면역의 혼합된 공상 모델에 Photoactivation에 의해 개별 Autoreactive 어린 싹 센터 질문

요약

이 프로토콜 어떤 autoreactive 세포 photoactivatable 녹색 형광 단백질 (GFP PA) 기자를가지고 자연 면역 어린 싹 센터와 혼합된 murine 골 키메라의 생성을 설명 합니다. 이 다운스트림 분자 및 기능 분석 조직에 세포 위치를 연결 하는 기능을 제공 합니다.

초록

자가 면역 질환은 중요 한 건강 부담 제시. 개발 및 자가 면역 질환의 진행에 관한 근본적인 질문은 답이 남아 있다. 기본 질병 메커니즘 및 세포 역학의 우리의 이해에 있는 전진에 대 한 요구 사항 중 하나는 다운스트림 분자 또는 기능 분석; 셀 하위 집합의 microanatomical 위치의 정확한 커플링 전통적으로 달성 하기 어려운 목표. 안정적인 photoactivatable 생물 fluorophores 기자 긴장에 그들의 통합의 개발은 최근 정확한 microanatomical 라벨 및 murine 모델에서 세포 부분 집합의 추적 활성화 됩니다. 여기, 우리가 설명 어떻게 autoreactive 림프 구 단일 본 원 센터에서 분석 하는 능력 면역에 새로운 통찰력을 제공 하기 위해 도움이 될 수 있습니다 예를 들어 photoactivatable 기자와 면역의 소설 공상 모델의 조합을 사용 하 여 . 생성 하기 위한 절차 섞인 키메라 자발적인 autoreactive 어린 싹 센터 photoactivatable 녹색 형광 단백질 리포터를 운반 하는 림프 톨에 의해 채워진 설명 합니다. Vivo에서 레이블 전략을 사용 하 여, 단일 어린 싹 센터 수 구상 될 explanted 림프 조직에 그들의 세포 성분 photoactivated 2 광자 현미경 검사 법에 의해. 단일 본 원 센터에서 림프 톨 Photoactivated 다음 분석할 수 있습니다 또는 단일 셀 또는 대량, 흐름 cytometrically를 정렬 하 고 추가 다운스트림 분자 및 기능 분석을 받게 될 수 있습니다. 이 방법은 직접 면역의 분야에서 새로운된 통찰력을 제공 하기 위해 적용 될 수 있습니다 하지만 골 키메라와 photoactivation 프로시저 생성 하기 위한 절차 또한 전염병의 연구에서 광범위 한 응용 프로그램을 찾을 수 있습니다, 종양 전이입니다.

서문

자가 면역 질환의 발병 률 특히 서양 사회에서에서 지난 수십 년간에서 급속 하 게 상승 했다. 오늘, 자가 면역 질환의 병 적 상태와 사망률¹서방 세계 가장 널리 퍼진 원인의 목록에 3 계급. 개발 및 자가 면역 질환의 진행에 관한 근본적인 질문은 답이 남아 있다. 기본 질병 메커니즘 및 세포 역학의 우리의 이해에 있는 전진에 대 한 요구 사항 중 하나는 다운스트림 분자 또는 기능적인 분석 셀 하위 집합의 microanatomical 위치의 정확한 커플링. 지난 10 년간에서 정확한 microanatomical 라벨 및 추적 휴대의 안정적인 photoconvertible, photoactivatable, 또는 photoswitchable 생물 fluorophores 기자 긴장에 그들의 통합의 숫자의 개발이 활성화 murine 모델에서 하위 집합입니다.

데, 돌 산호에서 발생 하는 photoconvertible 형광 단백질 보라 빛 또는 자외선 빛²노출 시 붉은 형광을 녹색 형광에서 돌이킬 수 없는 photoconversion를 겪 습. Organotypic 뇌 조각³개발에 개별 셀의 동적 동작을 따라 처음 고용, 세대의 노크 마우스 이후에 허용 vivo에서 세포 움직임을 모니터링 하는 데와 시스템의 분석에 적용 된 면역 세포는 림프절⁴에서 마이그레이션. 이 접근은 2 세대 기자⁵이후 세련 된 이었다. 유사한 기자 Dendra입니다⁶, 최근 vivo⁷림프절 전이 추적 하는 데 사용 했다.

첫 번째 photoactivatable 단백질 개발 녹색 형광 단백질 (GFP) 단일 지점 돌연변이 (T203H), 설계 된 550 nm⁸450에서 파장 영역에서 매우 낮은 흡 광도을 선도 했다. 보라색 빛에 의해 photoactivation, 후이 photoactivatable 녹색 형광 단백질 (GFP PA) 스위치를 400 ~ 흡수 최대 ~ 500 nm, 저조한 대략 100 강도 증가 488의 파장 nm. 모든 조 혈 모 세포가 PA GFP를 표현 하는 유전자 변형 생쥐의 생성 허용, 처음으로, 어린 싹 센터⁹의 해부학 정의 빛과 어두운 영역에서 B 세포 선택의 심층 분석.

Photoactivation 형광 상태로 비 형광 상태에서 돌이킬 수 없는 변환 이며 photoconversion는 다른 1 개의 파장에서 단방향 전환, 반면 photoswitchable 단백질^{10 두 조건 사이 셔틀 수 있습니다.} . 이 후자의 능력은 최근 단백질 활동¹¹의 광학 제어를 무력화 됩니다.

PA GFP 기자를 활용 하 여, 우리 최근 자발적인 루 푸 스 같은 자가 면역¹²의 새로운 모델에서 단일 어린 싹 센터 B 세포 레파토리를 특징. 이 모델은 1 개 부품 골 autoreactive B 세포 수용 체 노크에는으로 ribonuclear-단백질 복합물 (564Igi^13,14)에 대 한 2 개 부품에서 골 수를 함께 품고 함께 혼합된 키메라 기반 원하는 기증자입니다. 약 6 주 게시물 재구성에 항상성 조건 어떤 자발적인 autoreactive 어린 싹 센터 장과 피부 림프절에는 달성 된다. 특히, 어린 싹 센터 B 세포 인구는 거의 독점적으로 (~ 95%) 비 564Igi 구획에서 파생 된 셀으로 구성 하 고 이러한 야생 유형 파생 B 세포 autoreactive 되었다. 따라서, 모델, 사용 하 여 다양 한 transgenes 노크 아웃 기자 autoreactive 어린 싹 센터 B 세포의 분석에 대 한 ' 플러그와 플레이 ' 접근 수 있습니다. 여기, 우리는 자발적인 autoreactive 어린 싹 센터 PA GFP 기자를 운반 하는 림프 톨에 의해 채워집니다와 혼합된 키메라를 생성 하기 위한 절차를 설명 합니다. Vivo에서 레이블 전략을 사용 하 여, 단일 어린 싹 센터 explanted 림프 조직에 그들의 세포 성분 photoactivated 2 광자 현미경을 사용 하 여 구상 될 수 있습니다. 단일 본 원 센터에서 Photoactivated 세포 수 이후에 cytometry 분석 또는 형광 색소 활성화 셀 정렬 (FACS)에 의해 정렬 되며 추가 다운스트림 분자 및 기능 분석을 복종. 단일 본 원 센터에서 autoreactive 세포를 분석 하는 능력 직접 면역의 분야에서 새로운된 통찰력을 제공 하기 위해 적용 될 수 있습니다 하지만 기술과 설명 하는 방법을 찾을 수 있습니다 또한 관련 응용 프로그램의 연구에 감염 증 그리고 종양 전이입니다.

