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요약

여기에서, 우리는 측방 geniculate 핵을 포함하는 급성 두뇌 조각의 준비를 위한 프로토콜 및 망막 생성 성 및 코르티코겐iculate 시냅스 기능의 전기 생리학적 조사를 제시합니다. 이 프로토콜은 동일한 급성 뇌 슬라이스에서 높은 방출 및 낮은 방출 확률로 시냅스를 연구하는 효율적인 방법을 제공합니다.

초록

측면 지네아루스 핵은 시각적 정보를 위한 첫 번째 릴레이 스테이션입니다. 이 thalamic 핵의 릴레이 뉴런은 망막 신경절 세포에서 입력을 통합하고 시각적 피질에 투영. 또한, 릴레이 뉴런은 피질에서 하향식 여기를 받습니다. 릴레이 뉴런에 대한 두 가지 주요 흥분제 입력은 여러 측면에서 다릅니다. 각 릴레이 뉴런은 많은 방출 부위가있는 큰 말단인 몇 가지 레티노 제니쿠레이트 시냅스로부터 입력을 받습니다. 이것은 비교적 강한 흥분에 의해 반영되고, 중계 뉴런은 망막 신경절 세포로부터 수신한다. 코르티코제닉시냅스는 대조적으로 방출 부위가 거의 없고 시냅스 강도가 약하여 더 간단합니다. 두 시 냅 스는 또한 그들의 시 냅 스 단기 가소성에서 다릅니다. Retinogeniculate 시 냅 스는 높은 릴리스 확률을 가지고 있으며, 결과적으로 단기 우울증을 표시. 대조적으로, 코르티코제닉시냅스는 낮은 방출 확률을 가지고 있다. 코르티코제네레이트 섬유는 측방 지네큘러 핵에 들어가기 전에 망상 탈라믹 핵을 통과합니다. 망상 탈라믹 핵의 다른 위치 (측면 geniculate 핵에서 rostrally) 및 광학 기관 (측면 geniculate 핵에서 벤트로-측면) 자극 코르 티 코 겐 iculate 또는 망막 시 냅 스를 별도로 허용 세포외 자극 전극. 이것은 측방 geniculate 핵을 동일 세포 모형에 충돌하는 아주 다른 속성을 가진 2개의 흥분성 시냅스가 동시에 공부될 수 있는 이상적인 두뇌 지역, 만드는. 여기서, 우리는 중계 뉴런으로부터의 기록을 조사하고 급성 뇌 슬라이스에서 망막생성 및 코르티코겐시냅스 기능에 대한 상세한 분석을 수행하는 방법을 설명한다. 이 문서는 측면 지네큘러 핵의 급성 뇌 슬라이스의 생성을 위한 단계별 프로토콜과 광학 관 및 코르티코겐섬유 섬유를 별도로 자극하여 릴레이 뉴런으로부터의 활성을 기록하는 단계를 포함합니다.

서문

측면 지네알 핵의 릴레이 뉴런은 시각적 인 피질에 시각적 정보를 통합하고 중계합니다. 이 뉴런은 중계 뉴런에 대한 주요 흥분 성 드라이브를 제공하는 망막 시냅스를 통해 신경절 세포에서 흥분성 입력을받습니다. 또한, 릴레이 뉴런은 코르티코겐시냅스를 통해 피질 뉴런으로부터 흥분성 입력을 받습니다. 더욱이, 릴레이 뉴런은 핵 망상 증액액의 국소 인터뉴런 및 GABAergic 뉴런으로부터 억제 입력을 수신1. 핵 망상 thalami는 시상과 피질 사이의 방패처럼 존재하여 피질에서 시상으로 투영되는 섬유와 반대 방향으로 는 핵 망상 탈라미 2를통과해야합니다.

망막 생성 입력 및 코르티코 제닉 입력은 뚜렷한 시냅스 속성을 표시3,4,5,6,7,8. 망혈구 입력은 여러 릴리스 사이트9,10큰 단자를 형성한다. 대조적으로, 코르티코제닉산성 입력은 단일 방출 사이트7을 가진 작은 단자를 표시합니다. 또한, 레티노제니쿠레이트 시냅스는 릴레이 뉴런에 대한 모든 시냅스의 5-10%만을 구성하고 있음에도 불구하고 릴레이뉴런의 작용 전위를 효율적으로 구동3,8,11. 코르티코제네레이트 시냅스는, 한편, 릴레이 뉴런의 막 전위를 조절함으로써 망막 광세포 전달의 조절제로서12,13.

