PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환

요약

이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포를 유도성 piggyBac 벡터에서 전사 인자의 발현에 의해 척추 또는 두개골 정체성을 가진 모터 뉴런으로 신속 하 고 효율적으로 전환 할 수 있습니다.

초록

우리는 여기에서 인간 유도 만능 줄기 세포 로부터 기능적 척추 및 두개골 운동 뉴런을 얻는 방법을 설명 한다 (iPSCs). 운동 뉴런으로의 직접 전환은 전사 인자의 대체 모듈, 즉 Ngn2, Isl1 및 Lhx3 (NIL) 또는 Ngn2, Isl1 및 Phox2a (닙)의 자 궁 외 발현에 의해 얻어진 다. NIL과 닙은 각각 척추와 두개골 운동 신경 정체성을 지정 합니다. 우리의 프로토콜은 NIL 또는 닙이 piggyBac 전치 벡터를 통해 게놈에 안정적으로 통합 되는 수정 된 iPSC 라인의 생성으로 시작 합니다. 트랜스 유전자의 발현은 이어서 독 시 사이 클린에 의해 유도 되 고, 5 일 후에, iPSCs를 MN 조상로 전환 한다. 이후 성숙, 7 일 동안, 척추 또는 두개골 MNs의 동종 인구에 이르게. 우리의 방법은 이전 프로토콜에 비해 몇 가지 장점을 보유: 그것은 매우 신속 하 고 단순화; 그것은 바이러스 감염이 나 추가 MN 격리를 필요로 하지 않습니다; 그것은 활동 전위의 기차를 발사 하는 능력에 의해 입증 된 대로, 성숙의 놀라운 학위와 다른 MN 하위 인구 (척추와 두개골)를 생성 할 수 있습니다. 더욱이, 다 수의 모터 뉴런은 혼합 된 집단 으로부터 정제 없이 얻어질 수 있다. iPSC 유래 척추 및 두개골 모터 뉴런은 운동 신경의 근 위축 성 측 삭 경화 증 및 기타 신경 변성 질환의 시험관 내 모델링에 사용 될 수 있다. 균질 한 운동 뉴런 집단은 세포 형 특정 약물 스크리닝을 위한 중요 한 자원을 나타낼 수 있다.

서문

운동 뉴런 (MN) 변성은 근 위축 성 측 삭 경화 증 (ALS)과 척추 근육 위축 (SMA)과 같은 인간의 질병에서 원인 역할을 한다. 인간 MN의 복잡성을 탈환 하는 적절 한 시험관 내 셀 모델 시스템을 확립 하는 것은 새로운 치료 접근법의 개발을 향한 중요 한 단계 이다. 유도 만능 줄기 세포 (ipscs)는 주목할 만한 복수형 다이 신 분화 특성을 부여 받고 있으며, 이제는 운동 신경 질환^1,2에 의해 영향을 받는 많은 환자 로부터 유래 되었다. MN 질환에 관련 된 병원 성 돌연변이를 운반 하는 추가 iPSC 라인은 제어 "건강 한" 만능 줄기 세포 로부터 시작 하 여 유전자 편집에 의해 생성 되었다³. 이들 라인은 MNs로의 iPSC 분화를 위한 적절 한 방법이 제공 되는 경우 시험관 내 질병 모델링 및 약물 스크리닝에 유용한 도구를 나타낸다. 이 방법의 개발 뒤에 이론적 근거는 성숙한 기능적인 MNs를 초래 하는 빠르고 능률적인 분화 프로토콜을 가진 MN 질병에 관심 있는 과학적인 공동체를 제공 하기 위한 것입니다. 이 방법의 첫 번째 이점은 실행 시간입니다. 또 다른 강도의 포인트는 정제 단계의 제거에서 온다. 마지막으로, 프로토콜은 모터 뉴런의 두 개의 별개의 인구를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.