프로토콜

모든 동물 사용 유럽 공동체 지침을 준수 하 고 덴마크 동물 연구 검사자 (2017-15-0201-01348)에 의해 승인 되었다.

1. 일반 마우스 축산 및 버퍼 및 도구 준비

1. 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 조건에서 표준 지침에 따라 건강 상태를 정기적으로 모니터링을 집 마우스 라인.
2. 선택 사항: 순진한 쥐 비 모니터링 우발적인 감염 때문에 자발적인 어린 싹 센터의 부재를 확인 합니다. 이 면역 형광 검사 현미경 검사 법 (어린 싹 센터 구조의 존재)에 의해 할 수 있다 또는 흐름을 앞에서 설명한¹²cytometry (어린 싹 센터 B 세포의 주파수).
   참고: 어느 여성 또는 남성을 사용할 수 있습니다. 일반적으로, 섹스의 불일치가 발생할 수 있습니다 이론적으로 남성 Y 항으로 alloreactivity 여성 받는 사람/기증자¹⁵로 섹스 일치 기증자와 받는 사람에 이상적입니다.
3. 사용 CD45.1 받는 사람 (b 6. SJL-Ptprc는^는 Pepc^b/BoyJ) 나이의 6-10 주 주변에. 564Igi를 사용 하 여 (b 6. Cg-Igh^{tm1 (Igh564) Tik}Igk^{tm1 (Igk564) Tik}/J) 및 PA-GFP (나이의 6-12 주에 B6.Cg-Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J) 기증자.
4. 압력가 마로 소독 하 여 수술 도구 (똑바로 잘가 위 및 Dumont 집게 # 5와 #7) 소독 일상적인 소독 지침에 따르면 그들.
5. 500 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), pH 7.4에 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)를 포함 하 골 (BM) 버퍼를 준비 합니다. BM 버퍼를 준비 하려면 추가 열 비활성화 (1 시간 보완을 비활성화 하는 56 ° C 물 목욕에서)의 10 mL FBS와 1.25 mL 500 ml PBS, pH 7.4, 및 잘 혼합 (pH 7.4에 조정) 400 mM EDTA 솔루션의. 0.2 µ m 필터 플라스 크를 사용 하 여 버퍼를 필터링 합니다.
6. 시 약 학년 물 총 볼륨의 10 mL를 10 배 재고의 1 mL를 diluting 하 여 적혈구 (RBC) 세포의 용 해 버퍼 (155mm NH₄Cl, 12 m m NaHCO₃, 0.1 mM EDTA) 10 mL를 준비 합니다. 5 m m EDTA, pH 7.4 PBS의 50 mL를 준비 합니다.