뉴런을 릴레이하는 이 두 가지 주요 흥분성 입력도 기능적으로 다릅니다. 한 가지 눈에 띄는 차이점은 망막 광석 시냅스의 단기 우울증과 코르티코 겐 이시 냅 스 3,5,8의단기 촉진입니다. 단기 가소성은 시냅스가 몇 밀리초에서 몇 초 까지의 기간 내에 반복적으로 활성화될 때 시냅스 강도가 변하는 현상을 말합니다. 시냅스 방출 확률은 단기 가소성의 근본적인 중요한 요소입니다. 시냅스는 초기 방출 확률이 낮으며, presynapse에서 Ca2+의 축적으로 인한 단기 촉진을 표시하고 결과적으로 반복된 활성에 따라 방출 확률의 증가가 관찰됩니다. 대조적으로, 높은 방출 확률을 가진 시냅스는 일반적으로 준비-releasable 소포의 고갈때문에 단기 불경기를 표시합니다14. 또한, 후성 내피 수용체의 둔감은 일부 고방출 확률 시냅스8,15에서단기 가소성에 기여한다. α-아미노-3-하이드록시-5-메톡사졸프로피온산(AMPA) 수용체의 높은 방출 확률 및 둔감은 망염성 시냅스의 눈에 띄는 단기 우울증에 기여한다. 대조적으로, 낮은 방출 확률은 코르티코겐산 시냅스의 단기 촉진의 기초가 됩니다.

마우스에서, 광관은 척추 측질 부위로부터 등측 지네알 핵(dLGN)으로 진입하는 반면, 코르티코겐 섬유는 dLGN 로스트로벤터리로 들어간다. 두 입력 사이의 거리를 통해 동일한 셀에 충돌하는 두 개의 매우 다른 흥분성 입력의 개별 속성을 조사할 수 있습니다. 여기서, 우리는 망막 광염 및 코르티코겐산 섬유가 급성 뇌 슬라이스3에보존되는 이전에 설명한 해부 방법을 구축하고 개선합니다. 우리는, 그 때, 세포외 자극 전극을 가진 망막 성 질 및 코르티코겐화 섬유의 릴레이 뉴런및 자극의 전기 생리학 조사를 기술합니다. 마지막으로, 우리는 생체 시틴 및 후속 해부학 적 분석으로 릴레이 뉴런을 채우는 프로토콜을 제공합니다.

프로토콜

모든 실험은 라인란트 팔츠의 동물 실험에 대한 정부 감독 패널에 의해 승인되었습니다.

1. 솔루션

  1. 해부 솔루션
    1. 흥분독성을 줄이기 위해, 여기에 제시된 바와 같이 해부 중에 사용되는 콜린 계용액을 준비(mM) : 87 NaCl, 2.5 KCl, 37.5 콜린 염화물, 25 NaHCO3,1.25 NaH2PO4,0.5 CaCl2,7 MgCl2, 및 25 포도당. 실험 1주일 전에 해부를 준비한다.
  2. 레코딩 솔루션
    1. (mM에서) 포함 된 인공 뇌척수액 (ACSF) 용액을 준비하십시오 :125 NaCl, 25 NaHCO 3, 1.25 NaH2PO4, 2.5 KCl, 2 CaCl2,1 MgCl2,및 25 포도당. 각각 50 μM D-APV 및 10 μM SR 95531 하이드로브로마이드를 첨가하여 N-메틸-D-아스파르타(NMDA) 및 GABAA 수용체를 차단합니다.
  3. 세포내 솔루션
    1. (mM에서) 함유된 세포내 용액을 준비한다: 35 Cs-글루코네이트, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 및 0.1 D-600 (메톡시베라파밀 염산염). CsOH를 사용하여 pH를 7.3으로 조정합니다. 사용 전까지 재고 용액을 -20°C에서 필터, 알리쿼트 및 보관합니다.

