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요약

우리는 마우스 간에서 담관 밀도의 정확한 정량화를 위한 다소 간단하고 민감한 방법을 제시합니다. 이 방법은 유전 및 환경 수정자의 효과와 담즙 질환의 마우스 모델에서 잠재적 인 치료의 효과를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.

초록

마우스는 담즙 질병을 연구하는 모형 유기체로 광범위하게 이용됩니다. 담즙 계통의 발달 그리고 기능을 평가하기 위하여는, 특정 마커를 위한 혈청 화학, 조직학 분석 및 면역 얼룩을 포함하여 각종 기술이 이용됩니다. 이 기술은 담즙 시스템에 관하여 중요한 정보를 제공할 수 있더라도, 그(것)들은 수시로 전체 간을 통해 담관 (BD) 발달 결함의 전체 그림을 제시하지 않습니다. 이것은 부분적으로 담 즙 개발에 상당한 장애를 가진 동물에서 담 즙을 배출 하는 마우스 간의 강력한 능력 때문. 여기에서 우리는 돌연변이/형질전환 마우스의 모든 로브를 포함하는 단면도에 있는 각 문맥 (PV)와 관련되었던 BDs의 평균 수를 계산하는 간단한 방법을 제시합니다. 이 방법에서는, 간은 각종 유전형 및 실험 조건 사이 비교를 용이하게 하기 위하여 입체적인 방식으로 거치되고 단면화됩니다. BDs는 세포각증 염색 담관옥시의 가벼운 현미경 검사를 통해 확인된 다음 간 절편에 존재하는 총 PV 수로 계산및 분할됩니다. 예를 들어, 우리는이 방법이 명확하게 야생 형 마우스와 Alagille 증후군의 마우스 모델을 구별 할 수있는 방법을 보여줍니다. 여기에 제시된 방법은 담즙 나무의 3 차원 구조를 시각화하는 기술을 대체 할 수 없습니다. 그러나, BD 발달 및 마우스에 있는 연성 반응 대형의 정도를 정량적으로 평가하는 쉽고 직접적인 방법을 제공합니다.

서문

담즙 나무는 포유류 간에서 중요 한 부분, 창 자에 간 세포에서 담 즙의 통과 허용. 간간 간 담관 (BDs)은 융기양양에 의해 형성되며, 이는 노치 및 TGFβ 신호전달을통해 이중 전위 간폭발과 구별되는 1,2. 성숙한 BD에 담관과 그들의 어셈블리의 적당한 명세서 그리고 투입은 간 간 담즙 나무의 발달을 위해 중요합니다. 간 개발 또는 장기 재생 시 성장, 담 즙 시스템 적절 한 담 즙 배수를 보장 하기 위해 간 따라 개발 해야. 더욱이, 많은 신디로믹 및 비 신드로믹 질환은 간간 BDs3의빈약성을 초래한다. 또한, 다수의 급성 및 만성 간 질환은 담즙 마커를 발현하지만 담즙 세포 또는 형태에서 반드시 발생하지 않는 상당수의 세포의 존재로 정의되는 간에서 소위 연성 반응을 초래합니다. 특허 BDs4. 다중시스템 장애인 알라길증후군(ALGS)에서, 노치 리간드의 하플로인스실핍증1(JAG1)은BD 형성이 불량하고 담즙정체증5,6. 우리의 실험실은 최근에 이전에 생성 된 Jag1 이형 마우스 라인 7이 ALGS 8에서BD 빈곤의 동물 모델임을 입증했습니다. ALGS의 이 마우스 모델에서는 담관옥시트가 여전히 존재합니다. 그러나, 그들은 성숙한 특허 BDs 8에통합을 커밋하지 못합니다. 따라서 BD 빈곤의 모델에서 간을 분석하려면 담관옥시의 명백한 존재 또는 부재 이상이 필요합니다. 성숙한 BDs가 간에서 존재하는 정도를 정확하게 평가하는 것이 중요합니다.

