규제 RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위를 식별하기 위한 서열 공간 탐색

요약

서열 특이성은 유전자 조절에 매우 중요합니다. 특정 서열을 인식하는 조절 단백질은 유전자 조절에 중요합니다. 이러한 단백질에 대한 기능적 결합 부위를 정의하는 것은 어려운 생물학적 문제입니다. RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위의 식별을 위한 반복적 접근법은 여기에 기재되어 있으며 모든 RNA 결합 단백질에 적용가능하다.

초록

유전자 조절은 모든 세포에서 중요한 역할을 합니다. 전사, 전사 후 (또는 RNA 처리), 번역 및 번역 후 단계는 특정 유전자를 조절하는 데 사용됩니다. 서열 특이적 핵산 결합 단백질은 공간적 또는 시간적 유전자 발현을 조절하기 위해 특정 서열을 표적으로 한다. 핵산의 결합 부위는 전형적으로 돌연변이 분석을 특징으로 한다. 그러나, 관심있는 수많은 단백질은 그러한 특성화에 대한 알려진 결합 부위가 없다. 여기에서 우리는 RNA 결합 단백질을 위한 이전에 알려지지 않은 결합 사이트를 확인하기 위하여 접근을 기술합니다. 그것은 무작위 시퀀스 풀로 시작하는 시퀀스의 반복적 선택 및 증폭을 포함한다. 이러한 단계-전사, 결합 및 증폭의 여러 라운드에 이어 농축된 서열은 바람직한 결합 부위를 식별하기 위해 서열화된다. 이 접근법의 성공은 시험관 내 결합 성 결합 방법을 사용하여 모니터링됩니다. 이어서, 생체외 및 생체내 기능성 시험은 선택된 서열의 생물학적 관련성을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이 접근법은 단백질 결합 및 언바운드 RNA를 분리하는 분석이 존재하는 임의의 RNA 결합 단백질에 대해 이전에 알려지지 않은 결합 부위의 식별 및 특성화를 허용한다.

서문

세포 생물학에서, 유전자 조절은 중앙 역할을 합니다. 유전자 발현 경로를 따라 하나 또는 여러 단계에서, 유전자는 조절될 가능성이 있다. 이러한 단계에는 전사(개시, 신장 및 종결)뿐만 아니라 접합, 폴리아데닐화 또는 3' 말단 형성, RNA 수출, mRNA 번역 및 1차 전사체의 붕괴/국소화가 포함됩니다. 이 단계에서, 핵산 결합 단백질은 유전자 조절을 조절한다. 이러한 단백질에 대한 결합 부위의 식별은 유전자 조절을 연구하는 중요한 측면이다. 돌연변이 분석 및 계통유전학 적 서열 비교는 프로모터, 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 요소 및 번역 신호와 같은 핵산에서 조절 서열 또는 단백질 결합 부위를 발견하기 위해 사용되어 왔다^{1. 2개 , 3개 , 4}.

사전 mRNA 접합은 유전자 발현 및 조절 동안 필수적인 단계이다. 포유류 유전자의 대다수는, 인간에 있는 사람들을 포함하여, 인트론이 있습니다. 이 전사체의 큰 분획은 대안적으로 접합되고, 동일한 유전자 또는 1차 전사체로부터 다중 mRNA 및 단백질 이소폼을 생성한다. 이 이소양식에는 세포 생물학에 있는 세포 특정 그리고 발달 역할이 있습니다. 5' 스플라이스 사이트, 분기점 및 폴리피리미딘-요로/3' 접합 사이트는 규제대상인 중요한 접합 신호입니다. 부정적인 규제에서, 그렇지 않으면 강한 스플라이스 사이트는 억압되는 반면, 긍정적 인 규제에서 그렇지 않으면 약한 스플라이스 사이트가 활성화됩니다. 이러한 이벤트의 조합은 기능적으로 구별되는 등소폼의 과다를 생성합니다. RNA 결합 단백질은 이 대체 접합 사건에서 중요한 역할을 합니다.