2. 해부

  1. 두 개의 슬라이스 챔버를 준비하였고, 그 중 하나는 해부 용액의 100 mL로 채워지고 다른 하나는 100 mL의 기록 용액으로 채워져 있습니다. 두 비커를 수조(37°C)에 넣고 해부 되기 전에 적어도 15분 동안 카보겐으로 용액을 거품을 낸다.
  2. 250 mL의 얼음 -차가운 (그러나 동결되지 않음) 해부 용액으로 플라스틱 비커를 채웁니다. 사용 하기 전에 적어도 15 분 카보겐으로 거품.
  3. 차가운 해부 용액으로 뇌 해부가 수행되는 플라스틱 페트리 접시 (100mm x 20mm)를 채웁니다. 여과지 한 조각을 페트리 접시 뚜껑에 넣습니다.
  4. 진동의 해부를 식힙니다.
  5. 예를 들어 마우스 케이지에서 2.5%의 이소플루란으로 마우스를 마취시요. 마우스가 꼬리 핀치에 반응하지 않는 즉시, 자궁 경부 수질 근처에 마우스를 참수하고 페트리 접시의 바닥에 얼음 차가운 해부 솔루션에 머리를 담급니다.
  6. 코에서 코로 머리의 피부를 잘라 두개골을 노출 손가락으로 측면으로 유지. 전뇌를 꺼내려면 먼저 후방 전방 중간선과 함께 두개골을 자른 다음 관상 봉합사와 양두체 봉합사를 통해두 번 더 자른다 (그림 1A).
  7. 관상 봉합사와 람도이드 봉합사 사이의 두개골을 제거하여 뇌가 노출되도록하십시오. 후각 전구를 자르고 미세 한 블레이드로 중뇌에서전뇌를 분리합니다 (그림 1B). 얇은 주걱으로 두개골에서 뇌를 제거하고 페트리 접시의 뚜껑에 여과지에 놓습니다.
    참고: 단계 2.6 및 2.7 세포 죽음을 줄이기 위해 가능한 한 빨리 수행 해야 합니다.
  8. 뇌 슬라이스의 dLGN에 대한 감각 및 피질 입력의 무결성을 보존하기 위해 두 반구를 3-5 ° 각도로 마비 컷으로분리하십시오 (그림1C, D). 두 반구의 절경면을 필터 용지에 놓고 말린 다음 수평 평면에서 10-25°의 각도로 절단 단계에 붙입니다(그림1E).
  9. 금속 완충트레이중앙에 스테이지를 놓고 나머지 얼음 냉해 해액을 완충트레이에 부드럽게 붓습니다. 강한 부어 붙여 넣은 뇌를 제거 할수 있기 때문에신중하게이 단계를 수행 (그림 1F).
  10. 완충트레이를 얼음으로 채워진 트레이에 놓아 해부 하는 동안 저온을 유지하는 데 도움이됩니다. 0.1mm/s의 속도와 1mm의 진폭으로 면도날로 250 μm 슬라이스를 잘라냅니다.
  11. 34°C에서 산소처리용액으로 채워진 홀딩 챔버에 슬라이스를 약 30분 동안 보관한 다음, 34°C에서 34°C에서 다른 30분 동안 조각이 기록 용액에서 회수되도록 합니다.
  12. 회수 후, 수조에서 슬라이스 홀딩 챔버를 제거하고 실험에 사용될 때까지 실온(RT)에서 슬라이스를 유지합니다.