2입니다. 혼합된 골 키메라의 설립

1. 받는 사람 (0 일)의 조사
   1. CD45.1 골 수 받는 사람 컨테이너를 적절 한 방사선 놓고 1100으로 비추는 방사선 감마 irradiator에.
      참고: 대체 방사선 소스를 사용할 수 있습니다. 소스에 관계 없이 복용량/타이밍 동물에 최소한의 부수적인 조직의 손상 최대한 myeloablative 효과를 최적화할 수 있다.
   2. 항생제에 물 ad libitum (1 mg의 sulfadiazin 및 trimethoprim/mL 식 수의 0.2 mg).
2. 뼈 (주 1)의 추출
   1. 4 %isoflurane 공기에서의 지속적인 흐름에 의해 564Igi 골 수 기증자를 anesthetize 하 고 자 궁 경부 전위에 의해 안락사. 에탄올과 기증자 아래로 스프레이 흐름 후드에서 무 균 수술 패드에 그들을 배치. 살 균 버퍼 및 장비를 사용 하 여 살 균 조건을 유지 작업을 진행 합니다.
   2. 대 퇴 골과 경골, 먼저 발목 주위 절 개 한 똑바로 잘가 위를 사용 하 여 엉덩이를 위쪽으로 확장. 몸 쪽으로 다리를 끄고 using 중장비 집게 또는 엄지와 집게 손가락, 피부를 당겨. 마찬가지로 아래로 발 떨어져 피부를 당겨.
   3. 엉덩이에서 다리를 잡아와 강제로 발을 당겨 무릎과 발목 관절에 밖으로 팝업. 발목 관절 휴식과 경골, 그로 인하여 힘 줄과 근육 경골 오프 스트립에 들고 하는 동안 발을 몸 쪽으로 당겨 이동 합니다.
   4. 무릎을 공동 출시 경골, 휴식 하 고 유사 하 게 함으로써 스트립 힘 줄과 근육은 대 퇴 골에서 대 퇴 골에 들고 하는 동안이 몸 쪽으로 당겨. 엉덩이 관절에 절 개를 확인 하 고는 힘 줄을 잘라 다음 엉덩이 소켓에서 대 퇴 골을 꺼내. 단계 2.2.2-2.2.4 contralateral 측면에 대 한 반복 합니다.
   5. 거친 종이 타월로 나머지 모든 근육과 결합 조직을 제거 하기 위해 그들을 문 지르고 하 여 뼈를 신중 하 게 청소. 다음 그들에 린스 차가운 BM 버퍼 마침내 Dumont #7 집게의 쌍을 사용 하 여 얼음에 신선한 찬 BM 버퍼에 그들을 전송 하기 전에. PA GFP 기증자에 대 한 2.2 단계를 반복 합니다.
      참고: 단일 기증자 로부터 골 수 세포의 수는 성별과 나이 따라 다릅니다. 받는 사람 원하는 수와 원하는 입력된 골 비율 및 숫자에 따라 기증자의 수를 확장. 기증자 부족 한 경우, 정면 사지 골 추출에 포함할 수 있습니다. 이 일반적으로 추가 1/3 ½ 뒷 다리 사지에서 얻은 세포의 생성 합니다. 일반적으로, 어디서 나 50-200 백만 셀에서 복구할 수 있습니다 기증자, 나이, 성별, 배경 및 여부만 뒷 다리 또는 뒷 다리와 앞 다리는 포함에 따라 당.
3. 골 수 세포 추출
   1. 얼음 처럼 차가운 BM 버퍼에서 rinsing 하 여 박격포를 준비 합니다. 린스 버퍼 배수와 10 mL 혈 청 학적인 피 펫과 전기 피펫은 컨트롤러를 사용 하 여 신선한 얼음 BM 버퍼의 10 mL를 추가.
   2. Dumont #7 집게의 쌍을 사용 하 여 박격포를 564Igi 기증자 로부터 뼈를 전송 사용 하는 유 봉 분쇄 하 고 출시 골 뼈 분쇄. 골 추출 물 10 mL 혈 청 학적인 피 펫으로 발음 하 고 얼음에 50 mL 튜브에 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 전달 합니다.
   3. 박격포를 신선한 얼음 BM 버퍼의 추가 10 mL을 추가 하 고 셀의 완전 한 복구를 보장 하기 위해 반복. 종이 타월로 박격포에서 뼈 재료를 제거 하 고 적절 하 게, 삭제 70% 에탄올, BM 버퍼 다음으로 신중 하 게 박격포를 헹 굴. PA GFP 골 수 기증자 그룹에 대 한 2.3 단계를 반복 합니다.
4. 골 수 세포를 계산
   1. micropipette를 사용 하 여 플라스틱 파라핀 영화의 조각에 RBC 세포의 용 해 버퍼의 40 µ L을 포함 하는 물방울을 놓습니다. 반전 564Igi 골 관 몇 번 하 고는 micropipette를 사용 하 여 aliquot 10 µ L을 꺼내. RBC 세포의 용 해 버퍼 드롭의 40 µ L와 함께 믹스.
   2. 그 후 드롭 Trypan 블루 (수성 해결책에서 0.4%)의 50 µ L를 추가 합니다. Burker-터키어 hemocytometer 및 현미경 조사 결과 믹스의 10 µ L를 즉시 로드 합니다. 총 희석 요인 x 10을 사용 하 여 mL 당 셀의 수를 계산 합니다. 적절 한 세포 생존 능력을 확인 > 90%. PA GFP 골 수 기증자 그룹에 대 한 2.4 단계를 반복 합니다.
5. 기증자 정지를 준비
   1. 건의 단계 2.4 및 원하는 받는 사람 수에 따라 달라 집니다, 기증자 혼합 관에서 혼합 두 기증자 그룹의 각각에서 골 수 기증자의 볼륨을 계산 합니다.
      참고: 예: 1:2 혼합된 564Igi:PA의 한 그룹을 설정-6 CD45.1 받는 GFP 키메라: 2 부품 PA-GFP와 각 받는 사람 필요 20 x 10⁶ 기증자 세포 총, 1 부 564Igi. 따라서,이 10 x 20 x 6 x 1/3를 요구 한다⁶ = 40 x 10⁶ 564Igi 기증자 세포 및 6 x 2/3 10 x 20 x⁶ = 80 x 10⁶ PA GFP 기증자 세포.
   2. 50 mL 원뿔 튜브에 PA-GFP와 564lgi 기증자 수의 적절 한 금액을 믹스. 진동 물통 회전자를 사용 하 여 10 분 동안 골 혼합물 g 와 4 ° C x 200에서 원심.
   3. 가만히 따르다는 상쾌한 고 mL 당 1 x 10⁸ 셀의 밀도에 얼음 처럼 차가운 BM 버퍼에 셀 resuspend. 얼음에 microcentrifuge precooled 1.5 mL 튜브에 전송.
6. 골 수 기증자와 받는 사람 골 수를 재구성
   1. 4% isoflurane 3.75% 유지 보수 다음 공기에서의 지속적인 흐름으로 유도 사용 하 여 받는 사람 anesthetize 발가락-핀치 반사의 부재에 의해 마 취의 적절 한 평면을 확인 합니다.
   2. 신중 하 게 포함 하는 보장, 골 수 세포의 적절 한 물의 resuspension 골 믹스 (~ 10⁶ 셀 x 20), 0.3 mL의 aspirate 200 µ L을 골 혼합 튜브 영화, 30 게이지 인슐린 주사기.
   3. 받는 사람 옆에 배치, 위와 약간 ' 눈을 밖으로 팝업 ' 눈 아래 피부를 부드럽게 스트레칭, 부드럽게 눈 소켓, 주변 조직과 눈을 피하기 위해 돌의 앞에 30 ° 각도로 약 주사기의 끝을 삽입. 바늘의 팁은 눈 소켓을 밑줄 뼈를 만질 때, 약간 철회 (~0.5 m m)와 꾸준한 압력을 사용 하 여 골 기증자를 천천히 주입.
      참고: 이어야 한다 아무 출혈, 액체 및 더 주입 시 눈의 아주 사소한 불 룩 하 누설 없음.
   4. Ad libitum 항생제 물으로 케이지를 마우스를 반환 하 고 프로시저에서 즉시 복구 확인 합니다. 각 받는 사람에 대 한 2.6 단계를 반복 합니다.
      그러나 참고: 꼬리 정 맥 주입 retroorbital 주입 비슷한 결과 대신에 사용할 수 있습니다, 그리고, 우리의 손에서 그것은 상당히 느린 받는 사람의 큰 그룹으로 작업할 때 문제가 있을 수 있습니다. 포부 및 질 식 위험 포즈 직접 작은 직경 침구 anaesthetized 동물의 복구 피해 야 한다
7. 제거 하는 항생제 물 (14 일)
   1. cage(s)에서 항생제 물을 제거 하 고 신선한 일반 식 수를 바꿉니다.

