 위한 약물 함유 혈청의 선택은 생리적 조건을 밀접하게 모방하는 하나의 전략으로 여겨진다.

구슈강(GSK) 과립은 한의학이론에 비추어 임상실습에 기초하여 폐경기 골다공증(POP)을 치료하기 위해 개발되었다. GSK 과립은 생체 내 난소절제술(OVX) 마우스에서 뼈 손실을 방지하고, 파골세포 뼈 흡수를 억제하며, 골형성골형성을 자극한다4. 따라서, Li 등.12 GSK 과립 뼈 형성을 자극 하는 칼슘 수용 체의 활동을 강화 하 여 OVX 쥐에 뼈 보호 효과 발견. GSK 과립의 약리효과뿐만 아니라 뼈 보호 효과를 확인하기 위해 저자는 작동 용액 및 약물 (GSK 과립)-함유 혈청의 제조를위한 상세한 절차를 제공합니다. 더욱이, 본 호는 OVX 유도 골다공증 마우스 모델 및 GSK 과립 함유 혈청에서 시험관내 파골세포형성/골다공증 발생에 대한 GSK 과립의 적용에 대해 설명한다.

GSK 과립은 여러 허브13,14로 구성되며 식염수로 쉽게 완전히 용해될 수 있다. 따라서 식염수는 차량 역할을 합니다. 샴-조작마우스(Sham) 및 OVX 마우스는 과립 투여 마우스와 동일한 부피의 식염수를 투여하였다. 마우스에 대한 GSK 과립의 동등한 용량은 Meeh-Rubner 방정식15에기초하여 계산되었다. 이 방정식은 안전한 복용량을 얻는 이점이없을뿐만 아니라 약리효과15를보장합니다. GSK 과립의 3개의 투여량은 다음과 같이 생성되었다: (1) GSKL: OVX + 저용량 GSK 과립, 2 g/kg/day. (2) GSKM: OVX + 중간 용량 의 GSK 과립, 4 g / kg / 일. (3) GSKH: OVX + 고용량 GSK 과립, 8 g/ kg/일. GSKL, GSKM 및 GSKH 군의 마우스를 위내 로 GSK 과립을 투여하였다. 탄산칼슘(600 mg/정제)과 비타민 D3(125 국제 단위/정제)를 함유하고, 예를 들어, 골다공증을 치료 및 예방하기 위한 성숙하고 시판된 제품(예를 들어, 칼트레이트[CAL])에서, 양성 대조군으로 사용하였다.

프로토콜

모든 실험 절차는 TCM의 상하이 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인으로 수행되었다 (SZY201604005).