3. 전기 생리학

  1. 보로실리케이트 유리 모세혈관과 필라멘트 풀러를 사용하여 파이펫을 당깁니다. 3-4 MΩ에서 파이펫 기록의 저항을 유지합니다. 동일한 프로토콜을 사용하여 자극 파이펫을 당기고 직경을 높이기 위해 당긴 후 팁을 약간 부수십시오. 셀룰러 내 용액과 바이오시틴으로 기록 파이펫을 채우고 자극하는 파이펫을 녹음 용액으로 채웁니다.
  2. 슬라이스를 녹음 실에 넣고 RT에서 산소 가산 된 녹음 용액으로 조각을 지속적으로 관할하십시오.
  3. 적외선 차동 간섭 콘트라스트(IR-DIC) 비디오 현미경이 장착된 직립 현미경으로 슬라이스와 셀을 시각화합니다.
    참고 : 릴레이 뉴런은 더 큰 소마 크기와 더 많은 기본 모수석 (소마에서 나오는 가지)에 의해 인터 뉴런과 구별됩니다. 인터뉴런은 더 작은 소마를 가진 양극성 형태를 표시합니다.
  4. 자극피펫을 슬라이스에 놓고 기록 피펫으로 셀을 패치합니다. 망막 광석 시냅스를 조사하기 위해, 망막 신경절 세포에서 축사 섬유가 번들로 제공되는 광관에 직접 자극 파이펫을놓습니다 (그림 2A). 코르티코겐 시냅스를 분석하기 위해, dLGN에 인접한 핵 망상 증액에 자극 전극을 놓는다(도2B).
  5. 기록 파이펫이 레코딩 솔루션에 침지되면 5mV 전압 단계를 적용하여 파이펫 저항을 모니터링합니다. 유지 전위를 0mV로 설정하고 유지 전류가 0 pA가 되도록 오프셋 전위를 취소합니다.
  6. 양압을 가하면서 기록 파이펫으로 셀에 접근하십시오. 파이펫이 세포막에 직접 접촉할 때, 양압을 방출하고, 유지 전위를 -70 mV로 설정한다. 세포막이 유리 파이펫에 부착되어 기가옴 씰이 형성되도록 약간의 음압을 가합니다(저항 >1 GΩ). 피펫 정전 용량을 보정하고 음압 펄스를 적용하여 셀을 엽니다.
  7. 시냅스 기능을 조사하려면 자극 피펫을 통해 0.1 ms 전류 펄스 (약 30 μA)를 적용하십시오. 시 냅 스 응답 관찰 하는 경우, 자극 파이펫 교체 해야 할 수 있습니다. 자극 피펫을 다른 위치에 배치할 때 기록된 셀이 손실되지 않도록 주의하십시오.
    참고: 도2에 나타낸 예에서, 시냅스 단기 가소성은 30 ms 간 자극 간격으로 2회 광관또는 코르티코제닉섬유를 두 번 자극함으로써 조사되었다. 페어링-펄스 비(PPR)는 제2 흥분성 후근 전류(EPSC)의 진폭을 제1 EPSC(EPSC 2/EPSC 1)의진폭으로 나누어 계산하였다. 각 자극 프로토콜을 20회 반복하였다. EPSC 진폭은 20스윕의 평균 전류로부터 측정되었습니다. 각 반복 사이의 시간 간격은 반복에 의해 유도된 단기 가소성을 피하기 위해 최소 5s였다.
  8. 5mV 전압 단계를 적용하여 계열 저항을 지속적으로 모니터링합니다. 분석에는 20MΩ보다 작은 계열 저항이 있는 셀만 사용하십시오.

4. 바이오시틴 라벨링

  1. 비석산 모수석내로 바이오시틴이 확산될 수 있도록 적어도 5분 동안 전체 세포 구성을 유지한다.
  2. 기록 후 소마가 파괴되지 않도록 셀에서 피펫을 부드럽게 제거하십시오.
    참고: 한 조각에 하나 이상의 셀이 기록되면 소마는 인접한 세포에서 충분히 멀리 떨어져 있어야 합니다. 다른 세포의 모수석이 이미징 중에 서로 간섭하지 않도록 하십시오.
  3. 24웰 세포 배양 플레이트를 준비한다. 4% 파라포름알데히드(PFA)의 300 μL로 각 우물을 채웁니다. 기록할 슬라이스와 접촉할 PFA로 아무것도 오염시키지 않도록 주의하십시오.
  4. 레코딩 챔버에서 고무 피펫으로 PFA 함유 플레이트로 슬라이스를 옮기고 슬라이스를 밤새 고정합니다. 파이펫이 항상 PFA 오염을 방지해야 합니다.
    주의: PFA를 조작할 때는 항상 장갑을 착용하고 화학 후드를 사용하십시오.
  5. PFA에서 하룻밤 동안 슬라이스를 고정한 후 PFA를 인산염 완충 식염수(PBS)로 교체합니다. 향후 처리를 위해 PBS에 슬라이스를 4°C(2주 미만)로 보관하십시오.
  6. 신선한 PBS로 슬라이스를 3 회 (각 세척 10 분)로 씻으하십시오.
  7. 비특이적 결합 부위를 차단 용액내의 슬라이스(0.2% 비이온 계면활성제 및 PBS에서 5% 소 혈청 알부민)를 궤도 셰이커상에서 RT에서 2시간 동안 배양하여 차단한다.
  8. 차단 솔루션을 폐기합니다. 스트렙타비딘-알렉사 568로 슬라이스를 인큐베이션하여 궤도 셰이커상에서 밤새 4°C에서 차단 용액(1:1,000)으로 희석하였다.
  9. 항체 용액을 버리고 궤도 셰이커에서 RT에서 10 분 동안 PBS로 슬라이스를 3 회 씻으십시오. 장착하기 전에 수돗물로 슬라이스를 씻으하십시오.
  10. 한 마우스에서 슬라이스를 한 개의 유리 슬라이드에 놓습니다. 염색된 세포가 슬라이스의 상단 표면에 있는지 확인합니다. 티슈로 슬라이스 주변의 물을 흡수한 다음 슬라이스를 약 15분 간 건조시도록 둡니다.
  11. 각 슬라이스에 마운팅 매체 2방울을 바치게 합니다. 기포를 생성하지 않고 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다.
  12. 공초점 현미경으로 시각화 한 후 표지 된 조각을 4 °C에서 저장하십시오.