3. 성공적인 재구성을 검사 하 고 chimerism (주 6)의 적절 한 학위를 확인

1. Retroorbital 키메라와 컨트롤의 출혈
   1. 받는 사람 귀 태그 숫자 microcentrifuge 튜브 1.5 mL 라벨 5 mM EDTA를 포함 하는 PBS의 50 µ L을 추가 하 여 혈액 컬렉션 튜브를 준비 합니다.
      참고: PA-GFP, CD45.1 및 CD45.2, 및 9D 11 (idiotype)에 대 한 적절 한 컨트롤을 포함 합니다. 이것은 1를 포함 하 여 행 해질 수 있다 PA-GFP + 마우스, 1 CD45.1 마우스, 1 b 6 마우스 및 1 564Igi 마우스.
   2. 마우스를 anesthetize 고 마 취 단계 2.6.1에서의 적절 한 평면을 확인 합니다. 부드럽게 위와 약간 ' 눈을 밖으로 팝업 ' 눈 아래 피부를 스트레칭, 그것의 측면에 키메라를 놓습니다.
   3. 부드럽게 눈과 주위 조직 손상을 방지 하도록 눈 소켓의 앞에 약 40 ° 각도에서 BoPET 포장 heparinized 모 세관 튜브 (60 µ L 내부 볼륨)를 삽입 합니다. 부드럽게 트위스트/회전 튜브 피와 채우기 위해 시작 될 때까지.
   4. 수 동적으로 모 세관 작용 때까지 거의 완전히 풀로 튜브를 채우기 위해 혈액을 허용 다음 튜브를 철회 하 고 즉시 눈을 있도록 눈 주위 한 파악을 푸는 동시에 해당 사전 이라는 컬렉션 튜브 장소 위치로 다시 침전 하는. 출혈은 즉시 중지 해야 합니다.
   5. 모 세관 튜브 컬렉션 튜브에 비운은 고 sharps 용기에 그것을 폐기. 튜브를 닫고 PBS/EDTA와 완전 한 혼합 되도록 세 번 반전.
   6. 마우스 케이지를 반환 하 고 프로시저에서 즉시 복구 확인. 각 실험 마우스와 적절 한 컨트롤에 대 한 3.1 단계를 반복 합니다.
      참고:이 방법은 전에이 완벽 하 게 재구성은 우발적인 감염 조사 받는 사람에 대 한 더 큰 위험 포즈 수 있습니다 submandibular 정 맥 빵 꾸를 사용 하 여 주의 가져가 라. 또한, 우리의 경험에서 우리는 혈액의 수집 그리고 분실 과도 한 출혈로 인해 혈액의 양이 더 많은 변수 찾으십시오. 골 수 키메라는 재구성 단계에서 중요 한 새로운 골 수는 완전히 engrafted 조 정상 수준을 다시 시작 하기 전에 이러한 사항을 모두 중요 하다.
2. 말 초 혈액 단 세포 (PBMC) 정화
   1. 짧게 혈액 컬렉션의 완료 후 (10 s) 낮은 속도로 튜브 원심 (< 200 x g)는 희석 수집 하는 튜브의 하단에 혈액 안정.
   2. 림프 구 분리 매체와 10 mL 주사기를 18 G 바늘을 연결. 첫 번째 튜브의 아래쪽에 바늘을 삽입 하 고 림프 구 분리 매체의 1 mL와 함께 혈액 샘플을 underlayer. 조심 스럽게 바늘을 철회 하 고 샘플의 교차 오염을 방지 하기 위해 종이 타월로 닦아냅니다.
   3. 모든 예제를 통해 진행 하십시오 다음 낮은/오프로 설정 하는 브레이크와 함께 800 x g, 스윙 양동이 원심 분리기에서 실내 온도에에 25 분 동안 원심.
   4. 대응 하 게 레이블이 1.5 mL의 집합 차가운 BM 버퍼의 1 mL를 포함 하는 microcentrifuge 튜브 준비.
   5. 각 샘플에 대 한 다음 원심 분리 200 µ L micropipette 위 (플라즈마) 레이어를 입력 하 고 바로 인터페이스 위에 단 셀 (MNC) 레이어를 발음. BM 버퍼의 1 mL를 포함 하는 대응 하 게 레이블이 지정 된 튜브에 세포를 전송. 뚜껑 닫고 혼합을 반전 합니다. 림프 구 분리 매체 포함 된 튜브를 삭제 합니다.
   6. 모든 예제를 통해 진행 하십시오 하 고 200 x g 5 분, 진동 물통 회전자에 4 ° C에서 원심. 발음 하 고 상쾌한, 삭제 차가운 BM 버퍼의 200 µ L에 펠 릿을 resuspend. 샘플 항 체 얼룩이 지 고 흐름 cytometric 분석에 대 한 준비가 있다.
3. 흐름 cytometric 평가 위한 얼룩
   참고: 제안 패널: CD45.1 FITC, B220-PerCP-Cy5.5, 9 D 11-A568, CD45.2-APC. 비 활성화 PA-GFP 태평양 오렌지 (또는 동등한) 채널에서 검색 됩니다. 아니 생존 염료는 림프 구 분리 되 면 죽은 세포의 제거로 필요 합니다.
   1. micropipette 사용 하 여, 96 잘 접시에 각 키메라 및 제어 샘플을 잘 당 세포 현 탁 액의 100 µ L를 추가 합니다.
   2. 3 비 PA GFP 컨트롤 샘플에 대 한 나머지 100 µ L 각 샘플 (총 300 µ L)의 수영장. 흠 없는 제어 및 단일 스테인드 제어 우물을 위한이 물자의 50 µ L를 추가 합니다. PA-GFP에 대 한 단일 스테인드 제어 또한 흠 없는 PA GFP 샘플의 50 µ L를 추가 합니다.
   3. 각 잘 버퍼 (흠 없는) 100 µ L를 추가, 단일 항 체 (단일 스테인드 보상 제어, PA GFP 보상 제어 제외) 또는 항 체 믹스 (샘플). 20 분 동안 얼음에 품 어.
   4. 4 ° c.에 5 분 동안 200 x g 에서 원심 버퍼를 터치 합니다. 각 우물에 BM 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 다시 씻어 원심. 버퍼에 밖으로 터치 한 각 잘 BM 버퍼의 200 µ L에서 셀 resuspend 합니다. 샘플 분석 흐름 cytometer (그림 1)에 대 한 준비가 있다.
      참고:는 키메라에 어린 싹 센터 응답 6 주 이후부터 언제 든 지 분석할 수 있습니다.

4. vivo에서 단일 본 원 센터의 식별을 돕기 위해 한계 영역/subcapsular 공동의 라벨

참고: 현재 프로토콜 노상 강도/호크 (오 금 림프절)과 정 맥 (i.v., 비장) 주사에 대 한 증명은 되지만 대상 사이트는 다양 한 수 있습니다.

1. 오 금 림프절 라벨에 대 한 양자 노상 강도 주입
   1. 2.6.1 단계 에서처럼 마우스 anesthetize
   2. 1.5 mL microcentrifuge 관에서 2 µ L의 PBS, pH 7.4의 18 µ L에서 PE 라는 쥐 반대로 마우스 CD169 항 체 희석. 한 조각의 플라스틱 파라핀 영화에 10 µ L 각 혼합물의의 두 방울을 배치 합니다. 30 게이지 바늘으로 0.3 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 각 방울 발음
   3. 라벨에 믹스는 노상 강도 10 µ L를 주입 (노상 강도, 인접 발가락의 시작 부분에서의 중앙 부분에 5-10 ° 각도로 바늘으로 입력 하 고 약 중간 뒤꿈치 쪽으로 바늘을 삽입) 또는 호크 (바늘 5-입력 10 ° 뒤꿈치 바로 위에 각도 위치에 대 한 삽입의 무릎 쪽으로 방향에서 아 킬 레 스 힘 줄의 축 길이 절반). 그들의 감 금 소를 생쥐를 반환 하 고 5 단계를 계속 하기 전에 대략 15 분을 기다립니다.
2. 비장 라벨에 대 한 정 맥 주입
   1. 포인트 2.6.1에서 마우스 anesthetize
   2. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 PBS의 90 µ L에서 PE 라는 쥐 반대로 마우스 CD169 항 체의 10 µ L를 희석. 인슐린 주사기 0.3 mL와 혼합을 발음.
   3. 수행 단계 2.6에 의하여 retroorbital i.v. 주입 합니다. 그들의 감 금 소를 생쥐를 반환 하 고 5 단계를 계속 하기 전에 대략 15 분을 기다립니다.
      참고: isoflurane, 케 타 민/Xylazine 혼합 사용할 수 있습니다;와 같은 마 취 주사 대신으로 그러나,이 일반적으로 느린 복구 시간으로 이어집니다. 림프 배수는 일반적으로 골격 근육 운동에 의해 영향을, 이후이 느린 배수 시간이 이어질 예정 이다.

