3D 인쇄 다공성 셀 루 로스 나노 하이드로 겔 건설 기계

요약

이 프로토콜의 3 개의 중요 한 단계는 i) 개발 올바른 구성 및 일관성 ii) 3D로 다양 한 장비의 인쇄 셀 루 로스 히드로 잉크의 기 공 구조 좋은 모양 충실도 및 치수와 iii)의 데모는 연골 재생에 대 한 시뮬레이션 된 신체 조건에서 기계적 속성.

초록

이 작품은 제어 기 공 구조와 기계적 특성 셀 루 로스 나노 하이드로 겔 잉크를 사용 하 여 다공성 입방 건설 기계를 생산 하는 3 차원 (3D) 인쇄의 사용을 보여줍니다. 셀 루 로스 나노 (CNCs, 69.62 wt %) 3D는 균일 하 고 그라데이션 기 공 구조 (110-1, 100 µ m) 건설 기계에 인쇄와 매트릭스 (나트륨 alginate와 젤라틴) 기반으로 하이드로 겔 잉크 개발 되었다. 건설 기계 보였다 압축 계수 0.45 0.20의 범위에서 MPa에서 테스트 했을 때 시뮬레이션 (37 ° C에서 증류수)에서 vivo에서 조건. 기 공 크기와 연골 재생 응용 프로그램에 필요한 요구 사항을 일치 하는 3D 장비의 압축 계수. 이 작품은 선구자의 농도 의해 잉크의 일관성을 제어할 수 있는 다공성 3D 인쇄 과정에 의해 통제 될 수 있다 하 고 보여 줍니다 답례로 기계를 정의 하는 이러한 요인의 모두는 3D의 속성 인쇄 다공성 하이드로 겔 비 계입니다. 이 가공 방법 따라서 환자의 특정 필요에 따라 구조적으로 compositionally 사용자 정의 건설 기계 조작에 사용할 수 있습니다.

서문

셀 루 로스는 β의 선형 사슬 (1-4) 연결 된 D-포도 당 단위로 구성 된 다 당 류 이다. 지구상에서 가장 풍부한 천연 폴리머 이며 다양 한 해양 동물 (예를 들어, tunicates), 식물 (예를 들어, 나무, 면, 밀 짚), 조류 (예: Valonia), 버섯, 심지어 아메바 (원생 동물 등의 세균성 소스 등에서 추출 )^1,2. 셀 루 로스 nanofibers (CNF) 및 셀 루 로스 나노 나노에 하나 이상의 차원 (CNC) 기계 및 셀 룰 로스에서 산 가수분해를 통해 얻을 수 있습니다. 그들은 뿐만 아니라 셀 룰 로스, 화학 수정, 낮은 독성, 생체 적합성, 생 분해성 및 재생, 잠재력 등의 속성을가지고 있지만 나노 특성 높은 특정 표면 영역 처럼 높은 기계적 성질 유 변 학적 및 광학 속성. 이러한 매력적인 속성 만든 CNFs 고 CNCs 생명 의학 어플리케이션에 적합, 3 차원 (3D)의 형태로 주로 히드로 투어³. 이러한 건설 기계 제어 기 공 구조와 상호 다공성 사용자 지정된 크기를 필요합니다. 우리의 그룹 및 다른 3 차원 다공성 섬유 나노 복합 재료 주조, 전기 및^4,,56,,78동결을 통해 준비를 보고 있다. 그러나, 기 공 구조에 제어 하 고 복잡 한 형상의 제조 하지 이러한 전통적인 기법을 통해 이루어집니다.

3D 인쇄는 3D 개체가 만들어집니다 레이어 레이어 잉크⁹의 컴퓨터 제어 증 착을 통해 첨가제 제조 기술,입니다. 전통적인 기술을 통해 3D 인쇄의 장점은 디자인 자유, 제어 매크로 마이크로 크기, 복잡 한 아키텍처, 사용자 지정 및 재현성의 제조를 포함 한다.  또한, CNFs 및 CNCs의 3D 인쇄 제공 나노 입자의 전단 유도 정렬 방향, 그라데이션 다공성 선호와 3D bioprinting^10,,1112, 를 쉽게 확장할 수 있습니다. ^{13 , 14 , 15}. 최근, 3D 인쇄 하는 동안 정렬 되었습니다 CNCs의 역학 보고^16,17. 3D 인쇄 된 조직 및 장기 선택과 살아있는 세포 및 성장 인자 농도 캐리어 잉크, 인쇄 압력 및 노즐 직경^{18의 구성 등 관련된 과제에도 불구 하 고 bioprinting의 분야에서 발전 활성화는 ,,1920}.