수많은 단백질은 그의 결합 부위 또는 RNA 표적이^5,6으로식별되는 것으로 알려져 있다. 그들의 다운스트림 생물학 표적 또는 서열에 규정한 단백질을 연결하는 것은 수시로 복잡한 프로세스입니다. 이러한 단백질의 경우, 그들의 표적 RNA 또는 결합 부위의 식별은 그들의 생물학적 기능을 정의하는 데 중요한 단계이다. 결합 부위가 확인되면 표준 분자 및 생화학 분석을 사용하여 더욱 특성화 될 수 있습니다.

여기에 설명된 접근 방식에는 두 가지 장점이 있습니다. 먼저, 관심 있는 단백질에 대해 이전에 알려지지 않은 결합 부위를 식별할 수 있다. 둘째, 이 접근법의 추가적인 장점은 동시에 채도 돌연변이 발생을 허용한다는 것입니다. 따라서 RNA에서 단백질 결합 부위를 식별하는 더 빠르고, 쉽고, 비용이 적게 드는 도구를 제공합니다. 원래, 이러한 접근법(SelEX 또는 EXponential 농축에 의한 리간드의 체계적인 진화)은 자체 mRNA에서 리보솜 결합 부위와 겹치는 박테리오파지 T4 DNA 폴리머라제(gene 43 단백질)에 대한 결합 부위를 특성화하는 데 사용되었다. 바인딩 사이트에는 분석^7에대한 65,536 개의 무작위 변형을 나타내는 8 base 루프 시퀀스가 포함되어 있습니다. 둘째, 상기 접근법은 또한 상이한 염료에 대한 특정 결합 부위 또는 압타머가 약 10¹³ 서열 8의 풀로부터 선택될 수 있음을 보여주기 위해 독립적으로 사용되었다. 실제로, 이러한 접근법은 단백질, 소분자 및 세포와 같은 수많은 리간드를 결합하기 위한 aptamers(RNA 또는 DNA 서열)를 식별하고, 촉매^9를위해 많은 상이한 문맥에서 광범위하게 사용되어 왔다. 일례로, 압타머는 카페인^10에서하나의 메틸 그룹의 존재에 의해 다른 두 크산틴 유도체, 카페인 및 테오필린 을 구별 할 수 있습니다. 우리는 RNA 결합 단백질이 접합 또는 접합 조절^11에서어떻게 작동하는지 연구하기 위해이 접근법 (SELEX 또는 반복 선택 증폭)을 광범위하게 사용했으며, 이는 아래 논의의 기초가 될 것입니다.

무작위 라이브러리: 우리는 31개의 뉴클레오티드의 무작위 라이브러리를 사용했습니다. 랜덤 라이브러리에 대한 길이 고려는 일반적인 접합 계수 U2AF^65가 분기 점 서열과 3' 스플라이스 사이트 사이의 서열에 결합한다는 생각에 느슨하게 기초했다. 평균적으로, 메타조안에서 이러한 접합 신호 사이의 간격은 20~40개의 뉴클레오티드 의 범위에 있다. 또 다른 단백질성-치사성은 표적 프리-mRNA, 변압기의3' 스플라이스 부위 근처의 불쌍한 특징조절 서열에 결합하는 것으로 알려졌다. 따라서, 우리는 시험관 내 전사에 대한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 PCR 증폭 및 부착을 허용하도록 제한 효소 부위를 가진 프라이머 결합 부위에 의해 측면에 있는 31개의 뉴클레오티드의 무작위 영역을 선택했다. 이론적 라이브러리 크기 또는 복잡성은 4³¹ 또는 약 10^18이었다. 우리는 아래에 설명된 실험을 위해 무작위 RNA 풀(~10 12-10^15)을준비하기 위해 이 라이브러리의 작은 부분을 사용했습니다.

프로토콜

참고: 그림 1은 SELEX(반복 선택 증폭) 프로세스의 주요 단계에 대한 요약을 제공합니다.