1. GSK 작업 솔루션의 준비 및 관리

  1. 마우스에 대한 GSK 과립의 동등한 복용량을 계산합니다.
    1. Meeh-Rubner 방정식15를기준으로 바디 표면 계산 : 바디 표면 = K x (체중 2/3)/1000, 여기서 K 값은 인간의 경우 10.6, 마우스의 경우 9.1입니다. 인체 의 체중이 70kg이라고 가정하면 인체표면 (m2) = 10.6 x (70 2/3)/1000 = 1.8m2. 마우스 본체 중량이 20 g(0.02 kg, 예를 들어, 1개월 된, 암컷, C57/BL6)을 가정한 다음 마우스 본체 표면(m2) = 9.1 x (0.022/3)/1000= 0.0067m2.
    2. 계산된 바디 표면을 기반으로 인간및 마우스의 바디 변환 비율을 계산합니다. 인간: 70 kg/1.8m2 = 39. 마우스: 0.02 kg/0.0067m2 = 3. GSK 과립 = 20 g/70 kg x 39/3 = 3.72 g/kg  4 g/kg.
    3. 마우스 당 20g의 체중을 기준으로 마우스에 해당하는 복용량을 계산합니다: 4 g/kg x 0.02 kg = 0.08 g.
    4. 그룹당 20마리의 마우스를 기준으로 GSK 과립의 3회 동등한 용량을 계산하고 3개월(90일) 동안 지속되는 개입: (1) GSKL (OVX + 저용량 GSK 과립 [2 g/kg/일]): 0.04 g 마우스/일 x 20 마우스 x 90일 = 72g(2) GSKM (OVX + 중간 용량 GSK/GSK/4kg). 일]: 0.08 g 마우스/일 x 20 마우스 x 90 일 = 144 g. (3) GSKH (OVX + 고용량 GSK 과립 [8 g/kg/day]): 0.12 g 마우스/일 x 20 마우스 x 90 일 = 216 g.
      참고: 손실을 상쇄하기 위해 실제로 GSK 과립의 20%를 추가로 준비합니다.
  2. 체중15에따라 마우스당 GSK 과립의 부피를 계산합니다: 예를 들어, 부피(V) = 0.24 mL/마우스/일.
    참고 : 마우스의 위 내 투여용 부피는 0.12 mL / 10g입니다.
  3. GSK 과립의 3 회 분량의 10 일 '가치의 무게. 무게 8g, 16g, GSK 과립 24g을 각각 GSKL, GSKM 및 GSKH로 제공합니다.
  4. Meeh-Rubner 방정식15에 따라 마우스용 비타민 D3(CAL)를 함유한 탄산칼슘의 동등한 복용량을 1.1.1 단계 및 1.1.2단계: CAL 투여량 = 2 정/70kg x 39/3 = 0.372 정/kg = 0.4 정/kg.
  5. 마우스 당 20g의 체중(예: 1개월 된, 여성, C57/BL6)을 기준으로 마우스에 대한 CAL의 동등한 복용량을 계산합니다: 0.4 정/kg x 0.02 kg = 0.008 정. 그런 다음 그룹당 20마리의 마우스를 기준으로 CAL의 동등한 용량을 계산하고 3개월(90일) 동안 지속되는 내정: 0.008 정제 x 20 x 90 = 14.4 정. 10일 분량의 CAL(1.6정)의 무게를 측정하십시오.
  6. 해산
    1. GSK 과립 8 g을 50 mL 튜브에 넣습니다. 식염수 48mL를 넣고 쉐이크 튜브를 추가하여 완전히 녹입니다.
      참고 : 완전한 용해의 표준은 퇴적물의 부재입니다. 위봉 바늘이 작동 용액을 끌어 올려 부드럽게 추방 할 수 있다면 완전한 용해를 더 확인할 수 있습니다.
    2. 1.5.1 단계를 GSK 과립 16g 및 24g으로 반복합니다.
    3. CAL 1.6 정(10일 분량)을 50 mL 튜브에 넣습니다. 식염수 48mL를 넣고 쉐이크 튜브를 추가하여 완전히 녹입니다.
      참고 : 작업 용액은 -4 °C에 보관하고 10 일마다 제조 할 수 있습니다.
  7. 위내 투여
    1. 마우스의 뒷면(생후 1개월, 여성, C57/BL6)을 마우스가 앞으로 향하도록 하여 그 위치에 단단히 고정되도록 합니다. 투여하기 전에 마우스를 2-3 분 동안 진정상태로 유지하십시오.
      참고: 연구원이 마우스 앞을 명확하게 볼 수 있는지 확인합니다. 특히 새로운 연구자들에게 마우스 물림을 방지하기 위해 장갑을 착용하십시오.
    2. GSK 과립의 작업 용액에 게이지 바늘 (크기 : #12, 40 mm)을 놓고 작동 용액의 0.24 mL을 그립니다.
    3. 위쪽 바늘이 위장에 도달 할 때까지 입의 한쪽을 통해 마우스에 게장 바늘을 넣어.
      참고 : 위장 바늘이 위장에 도달했는지 확인하려면 : (1) 위쪽 바늘은 저항의 느낌을 만난다. 한편, 마우스는 식도의 물리적 협인을 통과하기 전에 삼키는 작용을 나타낸다. (2) 작동 용액의 약 0.5 mL를 마우스에 주입하고 1 분 동안 기다립니다. 마우스에서 나오는 해결책이 없다면, 이것은 위장 바늘이 위장에 도달했다는 것을 의미합니다.
    4. GSK 과립 (0.24 mL / 마우스)의 작동 용액을 위장에 주입 한 다음 게이지 바늘을 꺼낸다. 마우스를 케이지에 넣습니다.
    5. CAL 용액으로 1.6.4 단계를 반복하고 마우스당 0.24 mL의 CAL 용액을 주입합니다.
      참고: CAL 용액의 부피는 1.2단계에서와 같이 계산됩니다.