다공성 및 압축 강도 연골 재생 장비의 그것의 효율성과 성능을 결정 하는 중요 한 속성이 있습니다. 기 공 크기 접착, 차별화, 그리고 영양분과 신진 대사 폐기물²¹의 교환에 관해서는 뿐만 아니라 세포의 확산에 대 한 중요 한 역할을 한다. 그러나 이상적인 값으로 간주 될 수 있는 더 확실 한 기 공 크기, 일부 연구 보여 높은 bioactivity 작은 숨 구멍을가지고 다른 보여 더 큰 숨 구멍을가지고 더 나은 연골 재생 하는 동안. Macropores (< 500 µ m) micropores (150-250 µ m) 셀 첨부 및 더 나은 기계적 성질^22,23을 용이 하 게 하는 동안 조직 강화, 영양 공급 및 폐기물 제거를 용이 하 게. 이식된 비 계 처리의 시간에서 충분 한 기계적 무결성 있어야 이식 및 원하는 목적 완료 될 때까지. 자연 관절 연골에 대 한 집계 압축 계수 0.1-2의 범위에서 이기 위하여 보고 되 나이, 성별 및 테스트 위치^{4,,2425,26,27에 따라 MPa ,,2829}.

우리의 이전 작품¹¹, 3D 인쇄는 강화 CNCs 나트륨 alginate과 젤라틴의 매트릭스에 포함 된 하이드로 겔 잉크에서 이중 가교 된 폴리머 네트워크 (IPN) 큐브처럼의 다공성 bioscaffolds 조작 하 사용 되었다. 3D 인쇄 통로 균일 하 고 그라데이션 기 공 구조 (80-2,125 µ m) 나노 인쇄 방향으로 (방향 61-76%의 정도) 선호 방향 3D 건설 기계를 달성 하기 위해 최적화 되었다. 여기, 우리 존재의 연속 작업과 3D의 기계적 성질에 다공성의 효과 시뮬레이션된 신체 조건 건설 기계 히드로 인쇄 하는 방법을 보여 줍니다. 여기, 사용 CNCs cytocompatible 및 비-독성 (즉, 세포 성장 보육의 15 일 후에 확인 된³⁰) 우리가 이전 알려졌다. 또한, 건설 기계 동결 사용 하 여 동일한 CNCs 나트륨 alginate와 젤라틴 보여주 높은 다공성, 인산 염 버퍼 염 분 및 중간 엽 줄기 세포⁵으로 cytocompatibility의 높은 통풍 관을 통해 준비. 이 작품의 목표는 하이드로 겔 잉크 처리, 다공성 장비의 3D 인쇄 및 압축 테스트입니다. 처리 경로의 회로도 그림 1에 표시 됩니다.

프로토콜

1입니다. 전조의 준비

1. 셀 루 로스 나노 서 스 펜 션의 준비
   참고: 셀 룰 로스 나노의 절연 매튜, 보고 절차에 따라 이루어집니다 외³⁰.
   1. 희석 17 wt %의 현 탁 액 2 wt %를 추가 하 여 셀 루 로스 나노 2 L. 믹스 철저 하 게 효율적인 혼합 울트라 쥡니다 및 사용 작은 일괄 처리 (250-300 mL)를 사용 하 여 전체 볼륨을 증류수.
   2. 500-600 바의 압력에는 균질 화기를 통해 sonified 서 스 펜 션 10 번을 전달 합니다. 이 시점에서, 2 wt % 셀 루 로스 나노의 두꺼운 투명 한 젤이 얻어진 다.
   3. 2 wt % 셀 루 로스 나노 젤 24500 x g 1.5 헤 Decant 물 밖으로 모든 30 분 사이에 centrifugations 통해 11 wt %에 집중 한다.
      참고: 실험 수 수 일시 중지 여기.
2. 매트릭스 단계 준비
   1. 연속 교에서 60 ° C에서 증류수에 6 wt % 나트륨 alginate (SA)의 균질 솔루션을 준비 합니다.
   2. 연속 교에서 60 ° C에서 증류수에 12 wt % 젤라틴 (젤)의 균질 솔루션을 준비 합니다.
      참고: 매트릭스 솔루션 20 mL의 볼륨을 준비 하 고 냉장고에 보관.
3. Crosslinkers의 준비
   1. 연속 교에서 상 온에서 증류수에 3 wt % 칼슘 염화의 솔루션을 준비 합니다.
   2. 연속 교에서 상 온에서 증류수에 3 wt %도 솔루션을 준비 합니다.
      참고: 가교 솔루션 50 mL의 볼륨을 준비 하 고 실내 온도에 저장. 공급 업체 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 실험 여기 일시 중지 될 수 있습니다.