1. 랜덤 라이브러리 템플릿 생성

1. 전방 프라이머 5'- GTAATACGActATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA-3'와 역프라이머 5'- GCGACGGATCCAAGCTTCA-3'를 DNA 신디사이저에 화학 합성하여 합성합니다.
   참고: 프라이머와 랜덤 라이브러리는 상업적으로 합성할 수 있습니다.
2. 임의 라이브러리 올리고뉴클레오티드 템플릿 5'- GGTGATCAGATTCTGATCCA (N₁... N31)TGAAGCTTGGATCCCGC-3'화학 합성에 의해. N으로 위에 표시된 31개의 무작위 위치들을 합성하는 동안 4개의 인산염의 등구 혼합물을 사용한다.
   참고: 라이브러리 템플릿의 서열에는 31개의 무작위 뉴클레오티드(N1 to N31) 및 전진 및 역방향 프라이머의 결합을 위한 측면 서열이 포함되어 있다. 순방향 프라이머는 체외 전사에 대한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열(밑줄이 그어진 것)과 복제를 위한 제한 부위 Bcl1(기울임꼴화)을 포함한다. 역프라이머는 복제를 용이하게 하기 위해 제한 효소 부위 인 BamH1 및 HindIII(기울임꼴화)를 함유하고 있다.

2. DNA 랜덤 라이브러리 풀 생성

1. T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 1 μM DNA 랜덤 라이브러리 템플릿, 각 프라이머의 1 μM, 20 mM Tris (pH 8.0), 1.5 mM MgCl_2,50 mM KCl, 0.1 μg/μl 아세틸화 소 암부 알부민, 2 단위를 포함하는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 라이브러리에 부착하십시오. /c1> 폴리머라제, 및 200 μM 각각의 dNTPs(데옥시아데노신, 데옥시아데노신, 데옥시시티딘, 및 데옥시티딘, 및 데옥시티미딘 트리포스페이트).
2. PCR의 변성, 어닐링 및 연장 단계(1분 동안 94°C, 1분 동안 53°C, 1분 동안 72°C)를 사용하고 1사이클(10분 동안 72°C)을 사용하십시오.

3. 풀 0 RNA의 합성

1. 100 μL 전사 반응을^설정12. 혼합 T7 전사 완충제, 1 μM 랜덤 라이브러리 풀 DNA, 5 mMdiiothreitol (DTT), 2 mMM 구아노신 트리포스페이트 (GTP), 1 mMM 각 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 및 우리딘 트리포스페이트 (UTP), 및 2 단위.
   참고: RNA는 T7 또는 SP6 RNA 폴리머라제의 옵션을 사용하여 시판되는 키트를 사용하여 시험관 내에서 전사될 수 있다.
2. 37°C에서 2시간 동안 미세원심지 튜브에서 상기 반응 혼합물을 배양한다.
3. 겔은 10% 변성 폴리아크릴아미드 겔로 RNA를 정제한다.
4. 전사 반응에서 방사능(α-32 P UTP의 0.5 μL 이하)의 흔적을 포함시킴으로써 메틸렌 블루 또는자가방사선촬영으로 염색함으로써 겔 상에서 의 전사체의 위치를 식별한다.
   1. 젤 슬라이스를 원심분리기 튜브에 넣고 균질화 팁과 같은 작은 조각으로 부수십시오. 단백질화 K(PK) 완충액(100 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 12.5 mM EDTA, 1% 나트륨 도데실 황산염)을 첨가하여 겔 조각을 침지한다. 실온에서 2 시간에서 하룻밤까지 영양가에 튜브를 둡니다.
5. 젤 파편을 제거하고 완충액을 회수하기 위해 실온에서 5 분 동안 고속 미세 원심 분리기 (14,000 rpm 또는 16,873 x g)로 회전하십시오.
6. 페놀 클로로포름의 동일한 부피와 클로로포름으로 한 번 시료를 2회 소용돌이.
7. 위에서 수성 상을 아세테이트 나트륨(3.0M, pH 5.2), tRNA 10 μg 또는 글리코겐 20 μg, 에탄올(-20°C에서 보관)의 10분의 1부적과 혼합합니다. 튜브를 -80 °C에서 1 시간 동안 둡니다.
8. 4°C에서 5-10분 동안 용액을 함유한 튜브를 마이크로원심분리기(14,000rpm 또는 16,873 x g)에서 회전시다. 상급자 조심스럽게 버리십시오. RNA 펠릿을 70% 에탄올로 헹구고 2-5분 동안 돌리십시오. 공기는 RNA 펠릿을 건조.
9. 디에틸 파이로카보네이트(DEPC)로 처리된 50 μL의 물에 RNA 펠릿을 용해시.. 보관을 위해 샘플을 -20°C에 둡니다.
   참고: 현재 통합되지 않은 방사능을 제거하고 RNA 정제를 위한 빠르고 편리한 대안으로 사용되는 시판되는 스핀 컬럼을 사용하여 RNA를 정제합니다.
   주의: 방사능으로부터 보호하기 위해 아크릴 유리 방패, 장갑 및 기타 예방 조치를 사용하십시오.