5. 세포 화상 진찰 및 재건

  1. 공초점 현미경으로 슬라이스를 스캔하고 관련 소프트웨어를 사용하여 분석을 합니다.
  2. 561 nm에서 형광을 흥분시킵니다.
  3. 0.7 수치 조리개(NA), 오일 침지 대물렌즈로 슬라이스를 이미지화합니다.
  4. 뷰 중간에 대상 셀을 조정하고 2.5배 배율을 적용합니다.
  5. Z 스택 데이터 세트를 렌더링하여 형식 = 2,550 x 2,550 픽셀, 스캔 빈도 = 400 Hz, z 번호 = 40.Voxel 크기는 약 0.1211 x 0.1211 x 1.8463 μm3입니다.
  6. 뉴런 재구성 소프트웨어(예: NeuronStudio)를 사용하여 뉴런을 반자동으로 추적합니다. 3D 추적 릴레이 뉴런의 예는 도 3B에도시되어 있다.

결과

망막 생성 및 코르티코겐화 경로를 함유하는 dLGN의 슬라이스 제제는 4x 목표 하에도시된다(도 2). 망막 신경절 세포의 축세포는 광학 관에서 함께번들 (그림 2). 자극피펫을 광관에 위치하여 레티노젠산 시냅스 매개 전류(도2A)및 핵 망상 염골에 각각 코르티코겐 화 시냅스 매개 전류를 유도하기 위해 광학 ?...

토론

우리는 이전에 발표된 방법 3에기초하여 개선된 프로토콜을 설명하며, 이는 동일한 슬라이스로부터 의 회망생내가 나는 시냅스를 방출할 확률이 높고 낮은 확률을 조사할 수 있게 한다. 이 두 입력이 시각적 신호 전송을 조절하기 위해 서로 상호 작용하기 때문에 이것은 매우 중요합니다 : 망혈구 입력은 릴레이 뉴런의 주요 흥분성 드라이브인 반면 코르티코탈라믹 입력은 변조?...

공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

이 작품은 독일 연구 재단 (DFG) 공동 연구 센터 내에서 (SFB) 1134 "기능 앙상블"(J.v.E. 및 X.C.) 및 연구 보조금 EN948/1-2 (J.v.E.)에 의해 투자되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Amplifier HEKA ElektronikEPC 10 USB Double patch clamp amplifier
BiocytinSigma-AldrichB4261-250MG
CaCl2EMSURE1.02382.1000
choline chlorideSigma-AldrichC1879-1KG
Confocal Laser Scanning MicroscopeLeica MicrosystemsTCS SP5
CsClEMSURE1.02038.0100
Cs-gluconateSelf-preparedSince there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves 
D-600 Sigma-AldrichM5644-50MGmethoxyverapamil hydrochloride
D-APV Biotrend BN0085-100NMDA-receptor antagonist
Digital camera for microscopeOlympusXM10
EGTASERVA11290.02
ForeneAbbvie2594.00.00isoflurane
GlucoseSigma-Aldrich49159-1KG
HEPESROTH9105.2
High Current Stimulus IsolatorWorld Precision InstrumentsA385
KClEMSURE1.04936.1000
MgCl2EMSURE1.05833.0250
MicromanipulatorsLuigs & NeumannSM7
MiroscopeOlympusBX51
mounting medium ThermoFisher ScientificP36930Prolong Gold Invitrogen
NaClROTH3957.1
NaH2PO4EMSURE1.06346.1000
NaHCO3EMSURE1.06329.1000
PipetteHilgenberg1807502
PullerSutter P-1000
razor blade Personna 60-0138
Semiautomatic VibratomeLeica  BiosystemsVT1200S
SR 95531 hydrobromide Biotrend AOB5680-10GABAA-receptor antagonist 

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