MNs의 다른 특수형을 생성 하는 가능성은 MN 질병의 모형 화를 위해 특히 관련 됩니다. 모든 MN 특수형은 ALS와 SMA에서 동등 하 게 취약 하 그리고 다른 모터 단위에 있는 현상의 개시는 크게 예 후에 영향을 미칩니다. ALS에서, 상부 및 하 부 사지에서 시작 하는 현상에 척추 발병은 약 3-5 년에서 죽음으로 이끌어 냅니다⁴. 반대로, 두개골 MNs의 변성으로 시작 하는 불 바 발병은 최악의 예 후를가지고 있습니다. 더욱이, 불 바 발병의 비율은 RNA 결합 단백질 인 스와 TDP-43의 돌연변이 환자에서 SOD1 돌연변이를 가진 개인 보다 현저히 높다⁵. 대체 MN 분화 프로토콜의 총합은 레 틴 산 (RA)의 활동에 의존 하 여 ipscs^6,7,8을 차별화 하는 척추 문자를 부여 합니다. 이것은 특정 MN 특수형^9,10에서 방어적 일 수 있던 본질적인 요인 연구의 가능성을 제한 합니다.

마우스 배아 줄기 세포 (¹¹)의 이전 작업과 일치 하 여, 우리는 최근에 인간 Ipscs에서 Ngn2, Isl1 및 LHX3 (전무)의 발현이 척추 MN 동일성을 유도 하는 반면 Ngn2 및 Isl1 플러스 PHOX2A (닙)는 두개골 MNs (¹²)를 지정 하는 것으로 나타났다. 우리는 따라서 효율적인 프로토콜을 개발 하 여 12 일의 턴 어 라운드에서 기능적 특성을 부여 하는 인간 MNs의 생산으로 이끌어 냅니다. 이 방법의 목적은 정제 (예를 들어, FACS)에 대 한 필요 없이 짧은 시간 프레임에서, 척추 또는 두개골 동일성을 가진 MNs에 대해 고도로 농축 된 세포 집단을 구하는 것 이다.

프로토콜

1. 인간 iPSCs의 유지 보수

1. 매트릭스 코팅 플레이트의 제조
   1. 4 ° c에서 하룻밤 동안 매트릭스의 5 mL 유리병 1 개를 해 동 ( 재료 표참조) 합니다. 원래 매트릭스 주식은 다른 주식 농도에서와 서, 개별 로트에 대 한 특정 데이터 시트에 표시 된 희석 계수에 따라 만들어집니다. 이 매트릭스의 조기 겔 화를 방지 하기 위해 바이 알 및 튜브 얼음 추위를 유지 하는 것이 중요 하다. 얼음에 미리 냉장 된 저온 튜브에 매트릭스를 추출 합니다. 미사용 분 취 액을-20°c에서 고정 합니다.
   2. 약 2 시간 동안 얼음에 1 개를 넣고 해 동 합니다.
   3. 50 mL 원뿔형 튜브에서 20 mL의 콜드 DMEM/F12를 사용 하 여 매트릭스의 취 액을 희석 하십시오.
   4. 잘 섞어서 희석 된 매트릭스 1 mL을 35 mm의 접시에 덜어 냅니다 (다른 요리의 표면적 당 균등 한 양).
   5. 코팅을 허용 하기 위해 실 온에서 1 시간 동안 희석 된 매트릭스를 포함 하는 접시를 보관 하십시오.
      참고: 파라 필름으로 밀봉 된 요리는 최대 2 주 동안 4°c에서 보관할 수 있습니다.
2. 부드러운 세포 해리 시 약의 원 액 (20ml) 및 1x 작동의 제조 ( 재질 표참조).
   1. 분말을 PBS에서 10 밀리 그램/mL에 녹여드 십시오.
   2. 필터는 0.22 μ m 필터 멤브레인을 통해 멸 균 합니다.
   3. 20 분의 1을 준비 하 고 20 ° c에서 보관 하십시오.
   4. 사용 하기 전에 PBS에 1 개를 희석 하십시오 (Ca^{2 +}/밀리 그램⁺ 무료).
      참고: 1 배 작업을 할 경우 최대 2 주 동안 4°c에서 보관할 수 있습니다.
3. 인간 iPSCs를 통행.
   1. 시작 하기 전에: 4°c에서 저장 하는 경우, 37 ° c에서 20-30 분 동안 인큐베이터에서 사전 따뜻한 매트릭스 코팅 플레이트 인간 iPSC 배지 ( 재료 표참조)의 양이 필요 합니다. DMEM/F12를 미리 따뜻하게 합니다.
   2. 흡 기 배지.
   3. PBS로 iPSCs를 헹 구 십시오 (^{2 +2} + 무료).
   4. 1x 부드러운 해리 용액 (0.5 35 mm 접시)을 추가 합니다. 콜로 니의 가장자리가 플레이트에서 분리 되기 시작할 때까지 37 ° c에서 배양, 일반적으로 3-5 분.
   5. IPSC 콜로 니를 분리 하지 않도록 조심 하면서 부드러운 해리 용액을 흡입 합니다.
   6. 세포를 DMEM/F12 (35 mm의 접시)로 씻고 세포를 분리 하지 않도록 주의 하십시오. 이 단계를 한 번 더 반복 합니다.
   7. 인간의 iPSC 배지를 추가 (35 mm 접시에 대 한 1 mL).
   8. 셀 리프 터로 콜로 니를 부드럽게 분리 하 고 15 mL 튜브로 이동 합니다.
   9. P1000 pior 3-4 시간으로 위아래로 파이 펫 팅 하 여 세포 덩어리를 부드럽게 분해 하십시오.
   10. 매트릭스 코팅 플레이트 (들) 로부터 상층 액을 흡입 한다.
   11. 인간 iPSC 배지의 적절 한 배양 부피에서 세포를 종자. 분할 비율은 라인 마다 다를 수 있으며 약 1:4-1:8입니다. 매일 배지를 변경 합니다.