4. 결합 RNA의 단백질 결합 반응 및 분리

1. 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.09 μg/ μL 소 혈청 알부민, 0.5 단위 / μL RNasin, 0.15 μL rNasin, 0.15μl / tRNA : 10mM Tris-HCl, pH 7.5 이러한 최종 농도에 다음과 같은 성분을 추가하여 100 μL의 부피에서 단백질과 RNA의 결합을 수행 , 1 mM EDTA, 및 30 μL의 적절한 재조합 단백질 (PTB) 농도. 적절한 풀에서 RNA를 추가합니다.
   참고: 접합 계수 U2AF^65는 전형적으로 약 1-10 nM의 결합 친화도(평형 해리 상수 또는 K d)를 가진 모델 인트론의 폴리피리미딘-관/3' 스플라이스 사이트에 결합한다. 따라서, 결합의 처음 두 라운드는 U2AF^65에대한 K_d 보다 10배 높은 단백질 농도를 사용; SXL 및 PTB 단백질의 경우, 이 범위의 시작 농도는 우리의 최선의 추측일 뿐이었습니다. 이것은 더 낮은 친화도 서열이 또한 잠재적으로 결합하더라도, 결합할 수 있는 원하는 RNA 종을 보장했습니다. 3라운드 및 4라운드에서(전사, 결합 및 증폭), 단백질 농도를 3배 감소하였다(단계 4.1). 이것은 연속적으로 낮은 친화성 RNA 종을 제거하기 위하여 행해졌습니다.
2. 결합 반응을 포함하는 튜브를 온도 블록(또는 얼음)에 25°C에서 약 30분 동안 놓는다.
3. 다음 단계를 사용하여 선택 증폭의 처음 4 라운드에 대한 언바운드 RNA로부터 결합된 RNA를 분별한다.
   1. 진공 매니폴드에 부착된 니트로셀룰로오스 필터를 통해 실온에서 시료(100 μL)를 여과한다.
      참고: RNA-단백질 복합체는 언바운드 RNA가 아닌 필터에 남아 있습니다.
   2. 멸균 면도날로 보존된 RNA로 필터를 조각으로 잘라냅니다. 원심분리기 튜브에 삽입하십시오. 단백질성 K(PK) 완충제에 침지된 필터 조각으로 최소 3시간(또는 하룻밤)동안 튜브를 부드럽게 텀블링하여 RNA를 회수합니다.
   3. 페놀 클로로포름 (1:1)의 동일한 부피가있는 경우 와르텍스팅하여 RNA 샘플을 채소하시키고 클로로포름을 채취한 다음. 실온에서 5분 동안 고속으로 시료를 원심분리하여 매번 수성 상을 회수합니다.
   4. 아세테이트 나트륨 (0.1 부피 3.0 M, pH 5.2) 및 에탄올 (절대 에탄올 2-3 부피, 200 증거)과 혼합하십시오. 튜브를 -80°C 냉동고에 30분 동안 방치하고, 원심분리기를 10분 동안 고속으로 방치하고, 세척 및 건조 단계(단계 3.8)를 거쳐 DEPC로 처리된 물에 RNA를 용해시킵니다. 이 단계는 위에 설명되어 있습니다(3.6단계 ~ 3.9단계).
4. 단백질 결합 RNA 분획을 마지막 2라운드(라운드 5 및 6; 전사, 결합 및 증폭)에 대한 언바운드 분획으로부터 분리하는 경우다음과 같다. 결합 반응에서 단백질 농도를 감소(단계 4.1) 추가 3-에 의해 추가 선택 압력은 높은 친화성 결합 서열을 풍부하게하고 우선적으로 낮은 친화도 서열을 제거한다.