2. 마이크로 CT 스캐닝

  1. T (주) 이비아 (이비아) 수확 및 준비
    1. 90일의 개입 다음날 300 mL/100 g의 80 mg/kg 케타민으로 마우스를 마취합니다. 발가락의 바늘 핀치를 사용하여 마우스가 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 어떤 응답도 성공적인 마취를 나타냅니다. 그런 다음 자궁 경부 탈구로 마우스를 죽입니다.
    2. 압정으로 폼에 팔과 다리로 마우스를 고정합니다.
    3. 가위로 피부를 잘라 (크기 : 8.5 cm) 및 핀셋 (크기 : 10cm) 원말 끝에서 끝에서 다리의 다음 경골을 수확.
    4. 즉시 경골을 70 % 에틸 알코올에 넣고 3 회 씻으하십시오.
  2. 스폰지 거품으로 마우스의 왼쪽 경골을 감싸고 샘플 튜브 (직경 35mm, 길이 140mm)에 넣습니다.
    참고: 시편의 긴 축은 샘플 튜브의 축축과 함께 있어야 합니다. 경골의 근위쪽 끝이 위쪽으로 향하도록 합니다.
  3. 마이크로 CT 80 스캔 기계 실행
    1. 실온에서 마이크로 CT 80 스캔 기계를 시작합니다.
    2. 샘플 튜브를 마이크로 CT 80으로 설정하고 픽셀 크기 15.6 μm, 튜브 전압 55 kV, 튜브 전류 72 μA, 통합 시간 200 ms, 공간 해상도 15.6 μm, 픽셀 해상도 15.6 μm 및 이미지 매트릭스로 단면 스캐닝을 시작합니다. 2048 x 2048.
      참고: 취소된 뼈는 사전 스캐닝을 통해 피질 골격과 구별됩니다. 경골의 스캔 영역은 경골 고원 아래 5mm에서 원위 끝까지 취소 된 뼈 영역으로 정의됩니다.
  4. 뼈 매개 변수의 정량화
    1. 단면 스캐닝을 완료 한 후 왼쪽 경골의 이미지를 가져옵니다.
    2. 밀도 임계값을 245-1000으로 설정합니다. 마이크로 CT 평가 프로그램 V6.6을 사용하여 뼈 미네랄 밀도 (BMD), 총 부피 이상의 뼈 볼륨 (BV / TV), 근방 뼈 수 (Tb.N), 근방 뼈 두께 (Tb.Th), 뼈 뼈 뼈 분리 ( 결핵)을 참조하십시오.