2. NIL 및 닙 유도성 iPSC 라인의 생성

1. 세포 형질 감염.
   1. PBS로 세포를 헹 구 십시오 (²+ 2 + 무료).
   2. 세포 해리 시 약 ( 재료 표참조) (35 mm 접시 0.35)을 추가 하 고 단일 세포가 분리 될 때까지 37 ° c에서 배양 합니다 (5-10 분).
   3. P1000 pior 3-4 번을 사용 하 여 위아래로 파이 펫 팅 하 여 세포 분리를 부드럽게 완료 합니다.
   4. 15ml 튜브에 넣고 10ml에 PBS (^{2 +}/밀리 그램^{2 +} 무료)를 추가 합니다. 셀 수를 계산 합니다.
   5. 펠 렛 (전기 천공 셀 키트에 포함 된 버퍼 R의 100 μ l에서⁶ 개의 세포와 소생 된 10p(1 개 물질 표참조).
   6. 형질 감염에 대 한 플라스 미드 DNA 추가: transposable 벡터의 4.5 μ g (epB-Bsd-닐 또는 epB-Bsd-TT-닙) 및 0.5 μ g의 피 gybac transposable 플라스 미드¹³.
   7. 형질 주입는 다음 매개 변수를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 앞에서 설명한³ 과 같이 셀 전기 천공 시스템 ( 재료 표참조)을 사용 합니다. 1200 V 전압, 30ms 폭, 1 펄스 6mm 매트릭스 코팅 접시에 10 μ m Y-27632 (락 저 해제, 물질 표참조)로 보충 된 인간 ipsc 배지에서 세포를 종자.
2. 항생제로 선택.
   1. 형질 감염 후 이틀 후, 배양 배지에 5 μ g/m l blasticidin을 첨가 한다.
   2. 비 형질 세포의 대부분은 blasticidin 선택의 48 시간 이내에 죽을 것 이다. 게놈에서 트랜스 유전자를 통합 하지 않은 세포를 반대 선택 하기 위해 적어도 7-10 일 동안 blasticidin의 세포를 유지 한다.
   3. 서로 다른 수의 트랜스 유전자와 상이한 통합 부위를 가진 세포로 구성 된 혼합 집단으로 서 안정적으로 형질 감염 된 세포를 유지 하거나 단일 클론을 격리 한다.
   4. 트랜스 유전자의 효과적인 발현을 확인 하기 위해 추가의 요리를 준비 하 고, 1 μ g/m l의도 자일로 핀 유도 시, Ngn2에 대 한 유전자 이식 특이 적 프라이 머를 RT-PCR에 의해 (앞으로) 역: 앞에서 설명한 바와 같이,¹².
   5. 이 단계에서, 인간 Ipsc를 위한 냉동 매 질에서 신규 한 전무 및 닙-iPSC 라인의 주식을 동결 한다 ( 물질 표참조).