2입니다. 하이드로 겔 잉크의 준비

1. 11 wt %CNC, 혼합 하 여 폴리스 티 렌 용기에 하이드로 겔 잉크의 40 mL를 준비 6 wt %SA 고 12 wt % 젤을 젖은 (wt %) 물의 CNC/SA/젤/구성: 6.87/1.50/1.50/90.12.
2. 부드러운 붙여넣기를 얻을 때까지 주걱으로 40 ° C와 혼합 혼합물이 열.
3. 60 mL 주사기로 혼합물을 전송 합니다. 기계 클램프의 도움으로 또 다른 60 mL 주사기로 서로 다른 직경을 가진 노즐의 시리즈를 통해 혼합물을 전달 합니다. 하이드로 겔 잉크의 필 라 멘 트를 원활 하 게 밀어낸된 얻을 때까지 프로세스를 반복 합니다. 큰 직경 600 µ m 및 400 µ m 800 µ m의 노즐으로 시작 합니다.
4. 부드럽게 원심 분리기 (4000 x g) 하이드로 겔 잉크를 제거 하는 주사기 가득 갇혀 있는 공기.
   참고: 실험 수 수 일시 중지 여기.

3입니다. 하이드로 겔의 유 변 학적 특성의 측정

올해로: 부드러운 콘에 판 기하학을 사용 하 여 유 변 학적 특성을 수행 CP25-2-SN7617, 직경 25 mm, 2 ° 공칭 각도 간격 높이 25 ° c.에 0.05 m m

1. 고분자, 공기 압축기 및 온도 제어 상자를 켭니다. 소프트웨어를 초기화 합니다.
2. 고분자에 측정 도구를 탑재 하 고 0-간격을 설정 합니다.
3. 약 1 mL의 고분자 플랫폼에 하이드로 겔 잉크를 압출 성형.
4. 전단 속도의 기능으로 점도 측정 합니다. 0.001부터 1000 전단 속도 범위를 선택 합니다.
5. 측정 완료 후 제가 플랫폼을 청소 하 고 측정 하는 도구. 1 mL의 고분자 플랫폼에 다시 신선한 하이드로 겔 잉크를 압출 성형.
6. 스토리지 계수 (G′)와 손실 계수 (G″)을 측정 하는 주파수의 1 Hz. 전단 응력의 함수 10에서 전단 응력 범위 선택 10^{3 7}.
7. 테스트가 완료 되 면 텍스트 파일에 데이터를 복사 하 고 눈금에 유 변 학적 곡선을 플롯.

4. 3D 인쇄 준비 파일

참고: Cura 2.4.0 소프트웨어 설계 3D 건설 기계 (20 m m³) 숨 구멍의 3 개의 종류를 데 사용 됩니다. 0.6 m m, 1.0 m m의 2 유니폼 공과 3-그라데이션 범위 0.5-1의 숨 구멍의 숨 구멍 1-유니폼 m m.