5. explanting 비장 및 림프절 및 photoactivation에 대 한 준비

1. 이중 면 이미징 및 photoactivation 챔버 준비
   1. 20 mL 주사기에서 플런저를 제거 하 고 다시 로드 그것 진공 그리스와 그것에 진공 그리스의 튜브의 노즐을 삽입 하 여. 다음 5 mL 주사기에서 플런저를 제거 하 고 다시-진공 그리스와 함께 그것은 부하를 20 mL 주사기를 사용 하 여.
   2. 진공 그리스 로드 5 mL 주사기를 사용 하 여 사각형 coverslip 평평한 표면에 배치 하 고 진공 그리스 (약 1-2 m m 가장자리에서)으로 coverslip의 가장자리를 따라 추적 하 여 이미징 및 photoactivation 챔버 준비.
      참고: 침수 물에 유화 진공 그리스의 microdroplets 렌즈 오염 수로 이후에 현미경 렌즈 접촉 모든 표면의 진공 기름 오염 방지 주의.
   3. 얼음 처럼 차가운 BM 버퍼와 커버 슬립 진공 그리스 챔버를와 차가운 평평한 표면에 놓습니다.
2. 수확 하는 림프절, 비장
   1. Vivo에서 분류 단계 2.2.1에 의하여 분석할 공상 마우스를 안락사. 70% 에탄올과 시체를 스프레이.
   2. 오 금 림프절에 액세스 하려면 바로 무릎 구 덩이 아래 피부에 절 개를 만들기 위해 똑바로 잘가 위를 사용 하 고 엉덩이 관절까지 햄 스트링 라인을 따라 위쪽으로 컷을 거의 확장. Dumont #5 또는 # 7을 사용 하 여 집게, 각각 오 금 fossa (그림 2A)에서 조직 노출 피부 바깥쪽의 노출된 플랩의 당겨.
   3. 신중 하 게 오 금 정 맥에 그냥 중간 오 금 fossa을 입력 하 고 해 부 몬 트 #5 집게의 쌍을 사용 하 여 삽입 하 고 개폐는 다리의 축 집게 기본 오 금 림프절을 노출 하려면 지방 열.
   4. 엄지 및 집게 손가락 (그림 2B)를 사용 하 여 무릎 근 전면에서 quadriceps 근육을 곤란 하 게 하 여 여 포에서 림프절을 팝. 주변 조직 (그림 2C)에서 그것을 해방 다음 단계 5.1에서에서 준비 진공 그리스 상공에 집게와 림프 노드를 아래에서 잡아.
   5. 단계 5.2.2-5.2.4 contralateral 측면에 대 한 반복 합니다. 원하는 경우 여러 개의 림프절 단일 챔버에 장착 될 수 있습니다.
   6. 마지막으로 두 번째 coverslip 진공 그리스 테두리 위에 놓고 모든 기포를 돌출 하도록, 부드럽게 눌러 챔버를 닫습니다.
      참고: 버퍼의 일부 밖으로 뿐만 아니라, 밀어 수 있습니다 하지만 진공 그리스 (그림 2D) 유체의 누설 방지 단단한 물개를 형성 한다. 림프절 양면 이미징 상공에 지금 있다.
   7. 비장을 앞쪽 중간 라인에 proximal 마우스의 왼쪽에 복 벽을 통해 절 개 바로 미세가 위의 쌍을 사용 하 여 액세스 하려면 바로 흉 곽, 아래 하 고 뒷부분 axillary 라인에 몸 주위 확장 합니다. 비장의 팁 표시 (그림 3A) 해야 합니다.
   8. 뒤 몽 #7 집게의 쌍으로 비장을 당기고 그것을 발표 하기에 유착을 잘라. 똑바로 잘가 위의 쌍을 사용 하 여 잘라 ~ 2 m m 두께, 단면, 슬라이스.
   9. 5.1 단계에서 진공 그리스 상공에는 슬라이스를 놓습니다. 원하는 경우 여러 비장 조각은 단일 챔버에 장착 될 수 있습니다.
   10. 마지막으로 두 번째 coverslip 진공 그리스 테두리 위에 놓고 모든 기포를 돌출 하도록, 부드럽게 눌러 챔버를 닫습니다. 이미징 및 photoactivation 동안 제외 하 고 모든 시간에 얼음에 모든 이미징 챔버 유지.
       참고: 버퍼의 일부 밖으로 뿐만 아니라, 밀어 수 있습니다 하지만 진공 그리스 유체의 누설 방지 단단한 물개를 형성 한다. 비장 조각 양면 이미징 챔버 (그림 3B)에 있다.

6입니다. Photoactivation

1. 단일 어린 싹 센터를 식별
   참고:이 프로토콜은 비장에 대 한 설명 하지만 전적으로 림프절에 대 한 유사.
   1. 현미경 단계에 이미징 챔버를 놓습니다. 3.5 mL 플라스틱 전송 피 펫을 사용 하 여, 위 coverslip 위에 증류수 한 방울을 배치 및 목표는. 조직 전송된 빛을 사용 하 여 위에 초점.
   2. 어두운 모드 및 2 광자 여기로 전환 하 고 940 레이저 조정 nm.
      참고: 적절 한 필터 세트와 함께이 파장 여기 및 허용 단계 4.2, 주입 CD169 PE로 콜라겐-포함 된 구조 주요 혈관 및 구조 요소와 관련 된 두 번째 고조파 발생의 탐지는 한계 영역을 식별합니다. 그러나, 940 nm 여기 photoactivate PA-GFP 하지 않습니다.
   3. 개별 백색 펄프 분야 (CD169-PE 얼룩에 의해 제한) 조직의 표면 근처를 지역화 하 고 중앙 되와 관련 된 두 번째 고조파 발생에 의해 periarteriolar 림프 칼 집 (친구, T 셀 영역)를 식별 합니다. 친구와 한계 영역 사이의 영역에서 찾아 높은 autofluorescent의 존재 활성화 tingible 신체 세포 (모든 채널에 강한 autofluorescent 신호, 어두운 그들으로 blob 같은 모습) (그림 4A).
      참고: 필요한 경우, 조직의 바람직하지 않은 방향으로, 이미징 챔버가 성을 상실 될 수 있습니다 및 이미징 다른 방향에서 수행할 수 있습니다.
   4. 6.1.3 단계에서 식별 하는 특징에 따라., 단일 새싹 센터의 영역을 식별 하는 관심 영역을 그립니다. Z-의 스택 주위를 설정 100-150 µ m 깊이, 조직, 표면에서 시작 하 고 ~ 3 µ m의 단계 크기를 사용 하 여.
   5. 830 nm 여기 파장으로 전환 합니다. 차단 또는 감지기에 photodamage를 방지 하기 위해 모든 채널을 어둡게 (로 레이저 파워 및 출력 형광은 일반적으로이 파장에 극적으로 더 높은), 그리고 다음 스택 '이미지'.
      참고: 레이저 파워 및 픽셀 망설임 시간 등의 특정 설정을 사용 하 고, 특정 조직의 조직과 이미징 시스템에 깊이에 따라 달라 집니다. 각 응용 프로그램 특정 이미징 시스템 사용에 대 한 최적화할 수 있다. 스택을 통해 효율적인 photoactivation을 얻을 것이 필수적입니다, 하는 동안 한다 주의 하지 photodamage에 셀.
   6. 940 nm 여기 파장에 다시 전환 하 고 채널을 다시 합니다. (그림 4B)를 통해 효율적인 photoactivation photodamage (확산, 셀 경계 비 PA GFP 신호, 어두운 반점 또는 photoactivated 지역에서 높은-학위를 autofluorescence)의 부재를 확인 하려면 스택을 통해 스캔.
   7. Photoactivate 영상 실에서 모든 관련 조직 이동 합니다 다음 신속 하 게 추가 처리까지 얼음에 그것을 반환 합니다. 추가적인 이미징 챔버의 photoactivation와 함께 진행 합니다.
      참고: 조직 explanting, 장착 및 특히 photoactivation는 시간이 많이 걸리는 프로세스, 하지만 전체 설정-주위에 세포 생존 능력에 있는 극적인 감소를 방지 하기 위해 4-6 시간을 제한 한다.