   1. 상기 RNA:단백질 결합(단계 4.1) 반응을 설정하기 전에 0.5x TBE 완충액(Tris-Borate-EDTA)에서 네이티브 폴리아크릴아미드 겔(5% 및 60:1 아크릴아미드:비스-아크릴아미드 비율)을 미리 시전한다. 전기포어는 15분 동안 250 V를 도포하여 냉장실(4°C)에서 이 겔을 적용하였다.
   2. 상기 RNA:단백질 결합 반응(단계 4.1)을 이 겔의 상이한 웰로 피펫한다.
      참고 : 단백질은 -80 °C에서 저장되고 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl)피페라진-1-에탄설포닉산(HEPES), pH 8.0, 20% 글리세롤, 0.2 mM 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA), 0.05% NP-40, 및 1 mM 디티오트레이톨(DTT). 0.5-1.0 mM 프로테아제 억제제 페닐메탄 설포닐 불소(PMSF)의 첨가는 선택사항입니다. 결합 반응에서, 이 버퍼는 약 6 % 글리세롤을 기여하여 별도의 겔 로딩 버퍼와 혼합 할 필요없이 샘플을 웰에 직접 로딩 할 수 있습니다.
   3. 1~2시간 동안 250V에서 250V에서 겔 전기동동동을 사용하여 언바운드 RNA로부터 결합된 RNA를 분별한다. 이 과정은 겔 이동성 시프트 분석법이라고도 합니다.
      참고: 전기 동거의 지속 시간은 결합에 사용되는 RNA 및 단백질의 특징에 따라 다릅니다.
   4. 엑스레이 필름에 젤을 노출하고 자가 방사선 촬영을 사용하여 결합된 RNA의 위치를 식별합니다. 바운드 RNA로 젤 슬라이스를 잘라 튜브에 삽입합니다.
   5. 분쇄된 겔 슬라이스를 PK 버퍼에 인큐베이션하여 3시간 또는 하룻밤 동안 용출에 사용하였다.
   6. 위에 설명된 3.5단계에서 3.9단계는 반복한다. 간략하게, 용출된 RNA 견본을 페놀 클로로포름으로 격렬하게 먼저 그리고 클로로포름으로 격렬하게 돌격합니다.
   7. 아세테이트 나트륨과 에탄올을 클로로폼 추출 후 수성 상과 혼합합니다. -80°C 냉동고에서 배양한 후, 4°C에서 5-10분 동안 회전하여 RNA 펠릿을 수집하였다. RNA 펠릿을 에탄올로 세척하고 튜브 뚜껑을 열어 두어 공기 건조시. DEPC로 처리된 물에 RNA를 용해시다.
      참고: 분획을 위한 겔 이동성 시프트 분석으로 전환하면 결합을 위해 농축되었을 수 있는 원치 않는 RNA 종, 예를 들어 분획을 위해 초기 라운드에서 사용되는 니트로셀룰로오스 필터(또는 임의의 매트릭스)를 제거할 수 있습니다.

5. 역전사 및 PCR 증폭

1. 20 μL 반응(2 μL 의 10x RT 버퍼, 2 μL의 AMV 역전사, 1 μM 역 프라이머, 1μL의 RNA, RNase 억제제 선택사항)을 60분 동안 42°C에서 배양하여 역전사 및 역프라이머를 사용하여 용해된 RNA로부터 cDNA를 합성한다.
2. 2.1단계에서 설명한 대로 20-25PCR 사이클을 사용하여 cDNA를 증폭시다.