1. Thingsinverse.com에서의 고체 큐브 스테레오 리소 그래피 (stl) 파일을 다운로드 하 고 Cura에서 파일을 엽니다.
2. 로드 된 모델을 클릭 하 고 X/Y/Z 이동: 0/0/0. 클릭 규모, 균일 스케일링 에 대 한 확인란의 선택을 취소 하 고 X/Y/z 치수를 설정: 20/20/20 m m. 클릭 회전 큐브 XY 평면에서 45 ° 회전.
3. 노즐 및 소재, 측면 패널에 0.4 m m을 선택 하 고 프로 파일을 붙여 넣습니다. 프린터와 완전 한 Discov3ry 를 선택 합니다.
4. 측면 패널에서 인쇄 설정에 대 한 사용자 지정 을 선택 합니다. 품질 섹션에서 모든 하위 섹션에 대 한 0.2 m m을 입력 합니다. 쉘 섹션에서 모든 하위 섹션에 0 mm를 입력 합니다. 자료 섹션에서 26 ° C 온도 대 한 입력, 1 mm 직경 및 100% 흐름. 속도 섹션에서 인쇄 속도 여행속도 120 m m/s로 30 m m/s를 입력 합니다. 지원 섹션에서 활성화 지원에 대 한 상자를 선택 취소 합니다. 플레이트 접착 빌드 섹션에서 치마를 선택, 치마/테두리 최소길이로 스커트 거리 와 150 m m 3 m m를 입력 합니다.
5. 균일 한 기 공 크기와 함께 건설 기계에 대 한 0.6 1mm Infill 선 거리 를 입력 하 고 그리드 Infill 패턴을 선택 합니다.
6. 그라데이션 다공성 건설 기계에 대 한 병합 및 그룹화 도구 사용 됩니다. 로드 된 모델을 클릭 마우스 오른쪽, 여러 모델을 선택, 2를 입력 하 고 확인을 누릅니다. X/Y/Z로 각 모델 규모: 20/20/7 m m. 서로 모델을 놓습니다. 각각 하단, 중간 및 상위 모델, 0.3, 0.5, 0.7 m m Infill 선 거리 를 입력 합니다. 세 모델 (Ctrl + A)를 선택, 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 그룹 모델을 클릭 합니다.
7. 확실히 디지털 (SD) 카드에 모델을 저장 합니다. Cura 자동으로 프린터에서 읽은 gcode로 파일을 저장 합니다.

5입니다. 3 차원 다공성 건설 기계를 인쇄

1. 노즐 홀더 전송 튜브를 삽입 하 고 그것을 400 µ m 노즐 연결. 빌드 판과 노즐 사이의 정확한 거리를 빌드 접시 수준.
2. Centrifuged 주사기 카트리지 로드 하 고 전송 튜브의 다른 쪽을 연결.
3. 프린터에 SD 카드를 삽입 하 고 빨리 제거 선택한 하이드로 겔 잉크는 노즐에서 돌출 시작 될 때까지 제거 시작. 균질 흐름을 얻기 위해 2-3 분 제거 계속 합니다.
4. SD 카드에서 균일 하 고 그라데이션 다공성 건설 기계에 대 한 저장 된 파일을 선택 하 고 인쇄를 시작 합니다. 압출 속도 대 한 감시를 계속. 필요한 경우, 그에 따라 속도 흐름 속도 조정 합니다. 더 작은 숨 구멍 크기에 대 한 낮은 유량 (50 mm/s 및 70%)과 결합 하는 빠른 속도 사용 합니다.
   참고: 3D 인쇄 된 건설 기계를 만지지 마십시오.

6. 3D의 가교 건설 기계 인쇄

1. 3D 인쇄를 완료 한 후 부드럽게 방울 3 wt % CaCl₂ 의 발판에 완전히 젖은 때까지. 5 분 기다립니다.
2. 매우 신중 하 게 프린터에서 50 mL 컨테이너 3 wt % CaCl₂가득 발판 전송. 밤새 놔 둬.
3. 증류수와 철저 하 게 세척 하 고 50 mL 컨테이너 3 wt % 글으로 가득 하는 비 계를 전송. 밤새 놔 둬.
4. 철저 하 게 세척 하 고 증류수에 3D 인쇄 비를 저장.