7. 복구 및 photoactivated 세포의 분석

1. 임 파선 및 비장 세포의 추출
   1. 각 photoactivated 샘플에 대 한 얼음에 BM 버퍼의 500 µ L을 포함 하는 따라 레이블이 1.5 mL microcentrifuge 튜브 준비. 비-PA-GFP 제어 및 비-활성화 PA GFP 마우스에서 샘플을 포함 합니다. 이 하나의 B6 제어 및 한 PA GFP 컨트롤 마우스를 포함 하 여 수행할 수 있습니다.
   2. 조심 스럽게 이미징 챔버 (해당 되는 경우 여러 샘플은 단일 챔버에 존재), 샘플의 위치를 유지 하 고 각 샘플의 각각 샘플 튜브를 돌보는에서 상단 커버 슬립을 제거.
   3. 유 봉 균질 화기를 사용 하 여 조직을 짜 내 고 세포 분리를 튜브에는 유 봉 트위스트. micropipette 사용 하 여, lysate를 발음 하 고 신선 하 고, 미리 냉각 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링. 림프절 샘플, 7.1.5 단계로 건너뜁니다.
   4. 비장 샘플에 대 한 진동 물통 회전자에 4 ° C에서 5 분 동안 200 x g 에서 원심. 삭제는 상쾌한 고 RBC 세포의 용 해 버퍼의 200 µ L에 펠 릿을 resuspend. 실 온에서 5 분 동안 incubate 다음 차가운 BM 버퍼의 800 µ L을 추가 하 고 7.1.5 단계로 진행.
   5. 진동 물통 회전자에 4 ° C에서 5 분 동안 200 x g 에서 원심. 삭제는 상쾌한 고 차가운 BM 버퍼의 200 µ L에서 resuspend. 원하는 경우는 샘플 흐름 cytometric 평가 대 한 얼룩 및 정렬에 대 한 준비가 있다.
2. 흐름 cytometric 평가 위한 얼룩
   참고: 제안 패널: CD169 PE, B220-PerCP-Cy5.5, 9 D 11-A647, CD38-PE-Cy7, 고칠 수 생존 염료 Efluor-780, GL7-태평양 파랑. 비 활성화 PA-GFP 태평양 오렌지 (또는 동등한) 채널에서 검색 됩니다. Photoactivated 펜 실바 니 아-GFP GFP 채널에서 검색 됩니다. (하 수도 되지 않았을 수도 vivo에서 CD169 PE와 함께 표시) 모든 공동 순화 된 대 식 세포는 CD169 PE와 얼룩 덤프 게이트로 이것을 사용 하 여 제외할 수 있습니다.
   1. micropipette 사용 하 여, 96 잘 접시에 각 키메라 및 제어 샘플을 잘 당 세포 현 탁 액의 100 µ L를 추가 합니다.
   2. B6 컨트롤 샘플에 대 한 흠 없는 제어 및 단일 스테인드 제어 우물을 위한이 물자의 50 µ L를 추가 합니다. PA-GFP 비 활성화에 대 한 단일 스테인드 제어 또한 흠 없는 비 활성화 PA GFP 샘플의 50 µ L를 추가 합니다. 활성화 된 PA GFP 단일 스테인드 컨트롤에 대 한 모든 photoactivated 샘플에 대 한 나머지 자료 수영장.
   3. 각 잘, 버퍼 (흠 없는 및 PA GFP 보상 제어)의 100 µ L를 추가, 단일 항 체 (단일 스테인드 보상 컨트롤) 또는 항 체 믹스 (photoactivated 샘플). 20 분 동안 얼음에 품 어.
   4. 200 x g 에서 4 ° c.에서 5 분 원심 버퍼를 터치 합니다. 각 우물에 BM 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 다시 씻어 원심. 버퍼에 밖으로 터치 한 각 잘 BM 버퍼의 200 µ L에서 셀 resuspend 합니다. 샘플 분석 흐름 cytometer 또는 정렬 (대표 결과 그림5에서)에 대 한 준비가 있다.

결과

혼합된 골 키메라의 세대

(대 한 통계적 의미 ¹²를 참조 하십시오) 대표는 그림 1 에 표시 된 현재 프로토콜 튼튼하게 B 세포 구획에 가까운 완전 한 chimerism와 혼합된 골 키메라를 달성 한다. Serotyping 밝혀 정규화 된 B 세포 숫자 6 주 9D 11 (idiotype)의 낮은 주파수로 재구성 (그림 1A), 564Igi 구획 (그림 1B)에서 파생 하는 긍정적인 순환 B 세포 게시할 수 있습니다. 총 림프 구 게이트 내에서 잔여 받는 파생 셀 ~ 6%의 낮은 주파수는 CD45.1 (1 분기) ~ 94% (그림 1C)의 chimerism의 전반적인 정도 나타내는. 기증자에서 구획 (CD45.1-, 4 분기 + q 3) 564Igi의 비율 (4 분기) PA GFP를 (Q3)는 약 23% ~ 77%. 이 B 세포의 무거운 부정적인 선택에 의해 입력된 33% ~ 66% 비율 설명 보다 약간 낮은 564Igi 구획 ¹²에서 파생. 그림 1D에 볼, 거기에 거의 완전 한 chimerism B 세포 격실 (99.9 %CD45.1-)와 564Igi에서 파생 된 B 세포의 무거운 부정적인 선택의 결과 PA GFP 골 파생 B 세포 (3 분기)의 지배.