해부학 병리학에서는 BD 빈곤이 존재하는지 여부를 평가하기위한 허용 된 양적 방법이있습니다 9. 예를 들어, 인간 환자에서 ALGS에 대한 연구는 간 생검9,10개당 적어도 10개의 포탈 혈관을 분석하여 BD를 포탈 정맥(PV) 비율로 정량화한다. 혈청 화학과 결합된 특허 BD의 모양 및 전반적인 존재 또는 부재의 분석은 마우스11,12,13에서BD 개발에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있다. 그러나, 마우스는 혈청 빌리루빈 수준 8에 있는 단지 겸손한 증가와BDs의 상당한 수를 분실할 수 있습니다. 따라서, PV당 존재하는 BDs의 수를 평가하는 정량적 방법은 마우스에서 BD 빈곤의 정도를 보다 직접적으로 측정할 수 있다. 최근 보고서에서, 우리는 모든 간 엽에 걸쳐 PV 당 BDs의 수를 정량화하고 Jag1 +/-- 동물8에서PV 비율에 BD에 있는 중요한 감소를 보고했습니다. 분석 과정에서 염증 반응 및 연성 반응의 정도가 현저한 변동에도 불구하고 BD 대 PV 비율은 많은가변성을 나타내지 않는 것으로 나타났습니다 8. 더욱이, BD 대 PV 비율의 정량화는 우리가 Jag1+/-에서 글리코실트랜스퍼라제 유전자 Poglut1의 1개의 사본을제거하는 것이 그들의 BD 빈곤8을 현저하게 향상시킬 수 있다는 것을 입증하는 것을 허용했다. Jag1+/+ 배경에서 혈관 평활근 세포에서 Poglut1의 조건부 손실은 BD 수치의 점진적 인 증가를 초래합니다(20-30%). P7에서 하지만 성인에서 눈에 띄는 된다8. 다시 말하지만, 이 기술은 P7에서도 이러한 동물의 BD 밀도의 증가가 통계적으로 유의하다는 것을 보여줄 수 있었습니다. 참고로, 생후 4개월에 이 유전자형의 증가된 BD 밀도는 수지 주조 분석을 통해서도 검증되었다. 8 다른 ALGS 마우스 모델14,15에서 BD 밀도를 측정한 이러한 관찰 및 기타 보고서는 다양한 돌연변이체의 담즙 결함을 분석하기 위한 전체 전략에 이 방법을 통합하도록 유도했습니다. 및 형질전환 마우스.

여기서, 간 질환의 마우스 모델에서 BD 빈곤의 정도를 검사하는데 사용될 수있는 간단한 기술을 상세히 기술한다(도 1). 이 방법에서, 콜란지오시포르테 마커 시토케라틴(CK) 8 및 CK19(이하 광스펙트럼 CK, wsCK)와 함께 공동 염색하는 것은 마우스 간에서 BD및 통합되지 않은 담관옥을 가시화하는데 사용된다. 알파 평활근 액틴(αSMA)에 대한 항체가 라벨 용기에 염색에 첨가된다. 모든 간 엽을 덮는 단면도에서 BD 대 PV 비율의 체계적인 분석은 각 유전자형에 대해 많은 수의 PV를 분석할 수 있도록 합니다. 우리의 방법은 2D 이미지에서 BD와 PV를 정량화에 의존하기 때문에, 담즙 나무의 3D 구조 또는 작은 담즙 도관의 무결성에 주어진 돌연변이의 효과를 연구하기에 적합하지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 그것은 마우스에 담즙 발달을 평가하기 위하여 조사자가 간단하고 객관적인 전략을 제공합니다.

프로토콜

모든 동물은 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침및 승인된 동물 프로토콜에 따라 베일러 의과 대학의 장벽 동물 시설에 보관되었습니다.