7. 압축 시험

참고: 37 ° c.에 물에 100 N 부하 셀 압축 테스트 수행

1. 물 2 리터와 잠수정 압축 베이스 플레이트를 갖춘 컨테이너를 37 ° c.를 도달 하는 난방 시스템 시작
2. 블루힐 범용 소프트웨어를 초기화 하 고 테스트 메서드를 설정 합니다. 직사각형 견본 형상을 선택 하 고 각 샘플을 테스트 하기 전에 치수를 입력 하는 옵션을 선택 하십시오.  90 N 힘 함께 80% 압축 변형으로 2 mm/min 및 결과의 끝에 변형 속도 설정 합니다.
3. 측정 섹션에서 힘, 변위, 응력 및 압축 긴장을 선택 합니다. 미래의 계획에 대 한 텍스트 파일로 데이터를 내보내는 옵션을 선택 합니다.
4. 크로스 플레이트 받침판에 최대한 가까이 낮은 조그 컨트롤을 사용 하 여 확장 영점을 설정 합니다.
5. 측정 하 고 테스트 샘플의 크기를 참고.
6. 물 온도 37 ° c에 도달 하면, 베이스 플레이트에 샘플을 놓습니다.  샘플을 터치를 시작 하도록 크로스 플레이트를 이동 하 여 샘플 보안.
7. 샘플 사이와 접시 들에 몰입 하는 물 목욕, 이동 물.
8. 샘플 이름 및 크기를 입력 합니다. 테스트를 시작 합니다.
9. 테스트가 완료 되 면 먼저 물 목욕 이동한 다음 크로스 플레이트를 인상 합니다.
10. 두 접시를 청소 하 고 새로운 샘플을 로드 하는 경우 샘플와 그것의 조각을 제거 합니다.
11. 모든 샘플 테스트 후 원시 데이터를 내보냅니다. 압축 변형 률 곡선 및 응력을 플롯 하 고 1-5% 및 25-30%의 변형 값에서 압축 탄젠트 계수를 결정 합니다.
    참고: 큰 구멍 편지지 받침판을 직면 하는 방식에 그라데이션 큐브를 놓습니다.
    먼저 그립 사이 비 계를 장악 하 고 시작/중지 측정.

결과

CNCs 기반 나노 하이드로 겔 잉크 강한 비 뉴턴 전단 숱이 동작 (그림 2를) 보여 줍니다. 1.55 × 10⁵ Pa.s 낮은 전단 속도 (0.001 s^-1)의 명백한 점도 5 비교 22.60 Pa.s 50 s^-1 ≈50의^-1 일반적인 전단 속도 3D 인쇄 중 경험된 되 고 전단 속도에서 값에 의해 상품³¹ . 저장 모듈러스 G로 점 탄성 고체 행동을 전시 하는 하이드로 겔 ?...

토론

3D 인쇄는 하이드로 겔 잉크의 적합 한 유 변 학적 특성을 요구 한다. 고 점도 잉크는 저 점도 잉크 압출 후 그 모양을 유지 하지 하는 동안 그것의 압출에 대 한 극단적인 압력 필요 합니다. 하이드로 겔 잉크의 점도 재료의 집중을 통해 제어할 수 있습니다. 우리의 이전 작품¹¹에 비교 하 여 하이드로 겔 잉크의 고체 콘텐츠 집중된 하이드로 겔 잉크 인쇄 비의 해상도 개선 하는 데 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mL syringe	Structur3D Printing
Alginic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	9005-38-3
Anhydrous calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Clamps, three pronged, Talon	VWR	241-0404	102 mm, Dual adjustment clamp, large, clamp extension 127 mm
Cura 2.4.0	Ultimaker		Free slicing software
Discov3ry Complete	Structur3D Printing		Ultimaker 2+ 3D printer integrated with Discov3ry paste extruder
Gelatin from bovine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Glutaraldehyde solution 50 wt. % in H2O	Sigma-Aldrich	111-30-8
homogenizer	SPX	APV-2000
Instron 5960	Instron		Instron 5960, Biopuls Bath, 100 N load cell, 37 °C,
Physica MCR 301 rheometer	Anton Paar		CP25-2-SN7617, gap height 0.05 mm, 25 °C
Sorvall Lynx 6000 centrifuge	AB Ninolab	s/n 41881692	F12-rotor (6x500 ml)
stainless steel nozzle	Structur3D Printing		800, 600 and 400 µm
thingsinverse	MakerBot's		sharing and downloading 3D printable things in form of stl files
ultra sonication	Qsonica, LLC	Q500
Unbarked wood chips	Norway spruce(Picea abies)		dry matter content of 50–55%