조직, 처리 및 흐름 cytometric 평가의 수확

그림 2 및 그림 3 절차를 설명 하 고 explanting의 결과 갓 고립 림프절과 비장 조각. 그림 4 는 vivo에서 레이블 및 photoactivation explanted 비장 조각에 단일 새싹 센터 지역의 대표적인 결과를 선물 한다. 볼 수 있듯이 (그림 4A), CD169-PE와 vivo에서 라벨 튼튼하게 한계 영역 표시는 (빨강, "MZ"으로 표시). 두 번째 고조파 신호 콜라겐-포함 된 구조적 요소 및 주요 혈관 (청색), periarteriolar의 칼 집 (친구) 림프의 중앙 되를 포함 하 여 명백한 것입니다. 높은 autofluorescent, 활성화 된 tingible 몸 세포 어린 싹 센터 활동 (화살촉)와 연결 됩니다. 함께 찍은, 한계 영역, 친구, 그리고 tingible 신체 세포의 식별을 가능성이 단일 어린 싹 센터를 포함 하는 관심 영역 식별을 수 있습니다. 그림 4B에서 볼 수 있듯이 관심 영역 photoactivated입니다. 바와 같이 photoactivation microanatomically 정확한⁹를 저조한 활성화의 정의 된 영역입니다. 제시 결과 또한 PA의 높은 밀도의 확인 역할-GFP + 림프 톨이 재구성된 키메라에 자발적인 어린 싹 센터의 존재. 정규화 된 B 세포 구획 번호 (그림 5D), 자발적인 새싹 센터 인구 (그림 5E), 및 어린 싹 센터 B 세포는의 부분 집합의 존재를 확인 하는 다운스트림 흐름 cytometric 평가 추가 photoactivated (그림 5F)입니다.

따라서, 현재 프로토콜 선물 강력한 방법이 혼합된 골 키메라의 세대에 대 한 자발적인 autoreactive 어린 싹 센터는 주로 야생-타입 파생 B 셀 photoactivatable 기자를 운반로 구성. 차례로 개별 어린 싹 센터 (그래픽 개요 그림6에서)의 다운스트림 분석 가능합니다.

그림 1: Cytometric chimerism 564Igi의 피에서의 정도의 평가 흐름 (CD45.1-, 펜 실바 니 아-GFP-): PA-GFP (CD45.1, PA-GFP +) 치명적 방사능된 CD45.1 받는 사람 (CD45.1 +, 펜 실바 니 아-GFP-)에 키메라를 혼합, 6 주 게시물 재구성. 미리 내의 림프 톨에 문이 B220 + B 세포의 게이팅 보여주는 A) 줄거리. 그림 A, B 세포 인구 내에서 보여주는 9D 11 + (idiotype) 주파수에서에서 B) Subgate. C) 플롯의 PA-GFP CD45.1, 미리 내의 림프 톨에 문이 대. D) 줄거리의 PA-GFP 줄거리 대답에서에서 B 세포 subgate에 CD45.1 대 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 수확 및 이미징 및 photoactivation에 대 한 오 금 림프절 장착 절차. A) 절 개는 무릎 아래 하 고 엉덩이 관절까지 연장 및 가장자리 (화살촉) 오 금 fossa을 노출 하려면 양쪽에 제거 됩니다. B) overlying fatpad 열리고 오 금 림프절은 노출된 (화살촉). C) 오 금 림프절은 포에서 검색 됩니다. D) 절차 contralateral 측면에 대 한 반복 하 고 두 노드 BM 버퍼 가득 양면 coverslip/진공-그리스 챔버에 탑재. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 수확 및 이미징 및 photoactivation에 대 한 비장 장착 절차. ) 절 개 바로 흉 곽 아래 앞쪽 중간 라인에서 후부 axillary 라인, 몸 주위에 확장 하 고 비장 (화살촉)의 끝을 노출 하는 가장자리 제거 됩니다. B) 비장은 철회 excised, 그리고 BM 버퍼 가득 양면 coverslip/진공-그리스 상공에 탑재 되는 얇은 (1-2 m m) 조각으로 잘라. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: Photoactivation. A) 2-광자 photoactivation 전에 비장에 어린 싹 센터의 현미경 사진. 한계 영역을 비장의 수확을 하기 전에 수행 했다 vivo에서 안티-CD169-PE와 라벨 (빨강, "MZ"으로 표시). 두 번째 고조파 신호 명백한에 콜라겐-포함 된 구조는 외피 및 주요 혈관 (청색)와 관련 된. 화살촉 높은 autofluorescent, 활성화 된 tingible 몸 대 식 세포는 어린 싹 센터 활동과 관련 된 식별 합니다. 이미징 940 nm 여기에서 수행 되었다. 왼쪽 위 모퉁이에서 눈금 막대 나타냅니다 200 µ m. B),에 관해서는 하지만 830에서 photoactivation 후 nm. Photoactivated 세포는 지금 표시 (녹색) 정의 된 지역에 제한의 한계 영역으로 포괄 이전 확인 된 tingible 몸 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: Photoactivated 어린 싹 센터 B 세포의 cytometric 분석 흐름. 앞으로 사이드 분산형 및 림프 구 게이트 대의 A) 줄거리. 림프 구 게이트, 결과 내의 게이트 내에서 앞으로 살포 높이의 기능으로 앞으로 피해 지역의 B) 줄거리. C) 생존 제외 플롯 내의 게이트와 결과 라이브 셀 게이트 내에서 염료. D) Gating B220 + B 세포의. E) Gating B220 + 게이트 내의 CD38lo GL7hi 셀으로 식별 어린 싹 센터 B 세포의. F) Gating 셀 공동 비 활성화 표현 및 photoactivated PA-GFP의 하위 집합으로 식별 된 GC B 세포 인구 내의 photoactivated 세포의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6: 프로토콜의 그래픽 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

면역의 murine 모델의 큰 수를 사용할 수 있습니다, 그리고 많은 자발적인 어린 싹 센터¹⁶와 함께 제시. 그러나, 사용 가능한 모델의 많은 복잡 한 유전 배경 또는 돌연변이 중앙 레 귤 레이 터에서 림프 구 증식 또는 활성화, 저조한 intercrossing 기자 라인과 정상적인 림프 구 동작의 연구에 적합 한 그들을 렌더링의 항구 면역에 각각. 현재 모델, 그와 반대로, autoreactive 야생 유형 파생 어린 싹 센터 B 세포로 표현 하는 현재의 경우에서 transgenes, 노크-아웃 및 기자, 원하는 조합을 사용 하 여 심층 분석 하는 ' 플러그 앤 플레이 ' 접근 허용 photoactivatable GFP입니다. Vivo에서 레이블 전략을 사용 하 여, 단일 어린 싹 센터 explanted 림프 조직에 그들의 세포 성분 photoactivated 2 광자 현미경을 사용 하 여 구상 될 수 있습니다. 다음 단일 본 원 센터에서 Photoactivated 세포는 단일 셀 또는 대량에서 분석 또는 정렬 흐름 cytometrically를 될 수 있습니다. 이 세포 면역의 분야에서 새로운된 통찰력을 제공 하기 위해 추가 다운스트림 분자 및 기능 분석 이후에 받게 수 있습니다.