1. 마우스 간 조직의 컬렉션

  1. 간 수확을위한 마우스의 준비
    1. 이소플루란을 사용하여 마우스를 안락사시.
    2. 죽음을 보장하기 위해 마우스의 자궁 경부 탈구를 수행합니다.
    3. 흉곽 아래 약 1인치 의 가로 절개를 합니다.
    4. 간 전체 복부 표면을 노출시면
  2. 마우스 간 수집
    1. 조심스럽게 작은 가위로 간을 복부의 다른 장기로 연결하는 인대를 잘라냅니다.
    2. 일반적인 BD를 통해 잘라 장에서 간을 분리합니다.
    3. 조심스럽게 담낭에 개최하여 간을 제거하고 즉시 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 의해 3 분기에 채워진 50 mL 튜브에 배치합니다.

2. 파라핀에 간 을 고정하고 포함

  1. 고정
    1. 4 °C에서 4% PFA에서 48 시간 동안 간 조직을 고정하십시오.
    2. 4 °C에서 1 시간 동안 70 % EtOH로 조직을 씻으하십시오.
    3. 4 °C에서 각각 1 시간 동안 95 % EtOH로 조직을 두 번 씻으하십시오.
    4. 4 °C에서 각각 1 시간 동안 100 % EtOH로 조직을 두 번 씻으하십시오.
  2. 지우기
    1. 간 조직을 클리어링 제로씻어 (재료 표) 실온에서 각각 30 분 동안 3 회.
      참고: 간은 세 번째 세척 후 단단한 느낌이 있어야합니다.
  3. 파라핀에 포함
    1. 조직 카세트를 파라핀 왁스에 티슈 몰드에 3회, 각각 30분씩 시둡렛합니다. 왁스는 60 °C로 예열해야합니다.
    2. 파라핀 왁스로 조직 몰드를 3분기 높이로 채우고 60°C의 가열 블록을 유지합니다.
    3. 복부 쪽이 위를 향하여 곰팡이에 간을 놓습니다.
    4. 가열 블록에서 금형을 조심스럽게 제거하십시오.
    5. 카세트 의 상단을 금형에 놓고 뜨거운 액체 파라핀으로 위로.
    6. 금형과 블록을 밤새 실온으로 식힙니다.
      참고: 조직 블록은 이제 실온에서 저장할 수 있습니다.

3. 간 조직을 절제

  1. 단면화블록의 준비
    1. 금형에서 블록을 제거하기 전에 5 분 동안 얼음에 금형을 놓습니다.
    2. 블록과 얼음 사이에 실험실 티슈 페이퍼가 있는 얼음 위에 블록을 놓습니다.
    3. 최상의 조직 슬라이스 결과를 위해 절편하지 않을 때는 얼음에 블록을 보관하십시오.
  2. 간 블록 절편
    1. 마이크로 톰을 사용 하 여, 표면을 통해 절편 하 여 시작, 간 등쪽. 단면은 5 μm이어야 합니다.
    2. 해부 현미경 아래 표면 섹션을 확인하여 단면이 전단되거나 접히지 않았는지 확인하십시오.
    3. 카우다테 로브를 포함하는 간 부분을 가져 가라.
      참고: 일부 블록의 경우 동일한 조직 슬라이스에 왼쪽, 내측, 오른쪽 및 카우데이트 로브가 있습니다.
    4. 네 개의 로브가 모두 같은 슬라이드에 없는 블록의 경우 왼쪽, 내측 및 오른쪽 로브가 동일한 슬라이드에 있을 때까지 계속 슬라이스합니다.