6. 전사 및 단백질 결합

1. 상기 3-5항에 기재된 바와 같이 RNA 합성, 단백질 결합, 단백질 결합 및 언바운드 분획의 분리 과정을 반복한다.

7. RNA 단백질 상호 작용의 분석

1. 겔 이동성 시프트 분석(단계 4.4) 또는 필터 결합 분석(단계 4.3)을 사용하여 각 풀 내에서 선택된 풀 또는 개별 서열에 대한 결합 친화성 및 특이성을 결정합니다(단계 8.3 참조).
2. 자가 방사선 또는 인광 이미저를 사용하여 바인딩 된 분수 및 언바운드 분수에서 밴드를 감지하고 정량화하십시오.

8. 복제 및 시퀀싱

1. 제한 효소 Bcl1 및 HindIII를 1-2 시간 동안 제한 효소로 최종 PCR DNA 제품을 소화하고, 적절하게 소화 된 pGEM3 또는 제한 부위를 2 시간에서 하룻밤까지 운반하는 다른 플라스미드로 리게이트, 결찰 생성제를 유능한 박테리아 세포로 변환 표준 분자 생물학 절차를 사용하여 열 충격 또는 전기 증시에 의해^13.
2. 37°C에서 루리아-베르타니(LB) 배지 및 암피실린(50 μg/mL)으로 한천 플레이트에 형질전환된 세포를 도금하여 밤새 박테리아를 성장시킨다. 암피실린으로 LB 액체 배지를 포함하는 배양 튜브를 접종하고 밤새 흔들리는 인큐베이터에서 37 °C에서 성장하는 콜로니를 선택합니다. 표준 플라스미드 절연 프로토콜(13)을 사용하여 DNA 삽입물을함유하는 플라스미드 DNA를 정제한다.
   참고 : 상용 키트는 플라스미드 정화에 사용할 수 있습니다.
3. 디데옥시 사슬 종단 시퀀싱 프로토콜을 사용하여 DNA 삽입물로 플라스미드를 시퀀싱하고, 시퀀싱에 대한 제조업체의 지시에 따라^14.
   참고 : 시퀀싱은 집에서 수행하거나 상업적으로 수행 할 수 있습니다.

9. 시퀀스 정렬

1. 사용 가능한 온라인 정렬 도구를 사용하여 시퀀스를 정렬하고 합의 바인딩 사이트를 가져옵니다.
   (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/)을 참조하십시오.

결과

다음 관찰은 성공적인 선택 증폭(SELEX)을 보여줍니다. 먼저, 반복적 선택 증폭 접근법에 사용되는 단백질에 결합하기 위한 풀 0 및 선택된 서열을 분석했다. 도 2는 포유류 폴리피리미딘-관제 단백질(PTB)이 선택된 서열 풀에 대해 풀 0 서열에 거의 검출 가능한 결합을 나타내지만 높은 친화성을 나타낸다. 선택된 풀에 사용되는 것보다 결합을 위해 약 30...

토론

핵산 결합 단백질은 동물 및 식물 개발의 중요한 조절자입니다. SELEX 절차에 대한 주요 요구 사항은 단백질 결합 및 언바운드 RNA 분획을 분리하는 데 사용할 수 있는 분석법의 개발입니다. 원칙적으로, 이러한 분석법은 재조합 단백질, 정제 단백질, 또는 단백질 복합체에 대한 필터 결합 분석, 겔 이동성 이동 분석, 또는 매트릭스 결합 분석기(19)와 같은 시험관내 결합 분석기일 수...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gel Electrophoresis equipment	Standard	Standard
Glass Plates	Standard	Standard
Nitrocellulose	Millipore	HAWP
Nitrocellulose	Schleicher & Schuell	PROTRAN
polyacrylamide gel solutions	Standard	Standard
Proteinase K	NEB	P8107S
Recombinant PTB	Laboratory Preparation	Not applicable
Reverse Transcriptase	NEB	M0277S
Vacuum manifold	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold	Millipore	XX2702552	1225 Sampling Vacuum Manifold
X-ray films	Standard	Standard