3. 모터 신경 분화

1. 설명 된 대로 세포 해리 시 약으로 셀을 해리 합니다 (단계 2.1.1. 15 mL 튜브에서 해리 된 세포를 수집 하 고 DMEM의 5 볼륨/F12로 희석 하십시오. 10 μ m 록 억제제로 보충 된 인간 iPSC 배지에서 세포 및 소생을 펠 렛. 62500 셀/cm²의 밀도로 매트릭스 코팅 요리의 세포와 종자를 계산 하십시오.
2. 다음날, 배지를 DMEM/F12로 교체 하 고 안정한 L-글루타민 아날로그 1x 비 필수 아미노산 (NEAA) 세포 배양 보조 제와 0.5 x 페니실린/streptomycin을 보충 하 고 1 μ g/m l doxyine을 함유 한다. 이것은 분화의 첫날 0으로 간주 됩니다. 1 일째에는 배지와 독 시 사이 클린을 새로 고칩니다.
3. 2 일째에 배지를 신경 기저/B27 배지로 변경 (1x B27으로 보충 된 신경 기저 배지, 1 배 안정한 L-글루타민 아날로그, 1x NEAA 및 0.5x 페니실린/streptomycin), 5 μ m DAPT, 4 μ m SU5402 및 2 μ g/mL의도 시 사이 클린을 함유 합니다 (재료 표 참조). ). 5 일째까지 매일 배지와 독 시 사이 클린을 새로 고칩니다.
4. 5 일: 세포 해리 시 약으로 세포 해리 ( 재질 표참조).
   1. PBS로 세포를 헹 구 십시오 (²+ 2 + 무료).
   2. 세포 해리 시 약 (0.35 35 mm 접시)을 추가 하 고 전체 세포 단층이 접시에서 분리 될 때까지 37 ° c에서 배양 합니다. 단 하나 세포는 인큐베이션 도중 분리 되지 않을 것 이라는 점을 유의 하십시오.
   3. DMEM/F12 1 mL를 넣고 15 mL 튜브에 세포를 수집 합니다.
   4. P1000 pior 10-15 번을 사용 하 여 위아래로 파이 펫 팅 하 여 세포 분리를 부드럽게 완료 합니다.
   5. DMEM/F12의 4 mL를 추가 하 고 셀을 카운트.
   6. 이 단계에서, 냉동 모터 뉴런은 제조 지침에 따라 세포 동결 매체 ( 재료 표참조)에서 조상.
   7. 10 μ m 록 억제제로 보충 된 세포와 소생 된 뉴런 배지 (20 ng/mL BDNF, 10ng/ml GDNF 및 200 ng/ml 의L-아 스 코르 브 산을 보충 하는 것과 함께 보완 된 신경 기저/B27 배지를 펠 렛.
   8. 폴 리 오 르 니 틴/라미 닌 또는 대안적으로 10만 세포의 밀도에서 매트릭스 코팅 지원에 세포를 종자/cm². 면역 염색 분석을 위한 고분자 커버 슬립 ( 재료 표참조)과 함께 µ 플라스틱 지지대를 사용 하십시오.
5. 6 일째에, 록 억제제가 없는 신선한 신경 매체를 사용 하 여 배지를 변경 하십시오. 다음 날, 매 3 일 마다 미디어의 절반을 새로 고칩니다. 배양 액은 표면 으로부터의 박 리를 방지 하기 위하여 매우 신중 하 게 변경 되어야 한다.

4. 면역 염색 분석

1. 세포 고정. 세포를 PBS로 헹 구 고 (Ca²+/mg^{2 +}) 실 온에서 4% 파라 포름알데히드 (ca 2+/mg/2 +)로 15 분간배양 합니다.
   주의: 파라 포 름 알 데히드는 독성이 며 암을 유발 하는 것으로 의심 됩니다. 피부와 눈에 닿지 않도록 하 고 화학 증기 두건에서 다루십시오.
2. 상 온에서 5 분 동안 0.1% 트리톤 X-100을 함유 하는 PBS (Ca^{2 이상}/^{2 +})와의 투과.
3. 항 체 차단 용액에서 상 온에서 30 분 동안 배양 하 여 Ca^{2 +}/Mg^{2 +}와 함께 PBS에서 3% BSA를 사용 합니다.
4. 아 BS에 있는 1 차적인 항 체를 가진 상 온에서 1h를 위해 배양 하십시오: 반대로 TUJ1 (1:1000; 1:200 Oct4) 및 안티-채팅 (안티-콜린 1:150 Acetyltransferase; 재료 표를 참조 하십시오.
5. 적절 한 당나귀 2 차 항 체를 사용 하 여 상 온에서 45 분 동안 배양 합니다. 안티 마우스 알 렉 사 Fluor 647 (1:250), 안티 토끼 알 렉 사 fluor 594 (1:250) 및 안티 염소 알 렉 사와 플 라 이나 488 (1:250). 재료 표를 참조 하십시오.
6. 실 온에서 5 분 동안 0.4 μ g/mL DAPI를 배양 하 여 핵에 라벨을 지정 합니다.
7. 형광 현미경으로 이미징 하기 위해 장착 매체 ( 재료 표참조)로 셀을 마운트합니다.