이 절차의 성공적인 성능에 대 한 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 대표 결과, 방사선에 의해 같이 (1100 Rad) 기증자 골 재구성 성공적으로 B 세포 구획에 가까운 완전 한 chimerism를 양보 받는 사람 골 구획 대체. 이것은 중요 한 포인트, 잔여 받는 파생 B 세포는 어린 싹 센터의 하위 집합 '어두운' 렌더링. 조사에 사용 되는 소스에 방사선의 복용량/타이밍 동물에 최소한의 부수적인 조직의 손상 최대한 myeloablative 효과를 최적화할 수 있다. 재구성에 대 한 뼈 호감 프로토콜 및 20 백만 총 기증자 세포와 재구성 튼튼하게 수익률 높은 재구성도 발견 되었습니다. 살 균 및 냉/얼음 골 추출에 대 한 작업 골 수 기증자의 높은 생존 능력을 보장 합니다. 도달 하기 위해 원하는 기증자 골 비율, 계산 자체 계산 및 계산에 대 한 골 수의 subsample 밖으로 데리고 때 셀의 aliquots 주의 운동에 필수적 이다. 혼합 및 공동 기증자 marrows 대신 centrifuging와 별도로 resuspending 하 고 다음 혼합 산 기증자 비율 계산 셀 다음에 어떤 스큐를 방지 하기 위해 제공 합니다.

프로토콜의 혼합된 골 키메라 생성, 혼자 설 수 있습니다 하 고 원하는 기자, transgene 또는 노크 아웃 autoreactive 어린 싹 센터와 키메라의 세대 수 있습니다. 그러나,이 1 개의 제한은 histocompatible 기증자를 사용 하는 필요입니다. 564Igi 긴장 C57Bl/6J congenic 배경에 그리고 결과적으로, 다른 donor(s)와 한다 H-2b congenic 배경 (또는 양자 택일로, 564Igi 긴장 원하는 긴장과 면역 표현 형을 backcrossed 해야 새로운 배경에서 확인). 조사 절차 tolerogenic 환경¹⁷, 선호 하는 경향이 있다 그리고 몇 가지 작은 조직 적합성 항 원 불일치를 용납 수 있습니다. 그러나,이 부분 고려 되어야 한다 철저 하 게, 남성과 여성의 기증자 또는 받는 사람, 남성 제한 Y 항으로 여성 반응성에 대 한 잠재력을 혼합 하는 경우에 특히.

마찬가지로, 프로토콜의 photoactivation 측면, 혼자 서 있을 수 있다 그리고 많은 다른 문맥에서 사용 될 수 있습니다. 그러나, PA GFP 기자는 현재만 아니라 stromal 세포 하지만 모든 조 혈 계보 세포에서 활성화 되어 UBC promotor. 소개에서 설명 했 듯이, 다른 photoactivatable, photoswitchable, 또는 photoconvertible 기자 변종 사용할 수 있으며 실험 조건의 적절 한 조정으로 PA-GFP에 대 한 대체 될 수 있습니다.

900 이상 레이저를 유지 하 여 바람직하지 않은 분야의 실수로 photoactivation를 방지 하는 것이 중요 하다 때 이미징,이 파장은 하지 photoactivate PA-GFP로 nm. Photoactivation 자체, 레이저 파워 및 픽셀 망설임 시간 등의 특정 설정을 사용 하 고, 특정 조직의 조직과 이미징 시스템에 깊이에 따라 달라 집니다 및 각 응용 프로그램은 특정 이미징 시스템 사용에 대 한 최적화. 주의 해야 하지 photodamage에 셀, 하지만 필수적인 다운스트림 분석에 대 한 활성화 된 셀의 충분 한 대표를 얻기 위하여는 스택을 통해 효율적인 photoactivation을 동시에. 어린 싹 센터 B 세포 일반적으로 구성 어디서 나 0.5%에서 ~ 2%, 비장 또는 피부 림프 노드 B 세포의 그리고 대표 결과 (그림 5)에서 볼 수 있듯이 photoactivated 단일 어린 싹 센터 B 세포 총의 ~ 1%를 할 수 있습니다. 인구는 단일 비장 조각에. 따라서, 성공적인 분석 또는 셀의 상당수의 정렬 많은 수의 이벤트를 처리 해야 합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody, 9D11-A568	In-house generated		9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Biotium 92255
Antibody, 9D11-A647	In-house generated		9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Nordic Biosite ABD-1031
Antibody, FITC anti-mouse CD45.1	Biolegend	110705
Antibody, Pacific Blue anti-mouse/human GL7 Antigen (T and B cell Activation Marker)	Biolegend	144613
Antibody, PE anti-mouse CD169 (Siglec-1)	Biolegend	142403
Antibody, PE/Cy7 anti-mouse CD38	Biolegend	102717
Antibody, PerCP/Cy5.5 anti-mouse/human CD45R/B220	Biolegend	103235
Capillary tube, Mylar-wrapped, heparinized	Fisher Scientific	211766
Cell strainer, 70 µm	Falcon	352350
Conical tubes, 50 mL	Falcon	352235
Cover slip, square, 22x22 mm, 0.13-0.17 mm	Thermo Fisher Scientific	22X22-1
EDTA	Merck	1,084,180,250
Ethanol, 70%	VWR	8301.360
Fetal bovine serum	Life Technologies	10270106
Flow cytometer, FACS Canto II	BD Biosciences	338962
Flow cytometer, LSRFortessa SORP	BD Biosciences	-	Special order product with 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm and 640 nm)
Grease, high vacuum, Dow Corning	VWR	DOWC1597418
Hemocytometer, Burker-Türk	VWR	630-1544
Isoflurane, IsoFlo vet.	Orion Pharma	9658
Lymphocyte separation medium (Lympholyte-M Cell Separation Media)	Cedarlane	CL5035
Microcentrifuge tube, 1.5 mL (Eppendorf)	Sarstedt	72.690.550
Microscope, Two-photon	Prairie Technologies (now Bruker)	-	Special order Ultima In Vivo Two Photon Microscope
Mortar w. lip, unglazed, 75 ml	VWR	410-0110
NaHCO3	Merck	1063290500
Needle, 18 gauge	BD Medical	304622
NH4Cl	VWR	87,769,290
PBS	Sigma	d8537
Pestle homogenizer	VWR	47747-358
Pestle, unglazed, 175 mm	VWR	410-0122
Pipette, Serological, 10 ml	VWR	612-3700
Pipette, transfer, plastic	Sarstedt	861,172,001
Plastic paraffin film (Parafilm M)	Bemis	PM996
Plate, 96-well	Falcon	353910
Surgical forceps, Student Dumont #5 Forceps	FST - Fine Science Tools	91150-20
Surgical forceps, Student Dumont #7 Forceps	FST - Fine Science Tools	91197-00
Surgical scissors, Student Fine Scissors, Straight	FST - Fine Science Tools	91460-11
Syringe, 10 mL	Terumo	SS-10ES1
Syringe, 20 mL	Terumo	SS-20ES1
Syringe, 5 mL	Terumo	SS-05S1
Syringe, Insulin, 0.3 cc	BD Medical	324827
Tribrissen vet. 24% inj., containing 200 mg sulfadiazin and 40 mg trimethoprim/ml	MSD Animal health	431577
Trypan blue solution, 0.4%	VWR	K940-100ML
Viability dye, eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	65-0865-14