4. wsCK 및 αSMA를 위한 면역성화학

  1. 면역히스토화학용 슬라이드 가공
    1. 분석할 유전자형당 하나의 슬라이드를 선택합니다.
    2. 슬라이드를 자일렌, 100% EtOH, 95% EtOH 및 마지막으로 70% EtOH(각 용액에서 3 x 5분)로 15분 동안 세척합니다.
    3. 슬라이드를 탈이온화된 H2O에서 5분 동안 세척합니다.
    4. 항원 회수 용액(Tris-based, 높은 pH)에 슬라이드를 담급니다.
    5. 압력 솥에서 10 psi에서 3 분 동안 압력을 받고 가열하십시오.
    6. 슬라이드를 실온(약 35분)까지 식힙니다.
  2. 조직 단면도를 막는
    1. Pap 펜을 사용하여 슬라이드의 섹션을 간략하게 설명합니다.
    2. 인산염 완충식염수(PBS) + 0.1% 트웬을 적용하여 각각 5분씩 2회, 5분씩 커버합니다.
    3. PBS + 0.3% 트리톤에서 1:50에 일반 염소 세럼(NGS)을 혼합하여 블로킹 버퍼를 만듭니다. 차단 및 1차 항체 적용에 충분한 완충액을 갖기 위해 섹션당 100 μL이 면충분합니다.
    4. 섹션당 차단 용액 100 μL을 적용합니다.
    5. 차단 용액으로 덮인 슬라이드를 4 °C에서 1 시간 동안 인큐베이션합니다.
  3. wsCK 및 αSMA용 염색
    1. 희석 항CK8 및 항-CK19 항체 16(발달연구 하이브리토마 뱅크, TROMA-I 및 TROMA-III, 각각) 1:20 wsCK에 대한 얼룩을 차단하는 완충제. 항αSMA 항체17(물질 표)을 동일한 완충액에서 1:200으로 희석한다.
    2. 각 섹션에 세 가지 항체를 모두 포함하는 희석 된 항체 용액의 100 μL을 적용합니다.
    3. 밤새 4°C에서 항체 용액으로 덮인 슬라이드를 배양한다.
    4. PBS + 0.1 % 트리톤으로 슬라이드를 세 번, 각각 5 분씩 씻으십시오.
    5. 희석 이차 항체 (항-알렉사488 및 항 마우스-Cy5) PBS + 0.3% 트리톤에서 1:200.
    6. 슬라이드에 두 이차 항체를 모두 포함하는 이차 항체 용액의 100 μL을 적용합니다.
    7. 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.
  4. DAPI 핵 염색 및 장착
    1. 슬라이드를 세 번, 각각 5 분 씩 씻으십시오.
    2. 각 섹션에 100 μL의 DAPI(1:3000)를 10분 동안 적용합니다.
    3. 슬라이드에 안티페이드장착 매체(재료 표)를 적용하고 유리 커버슬립을 티슈 섹션 위에 놓습니다. 슬라이드를 밤새 4°C에서 둡니다. 다음날 슬라이드를 밀봉합니다.
    4. 슬라이드를 4°C로 보관하고 장착 후 1주일 이내에 이미지를 저장합니다.

5. BD의 이미징 및 정량화

  1. 화상 진찰 간 절편
    1. 화상 진찰에 전에, 실험실 일원에게서 도움으로 견본의 유전자형에 자신을 장님. 모든 이미징 파일에 는 동물/샘플 번호 외에 유전자형 또는 기타 특정 식별 정보가 없는지 확인합니다.
    2. 형광 현미경을 사용하여 각 섹션의 1 배 줌에서 20 배 의 이미지를 찍고 간을 가로 지르는 모든 PV가 이미지화되었는지 확인하십시오. 왼쪽, 내측, 오른쪽 및 카우다테 로브를 포함합니다.
      참고: 우리는 일반적으로 찾아60-90 간 크기에 따라 동물 당 포털 기관.
    3. PV를 ID화하려면 αSMA와 wsCK 염색을 찾습니다. αSMA 양성이지만 wsCK 염색이 부족한 구조는 포털 구조가 아닙니다.
  2. BD의 식별 및 계수
    1. 동물/샘플 번호, 이미지 번호, TV 수 및 BD 수와 같은 열로 스프레드시트를 만듭니다.
    2. 각 이미지를 통해 이미지당 PV 수를 식별하고 기록합니다.
    3. 정의 가능한 루멘을 둘러싼 담관옥시(wsCK+)의 존재에 의해 각 이미지의 특허 BD를 식별합니다. 구조는 다른 wsCK + 세포에서 중간 엽에 의해 구별되고 분리되어야합니다.
    4. 각 특허 BD를 계산하고 이미지 번호와 동일한 열에 배치합니다.
    5. PV를 촬영한 각 이미지에 대해 이 작업을 수행합니다.
    6. 간 샘플의 모든 PV 와 모든 BD의 합계를 계산합니다.
    7. 간 샘플에 대한 BD 대 PV 비율을 계산합니다.