5. 패치 클램프 레코딩을 통한 기능적 특성화

1. 다음과 같이 헤 지-평형 외부 용액 (NES)을 준비 합니다. 140 염화 나트륨, 2.8 mm의 CaCl₂, 2Mm mgcl₂, 10mm 헵 및 10mm 포도 당. 오 스몰 농도를 290-300 m ω 사이로 설정 합니다. 1N NaOH를 사용 하 여 pH를 7.3로 조정 하 고 4°c에서 용액을 저장 한다.
2. 내부 솔루션 준비: 140 Mmk 글 루 콘 글 루 콘, 5mm 바 브, 2mm의 MgCl 210mm헵, 0.3 mm NA-gtp. 1M KOH로 pH를 7.3로 조정 하 고 오 스몰 농도 290 m ω으로 설정 되어 있는지 확인 합니다. 용액을-20°c에서 작은 알리 쿠 트에 고정 하십시오.
3. 실험을 실행 하기 전에, 물 욕조에 NES 용액을 약 28-30 ° c로 예 열 한다.
4. 일부 붕 규 산 마이크로 피 펫을 당겨 (ID 0.86 mm; OD 1.5 mm) 팁 저항 베어링: 5-6 m ω을 입력 하 고 피 펫 홀더에 장착 하기 전에 세포내 용액으로 채웁니다.
   참고: 와이어 표면에 AgCl의 균일 한 층을 형성 하기 위해 적어도 30 분 동안 표 백제에 기록 전극 및 기준 전극의 염화 물은 와이어를 기억 한다.
5. 기록 챔버에서 페 트리 접시를 전송 하 고 1-2 m l/min에서 NES 솔루션 챔버를 보자. 용액을 따뜻하게 유지 하기 위해 30 ° c의 온도에서 설정 된 인라인 히터를 통과 하는 흐름을 보자.
6. 전기 생리학적 기록 챔버를 직 립 현미경으로 배치 합니다. 패치 클램프 증폭기로 멤브레인 전류를 기록 하 고 적절 한 소프트웨어로 데이터를 수집 합니다.
7. 앰프 제어 소프트웨어를 열고 값 1과 베셀 필터의 신호 게인을 10Khz로 설정 합니다. Bessel 필터가 샘플링 주파수 보다 2.5 배 낮은 지 확인 하십시오.
8. 기록 소프트웨어에서 전압 클램프 및 전류 클램프 실험에 대 한 실험적 프로토콜을 설정 합니다.
9. 프로토콜 설정에서 에피소드 자극 모드를 선택 하 고 샘플링 주파수를 25khz로 설정 합니다. 그런 다음 파형 탭으로 이동 하 여 전압 또는 현재 단계 진폭 및 길이를 다음과 같이 입력 합니다.
10. 전압 게이팅 나트륨 전류의 경우-100 mV ~ + 40 mV (10mv 증가)에서 15 개의 전압 단계 (각각 50 밀리초)를 사용 합니다. 패치 된 셀에 적용 한 후 증폭기를 통해-60 mV의 보유 전위를 유지 한 후 프로토콜을 실행 합니다. 마찬가지로, 전압 게이팅 된 칼륨 전류는 기록 된 셀을-40 mV를 유지 하는-30mv ~ + 50 mV (10mv 증분)에서 전압 단계 (각각 250 ms 지속 시간)에 의해 유발 됩니다.
11. IPSC 유래 두개골과 척추 MNs의 소성 특성을 조사 하는 경우, 전류 클램프 모드에서-70 mV의 멤브레인 전위를 사용 하 고 증가 하는 진폭 (+ 20pa ~ + 80 pA에서 4 개의 전류 펄스)을 사용할 수 있습니다.
12. 각 셀 전압 활성화 전류를 획득 하 고 전체 셀 커패시턴스 (Cm), 세포 막 저항 (Rm) 및 휴식 막 전위 (RMP)로 서의 소성 활성 및 3 개의 패시브 특성을 유발 합니다.