3. 시험관 내 실험을 위한 혈액 혈청의 준비

  1. 계산
    1. 0.2 kg의 쥐 체중 (1 개월, 여성, Sprague-Dawley)을 기준으로 GSK 과립의 복용량을 계산하십시오 : 인간 복용량 / 일 x 체중 의 인간 x K / 체중 = 쥐의 체중 = 20 g / 70 kg / 일 x 70kg x K (K = 0.018) / 0.2 kg = 2 g / kg / 일.
      참고: K는 인간과마우스(15) 사이의 약리학적 형광 계수이다(K = 0.018).
    2. 3.1.1 단계를 반복하고 다음 복용량을 계산합니다.
      1. GSKL의 복용량을 계산 : 10g / 70kg / 일 x 70kg x K / 0.2 kg = 1 g / kg / 일.
      2. GSKM의 복용량을 계산 : 20g / 70kg / 일 x 70kg x K / 0.2 kg = 2 g / kg / 일.
      3. GSKL의 복용량을 계산 : 40g / 70kg / 일 x 70kg x K / 0.2 kg = 4 g / kg / 일.
      4. CAL의 복용량을 계산 : 2 정제 / 70kg / 일 x 70kg x K / 0.2 kg = 0.2 정제 / kg / 일.
    3. GSK 과립 및 CAL의 총 투여량을 계산합니다.
      1. GSKL의 총 복용량을 계산하십시오: 1 g/kg/day x 0.2 kg x 6 래트 x 3일 = 3.6 g.
      2. GSKM에 대한 총 복용량을 계산하십시오 : 2 g / kg / 일 x 0.2 kg x 6 래트 x 3 일 = 7.2 g.
      3. GSKH에 대한 총 복용량을 계산하십시오 : 4 g / kg / 일 x 0.2 kg x 6 래트 x 3 일 = 14.4 g.
      4. CAL 투여량 = 0.2 정/kg/일 x 0.2 kg x 6 래트 x 3일 = 0.72 정.
        참고: 총 10 mL의 GSK 과립 함유 혈청이 100 mL 배양 배지(20% GSK 과립 함유 혈청)를 준비하는 데 필요하다. 각 랫트(6마리 의 쥐/군)는 원심분리 후 GSK 과립 함유 혈청의 1.5-2 mL를 제공할 것으로 예상된다.
    4. 체중15에따라 쥐 당 적용되는 GSK 과립의 부피를 계산합니다 : 예를 들어, 부피 (V) = 2 mL / 쥐 / 일.
      참고 : 쥐의 위 내 투여용 부피는 0.1 mL / 10 g입니다.
  2. GSK 과립의 3 복용량의 3 일 '가치 무게. 무게는 3.6 g, 7.2 g, GSK 과립 14.4 g이며 GSKL, GSKM 및 GSKH로 각각 작용합니다. CAL 그룹에 대한 0.72 태블릿의 무게.
  3. GSK 과립 7.2 g을 50 mL 튜브에 넣습니다. 식염수 36mL를 넣고 쉐이크 튜브를 추가하여 완전히 녹입니다. 3.6 g와 GSK 과립 14.4 g으로 반복하십시오.
  4. GSK 작업 용액 의 2 mL로 위 내 투여를 위해 섹션 1.6을 반복하십시오.
    참고: 동일한 부피의 식염수(쥐당 2 mL)를 투여하여 혈청을 준비하고 시험관내 검사를 위한 빈 대조군역할을 한다.
  5. GSK 함유 세럼의 제조
    1. GSK 과립의 마지막 투여 후 80 mg /kg 케타민 1 시간의 300 mL / 100 g으로 쥐를 심상 으로 마취시다. 쥐가 완전히 마취되었는지 확인하기 위해 발가락의 바늘 핀치를 사용합니다. 어떤 응답도 성공적인 마취를 나타냅니다.
    2. 피부와 복막을 절개 한 후 직선 작동 가위를 사용하여 쥐의 흉부 바닥에 복부를 노출.
      참고: 수술기구는 사용하기 전에 고온 고압에서 소독해야 합니다. 수술 부위는 혈액 채취 중에 70 % 에탄올로 살균해야합니다.
    3. 혈관을 명확하게 노출시키기 위하여 티슈 페이퍼로 복부 대관의 결합 조직을 제거하십시오.
    4. 10 mL, 22 G 주사기를 사용하여 복부 대류에서 혈액을 뽑습니다. 그런 다음 바늘을 제거하고 혈액을 15 mL 멸균 튜브로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 제거합니다. 보통, 혈액의 6-8 mL는 한 쥐에게서 얻을 수 있습니다.
      참고: 각 쥐는 피를 뽑을 때 살아 있어야 합니다. 한 가지 지표는 쥐가 살아있을 때 복부 대관이 맥동한다는 것입니다. 쥐는 혈액 무승부 후 죽었다.
    5. 혈액이 튜브에 응고 될 때까지 30-60 분 동안 실온에서 튜브를 똑바로 유지하십시오. 그런 다음 튜브를 500-600 x g에서 20 분 동안 원심 분리합니다.
    6. 30분 동안 56°C 수조에서 배양하여 혈청을 불활성화시고, 0.22-모공 크기의 친수성 폴리에설포주필터를 사용하여 혈청을 여과한다. 장기간 사용(1년 미만)을 위해 -80°C에서 보관하십시오.
      참고: 여과된 혈청은 시험관 내 골관절염 및 골아세포 발생에 사용될 수 있다.
  6. 응용 프로그램
    1. 시험관 내 골성형술 발생
      1. L-글루타민, 리보뉴클레오시드, 및 데옥시리보뉴클레오시드를 함유하는 최소 이글 배지(α-MEM)를 1:4의 비율로 GSK 함유 혈청(GSKL, GSKM, GSKH)의 3가지 투여량을 희석한다.
        참고 : 체외 골다강 발생 및 골아세포 발생에 대한 GSK 함유 혈청의 최종 농도가 20 %인지 확인하십시오.
      2. 희석된 GSK 함유 혈청(200 μL/well)을 단계 3.6.1.1에서 골수 대식세포(BMM)에 4-6주 령 C57BL/6 마우스에서 골수 세포증을 유발하고 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF, 10 ng/mL)로 BmM을 자극합니다. 앞서 설명한 바와 같이 핵 인자-θB 리간드(RANKL, 100 ng/mL)에 대한2.
    2. 시험관 내 골아세포증
      1. 3.6.1.1단계를 반복합니다.
      2. 희석된 GSK 함유 혈청(2 mL/well)을 4-6주 된 C57BL/6 마우스로부터 뼈 중간엽 줄기 세포(BMSCs)에 첨가하여 앞서 설명한 바와 같이 골합을 생성한다16.