결과

우리는 이전에 Jag1 +/-동물, ALGS8의마우스 모델에서 담즙 결함을 문서화했습니다. BD 대 PV 비율을 결정하기 위해, 우리는 P30 마우스 간을 절제하고 혈관 마커 αSMA와 함께 CK8 및 CK19 (wsCK)를 위해 그들을 공동 염색했습니다. 그런 다음 각 간 엽의 모든 PV를 이미지화했습니다. 그림 2A에나타난 바와 같이, 우리는 인접한 wsCK 염색 (화...

토론

마우스에서 BD 발달 및 수리의 분석은 담대성 무질서의 병인 그리고 기계장치를 공부에 있는 중요한 공구입니다. 또한, 새로운 치료법의 개발은 부분적으로 재현가능하고 바람직하게는 정량화 가능한 표현형을 확립하는 데 의존한다. 마우스 모형에 있는 현재 표현형은 일반적으로 세포 모형 특정 마커를 위한 혈청 화학, 간 신체 학 및 면역 염색을 관련시킵니다. 이러한 기술은 담즙 시스템의 구?...

공개

저자는 이해상충이 없습니다.

감사의 말

저자는 국립 보건원 (NIH)의 지원을 인정 (R01 GM084135 및 R01 DK109982), NIH P30 DK56338에서 텍사스 의료 센터 소화기 질환 센터에서 파일럿 / 타당성 상, 그리고 알라질 증후군 가속기 상에서 의료 재단.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Isothesia (Isoflurane)Henry Schein11695-6776-2
DesiccatorBel-Art16-800-552
10% PFAElectron Microscopy Sciences15712
50 mL tubeThermoScientific339653
70% EthanolDecon Laboratories2401
95% EthanolDecon Laboratories2801
100% EthanolDecon Laboratories2701
HistoChoiceVWR Life SciencesH103-4Lclearing agent
Omnisette Tissue CassetteFisher HealthCare15-197-710E
MacrosetteSimportM512
Paraplast X-TRAMcCormick Scientific39503002Parrafin
Tissue MoldFisher Scientific62528-32
MicrotomeMicromHM 325
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
XyleneFisher ScientificC8H10
Tris-Based Antigen RetrievalVector LaboratoriesH-3301
Pressure CookerInstant PotLux Mini
Mini Pap PenLife Technologies8877
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)J.T. BakerX251-07
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100)J.T. BakerX198-07
Normal Goat SerumJackson Immunoresearch005-000-121
anti-CK8Developmental Studies Hybridoma BankTROMA-IAntibody Registry ID AB531826
anti-CK19Developmental Studies Hybridoma BankTROMA-IIIAntibody Registry ID AB2133570
anti-αSMASigma AldrichA2547, Clone 1A4
anti-rat-Alexa488ThermoFisherA21208
anti-mouse-Cy5Jackson Immunoresearch715-175-151
DAPIVector LaboratoriesH-1000
22 x 50 mm2 micro cover glassVWR Life Sciences48393 059
Fluorescence MicroscopeLeicaDMI6000 B
KimwipesKimtech Science05511
VECTASHIELDVector LaboratoriesH-1000Antifade Mounting Medium

참고문헌

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