결과

분화 방법에 대 한 개략적인 설명을 도 1에 나타내 었 다. 인체 iPSCs (WT I 라인³)는 epb-유도성 및 엡-닙으로 서,이 하에서 blasticidin 선택에 의해 생성 되 고, 안정적이 고, 그리고이 하 세포 주 (¹²) 들을 각각에 펙 스-닐 및 ipscs-닙에 의해 서 형질 감염 시켰다. 분화 세포는 다능 성 마커 OCT4 및 범 뉴런 마커 TUJ1의 발현을 특징으로 하였다. 면역 ?...

토론

이 프로토콜은 효율적으로 인간 ipscs를 척추 및 두개골 운동 뉴런으로 변환 하 여 계보 관련 특정 전사 인자의 자 궁 외 발현을 가능 하 게 합니다. 이들 트랜스 유전자는 독 시 사이 클린에 의해 유도성 되 고, piggyBac 전치 자 기반 벡터 덕분에 게놈에 안정적으로 통합 된다. 혼합 된 집단에서, piggyBac 벡터의 하나 또는 여러 사본은 개별 세포의 게놈에 무작위로 통합 될 것이 고, 게놈 완전성 변경의 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Bapta	Sigma-Aldrich	A4926-1G	chemicals for electrophysiological solutions
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Cell dissociation reagent
anti-CHAT	EMD Millipore	AB144P	Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003
anti-goat Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11055	Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848
anti-mouse Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A31571	Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130
anti-Oct4	BD Biosciences	611202	Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722
anti-Phox2b	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-376997	Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117
anti-rabbit Alexa Fluor 594	Immunological Sciences	IS-20152-1	Secondary antibody used for immonofluorescence assays
anti-TUJ1	Sigma-Aldrich	T2200	Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors
BDNF	PreproTech	450-02	Brain-Derived Neurotrophic Factor
Blasticidin	Sigma-Aldrich	203350	Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes
BSA	Sigma-Aldrich	A2153	Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	chemicals for electrophysiological solutions
Clampex 10 software	Molecular Devices	Clampex 10	Membrane currents recording system
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA	Biological Industries	05-710-1E	Freezing medium for human iPSCs
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5146	chemicals for electrophysiological solutions
DAPI powder	Roche	10236276001	4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays
DAPT	AdipoGen	AG-CR1-0016-M005	Gamma secretase inhibitor
Dispase	Gibco	17105-041	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Basal medium for cell culture
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Commercial human iPSC line
E.Z.N.A Total RNA Kit	Omega bio-tek	R6834-02	Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells
GDNF	PreproTech	450-10	Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line	Thermo Fisher Scientific	A18945	Commercial human iPSC line
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050038	An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health.
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	chemicals for electrophysiological solutions
iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR	Bio-Rad	1708841	Kit for gene expression analysis using real-time qPCR
iTaqTM Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121	Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument
K-Gluconate	Sigma-Aldrich	G4500	chemicals for electrophysiological solutions
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	chemicals for electrophysiological solutions
L-ascorbic acid	LKT Laboratories	A7210	Used in cell culture as an antioxidant
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Laser scanning confocal microscope	Olympus	iX83 FluoView1200	Confocal microscope for acquisition of immunostaining images
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187	chemicals for electrophysiological solutions
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	chemicals for electrophysiological solutions
Mounting Medium	Ibidi	50001	Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays
Multiclamp patch-clamp amplifier	Molecular Devices	700B	Membrane currents recording system
Na-GTP	Sigma-Aldrich	G8877	chemicals for electrophysiological solutions
NaCl	Sigma-Aldrich	71376	chemicals for electrophysiological solutions
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 μL Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Cell electroporation kit
Neon Transfection System	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Cell electroporation system
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049	Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FF	Biological Industries	05-100-1A	Human iPSC culture medium
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	157-8	Used for cell fixation in immunostaining assays
PBS	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, with Calcium, with Magnesium
PBS Ca2+/Mg2+ free	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
poly-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5MG	Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays
Upright microscope	Olympus	BX51VI	Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera
Y-27632  (ROCK inhibitor)	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005	Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival
μ-Slide 8 Well	Ibidi	80826	Support for high–end microscopic analysis of fixed cells