결과

마이크로 CT 스캐닝 결과는 OVX 마우스가 식염수 대조군마우스에 비해 상당한 뼈 손실을 보였다는 것을 나타냈다(도 1A). GSK 과립의 개입(90일)은 특히 GSKM 군에서 BMD를크게 증가시켰습니다(도 1B). BMD, BV/TV, Tb.N 및 Tb.Th 같은 뼈 구조 파라미터를 정량화했습니다. GSK 과립 치료는 증가 BMD를 주도, BV / TV, Tb.N과 Tb.T...

토론

한 의학 제제의 과립 제형 또는 처방에 대 한 일반적인 선택 중 하나가 되고있다. GSK 과립은 임상 경험 또는 한의학 이론에 근거한 몇몇 한방 약으로 구성되고,적은 부작용으로 더 나은 치료 효력을 발휘합니다 4. 물 달인에 비해, 과립은 다음과 같은 장점이 있습니다 : 좋은 맛, 배달의 편리성, 장기 저장, 표준 프로토콜 및 일관된 치료 효과뿐만 아니라 높은 생산성. 현재, 과립은 ...

공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

이 연구는 중국 국립 자연과학 재단(81804116, 81673991, 81770107, 81603643, 81330085), 혁신팀, 중국 과학기술부(2015RA4002 ~ WYJ)의 보조금으로 지원되었다. 혁신팀, 중국교육부(IRT1270 to WYJ), 상하이 TCM 만성질환 의료센터(2017ZZ01010 ~ WYJ), 중국 전통 의학 계획 개발을 가속화하기 위한 3년간의 조치(ZY(2018-2020-WYJ) -CCCX-3003 국가 핵심 연구 개발 프로젝트 (2018YFC1704302).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
α-MEMHyclone
laboratories		SH30265.018For cell culture
β-GlycerophosphateSigmaG5422Osteoblastogenesis
Caltrate (CAL)WyethL96625Animal interventation
C57BL/6 miceSLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		RandomAinimal preparation
DexamethsomeSigmaD4902
Dimethyl sulfoxideSigmaD2438Cell frozen
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)Sangon Biotech60-00-4Samples treatmnet
Fetal bovine serumGibcoFL-24562For cell culture
Gushukang granuleskangcheng companyin chinaZ20003255Herbal prescription
Light microscopeOlympus BX50Olympus BX50Images for osteoclastogenesis
L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrateSigmaA8960-5GOsteoblastogenesis
MicroscopeLeicaDMI300BOsteocast and osteoblast imagine
M-CSFPeprotechAF-300-25-10Osteoclastogenesis
Μicro-CTScanco
Medical AG		μCT80 radiograph microtomographBone Structural analsysis
RANKLPeprotech11682-HNCHFOsteoclastogenesis
Sprague DawleySLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		RandomBlood serum collection
Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) KitSigma-Aldrich387A-1KTTRAP staining

참고문헌

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  6. Zhao, D., et al. Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).
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